王川林，劉全明，楊 霞，楊正偉，梅小平，彭 彬

1 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院感染科，四川 南充 637000

2 川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，四川 南充 637000

3 川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)研究所，四川 南充 637000

肝纖維化和終末期肝硬化是嚴重的全球醫(yī)療問題，但肝纖維化發(fā)生機制目前仍未完全闡釋清楚。肝星狀細胞（HSC）活化被認為是肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1-3］。本課題組前期采用體視學(xué)方法結(jié)合電鏡技術(shù)研究了CCl4所致肝纖維化大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的改變，發(fā)現(xiàn)肝纖維化大鼠竇周隙內(nèi)HSC 數(shù)量顯著增加［4］。同時，還在大鼠肝小葉內(nèi)（主要是竇周隙以及肝細胞間）觀察到了大量增生的幼稚細胞。通過查閱文獻，根據(jù)這種幼稚細胞電鏡下的形態(tài)學(xué)特征、位置，判斷這種幼稚細胞可能是肝臟干細胞中的卵圓細胞（hepatic oval cell，HOC）［5-6］。HOC 是一類具有多向分化潛能的肝臟干細胞，研究表明，HOC 也參與了肝纖維化的過程，但是HOC在肝纖維化過程中所起的作用目前尚存爭議。有研究［7］報道，HOC在HSC活化過程中通過合成結(jié)締組織生長因子，促進HSC 的增殖和細胞外基質(zhì)（ECM）的分泌，加重肝纖維化。但也有研究［8］發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)人胚胎干細胞分化為HOC，將其移植入CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠體內(nèi)，能有效減輕肝纖維化。HOC 在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中扮演什么樣的角色，究竟是加重肝纖維化還是改善肝纖維化，值得進一步思考。由于HOC在正常肝臟中數(shù)量極少，僅占正常肝細胞的1%～3%，且HOC 體積很小，光鏡下很難被辨認。另外目前HOC 的表面標(biāo)志物如膽管上皮角蛋白CK7、CK8、CK18、CK19、OV6、c-met、HEA-125 和HepParl 等缺乏特異性，不同亞群及不同發(fā)育階段的HOC所表達的標(biāo)志物也不盡相同，HOC 的分子鑒定研究也存在一定困難［9-10］。因此電鏡研究HOC被認為是最可靠和最有價值的方法。電鏡下HOC 形態(tài)學(xué)特征為胞體近似圓形或卵圓形，胞核大，胞漿相對較少，核質(zhì)比高，核仁較明顯，胞質(zhì)內(nèi)細胞器較少，含少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體［5-6］。為明確CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠是否伴有肝小葉內(nèi)HOC 總體積與輪廓數(shù)密度的變化，進一步探討HOC在肝纖維化進程中的作用，本課題組采用體視學(xué)方法結(jié)合透射電鏡技術(shù)測量了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠肝小葉內(nèi)HOC 的總體積與輪廓數(shù)密度，以期為HOC在肝纖維化中的作用提供形態(tài)定量證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 11 只3 月齡健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量160～180 g，購買于川北醫(yī)學(xué)院動物實驗中心，SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機分為2 組：對照組（n=5）、肝纖維化組（n=6）。

1.2 動物模型建立

1.2.1 肝纖維化組模型制備 將橄欖油（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）與CCl4（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）按體積比2∶3 配成40%橄欖油與CCl4混懸液，在大鼠背部皮下注射3 mL/kg的橄欖油與CCl4混懸液，每周注射2次，建立大鼠肝纖維化模型，造模5 周后取材。本研究模型組的6 只大鼠是從15 只建模大鼠中選取的按肝纖維化Metavir 分期標(biāo)準(zhǔn)成功達到Ⅱ～Ⅲ期肝纖維化大鼠。從造模開始的第2、3、4、5 周，分別在15 只模型大鼠中隨機選取1 只取材判斷肝組織的病理變化情況，并在第5 周觀察到肝組織出現(xiàn)了Ⅱ期肝纖維化病理改變，即對剩下的大鼠全部取材，并選取其中6 只達到肝纖維化Ⅱ～Ⅲ期病理改變的大鼠納入實驗組［11］。

1.2.2 對照組模型制備 在大鼠背部皮下注射3 mL/kg的生理鹽水，每周2次，造模5周后取材。

1.3 肝臟密度與體積測量方法 采用電子天平（精度0.1 mg）稱量大鼠肝臟質(zhì)量，并用已知密度的不同濃度的蔗糖或乙醇溶液測量肝臟密度，用大鼠肝臟質(zhì)量除以肝臟密度，即可得到大鼠肝臟體積。

1.4 肝組織處理與切片制備

予以大鼠3%戊巴比妥（50 mg/kg）腹腔注射進行麻醉。隨機剪取一小塊肝組織切成1 mm3放入2.5%戊二醛固定，用于制作電鏡超薄切片。剩余肝組織放入4%的多聚甲醛（成都市科龍化工試劑廠）浸潤固定48 h 后用于制備石蠟包埋切片。

1.4.1 石蠟切片制備 從每只大鼠肝臟按照等距隨機抽樣抽選4個2 mm厚的組織塊行石蠟包埋，每個肝組織塊用半自動石蠟切片機切取2 張14 μm 厚的石蠟切片，按照Masson 三色染色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)公司）說明書上的Masson染色方法染色肝組織切片，以顯示膠原纖維。光鏡下觀察大鼠肝纖維化造模效果。

1.4.2 電鏡超薄切片制備 肝組織塊經(jīng)2.5%戊二醛固定4 h后，從每只大鼠中隨機抽選5個肝組織塊制作電鏡超薄切片，具體方法如下：首先在4 ℃溫度下1% OSO4中固定2 h，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂812（SPICHEM，美國）滲透、包埋。利用超薄切片機（德國LEICA EM UC7）從每個組織塊切取70 nm 厚的連續(xù)超薄切片放置在銅網(wǎng)上。用乙酸雙氧鈾（SPI-CHEM，美國）和檸檬酸鉛（中國成都科龍化學(xué)試劑廠）染色后在透射電子顯微鏡下觀察。

1.5 體視學(xué)分析

1.5.1 計算肝HOC總體積 在透射電子顯微鏡（HT7700）下觀察肝組織超薄切片，發(fā)現(xiàn)放大倍數(shù)為1 200 倍時剛好能對一個圓形銅網(wǎng)內(nèi)的組織結(jié)構(gòu)隨機抽選視野拍照，當(dāng)在放大1 200 倍下分辨不清組織結(jié)構(gòu)時，將放大倍數(shù)放大更高后拍照以準(zhǔn)確地辨認結(jié)構(gòu)，平均每只大鼠約獲得25 張照片。在Adobe Photoshop CS6 軟件里將每張電鏡照片（1 200倍）上隨機疊加7×7個測點，分別計數(shù)落在HOC 上的測點數(shù)以及落在肝組織上的總測點數(shù)。HOC的體積分數(shù)為該大鼠肝臟所有照片落在HOC 的測點數(shù)之和除以該大鼠肝臟所有照片肝組織上的總測點數(shù)之和，將HOC 體積分數(shù)乘以肝臟的總體積，即可得到HOC總體積。

1.5.2 計算肝HOC 的輪廓數(shù)密度 用Photoshop 軟件在已獲得的電鏡照片（×1 200 倍）上，疊加無偏計數(shù)框（圖1），體視框面積為2 354.45 μm2，按照禁線法則抽選并計數(shù)位于計數(shù)框內(nèi)或與計數(shù)線相交，且不與禁線相交的HOC 的數(shù)量。單位面積內(nèi)HOC 輪廓的數(shù)量（輪廓數(shù)密度，NA）為組內(nèi)所有體視框所計數(shù)HOC 的總數(shù)除以每個體視框面積與體視框數(shù)量的乘積。

圖1 體視框計數(shù)肝卵圓細胞數(shù)密度Figure 1 Contour number density of hepatic oval cells counted by stereoscopic frame

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 27.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以表示，兩組間比較采用成組t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下定性觀察CCl4所致肝纖維化大鼠肝組織的主要病理改變 對照組大鼠肝細胞胞質(zhì)內(nèi)偶可見1～3個脂滴，肝組織內(nèi)膠原纖維主要分布在門管區(qū)與竇周隙，中央靜脈周圍可見極少量膠原纖維。與對照組比較，肝纖維化組大鼠肝細胞體積明顯增大，肝細胞出現(xiàn)了大量氣球樣變性、脂肪變性甚至壞死，肝細胞胞質(zhì)內(nèi)脂滴明顯增多。匯管區(qū)膠原纖維大量增生，增生的纖維間隔向鄰近肝小葉延伸，部分大鼠少數(shù)纖維間隔形成，部分大鼠多數(shù)纖維間隔形成，所有大鼠按照肝纖維化分期Metavir 評分標(biāo)準(zhǔn)達到Ⅱ～Ⅲ期。肝組織內(nèi)竇周隙和中央靜脈周圍可見明顯增厚的膠原纖維束，肝血竇變窄（圖2）。

圖2 Masson染色的肝組織結(jié)構(gòu)Figure 2 Histological structure of liver by Masson staining

2.2 電鏡下觀察CCl4所致肝纖維化大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的主要病理改變 在對照組，大鼠肝細胞呈不規(guī)則六邊形，肝竇周隙內(nèi)可見少量膠原纖維，竇周隙內(nèi)偶可見極個別HSC與HOC。HOC的胞體近似圓形或卵圓形，其胞核較大，胞質(zhì)極少，部分HOC整個胞體幾乎為細胞核，胞質(zhì)內(nèi)細胞器較少，主要為線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。與對照組比較，肝纖維化組大鼠肝細胞部分脂肪變，部分細胞器溶解壞死，竇周隙顯著增寬，其內(nèi)膠原纖維明顯增生，血竇腔明顯變窄甚至塌陷。竇周隙內(nèi)HSC 大量增生，HSC 胞體增大，胞質(zhì)內(nèi)脂滴明顯增多。竇周隙內(nèi)與肝細胞間HOC 大量增生，竇周隙內(nèi)增生的HOC 主要位于HSC的附近（圖3、4）。

圖3 電鏡下肝組織超微結(jié)構(gòu)Figure 3 Ultrastructure of liver tissue under electron microscope

圖4 電鏡下HOC超微結(jié)構(gòu)（×7 000）Figure 4 Ultrastructure of hepatic oval cell under electron microscope（×7 000）

2.3 體視學(xué)形態(tài)定量研究結(jié)果 與對照組比較，肝纖維化組大鼠肝小葉內(nèi)HOC 總體積顯著增加了8.53 倍，其輪廓數(shù)密度顯著增加了9.08倍（P＜0.05）（表1）。

表1 各組大鼠肝小葉內(nèi)肝HOC總體積與輪廓數(shù)密度（每mm2細胞數(shù)量）變化Table 1 Changes in total volume（mm3）and contour number density（number of cells per mm2）of hepatic oval cells in hepatic lobules of rats in each group

3 討論

HOC 是肝臟中一種多潛能干細胞，在肝組織受到嚴重或慢性損傷時，能分化為肝細胞和膽管上皮細胞，修復(fù)組織損傷［12］。肝纖維化是一種以ECM過度積聚的創(chuàng)傷修復(fù)反應(yīng)［13-14］。HOC參與了肝纖維化過程，但HOC的激活究竟是加重肝纖維化還是改善纖維化，各學(xué)者的觀點并不一致。目前關(guān)于HOC在肝纖維化中活化增殖的研究主要是采用定性或半定量研究方法，對HOC增殖的定量研究缺乏實驗數(shù)據(jù)。本研究電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，HOC 的胞體近似圓形或卵圓形，其胞核較大，胞質(zhì)極少，部分HOC整個胞體幾乎為細胞核，胞質(zhì)內(nèi)細胞器較少，主要為線粒體與粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。這與Lotowska 等［5］與de Vos［6］等報道的HOC形態(tài)學(xué)特征近似，體視學(xué)定量研究結(jié)果顯示：與對照組比較，肝纖維化組大鼠肝小葉內(nèi)HOC總體積顯著增加了8.53倍，其輪廓數(shù)密度顯著增加了9.08倍。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，單個HOC 細胞的體積并未顯著增加，因此肝小葉內(nèi)HOC 總體積的增加主要與HOC 數(shù)量的增加有關(guān)。該研究結(jié)果從形態(tài)學(xué)定量角度證實了CCl4所致肝纖維化過程中伴隨著大鼠HOC 的大量增生。本研究結(jié)果為HOC 在肝纖維化過程中的增生提供了可靠的形態(tài)學(xué)定量證據(jù)。

HOC在肝纖維化中的作用尚存在爭議，Awan等［15］通過將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化的HOC移植入肝纖維化小鼠中，發(fā)現(xiàn)其能有效減輕肝纖維化。Yang等［16］將TGF-β1處理WB-F344 HOC 12 h后發(fā)現(xiàn)，可通過上調(diào)人纖溶酶原激活抑制劑的表達抑制HSC 活化，從而減輕肝纖維化。也有報道［17］稱，在肝纖維化動物模型和人肝纖維化組織中，HOC數(shù)量與肝纖維化程度呈正相關(guān)。邱德凱等［18］通過對慢性肝病患者肝組織病理分析發(fā)現(xiàn)，HOC 數(shù)量隨著肝纖維化程度的加重而顯著增高。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，肝纖維化組竇周隙內(nèi)膠原纖維大量增生，同時竇周隙內(nèi)增生的膠原周圍伴隨著HSC 與HOC 大量增生。由此推測HOC可能與肝纖維化形成有關(guān)，其原因可能與HOC促進HSC增殖與活化有關(guān)。

本課題組前期研究［4］證實CCl4致肝纖維化大鼠竇周隙中膠原纖維總體積、HSC 的總體積與數(shù)量顯著增加。本實驗中發(fā)現(xiàn)，在肝纖維化大鼠竇周隙內(nèi)HSC 增生的部位周圍伴隨著大量HOC 增生。HSC 活化轉(zhuǎn)變成肌成纖維細胞分泌大量ECM 是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)［19］。研究［20-21］表明，在HSC 激活的過程中，HOC 能夠通過合成IL-6、血小板衍生因子、結(jié)締組織生長因子、血管內(nèi)皮生長因子與TGF-β1 等，促進HSC 的活化與增殖，分泌ECM，加重肝纖維化。HOC 除了能分化為肝細胞和膽管細胞外，還可以分化為HSC 或肌纖維母細胞，直接參與ECM 的沉積。Wang 等［22］用TGF-β1 處理肝纖維化小鼠模型中分離的HOC，能使其表達HSC標(biāo)志物肌間線蛋白和膠質(zhì)纖維酸性蛋白，分化為HSC，并上調(diào)ECM 相關(guān)基因的表達。由此推測，在CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化過程中，CCl4可能通過促進HOC 增殖，激活HSC 分泌大量ECM，從而參與肝纖維化形成。本研究認為HOC的大量增生可能與肝纖維形成有關(guān)。

不同學(xué)者對HOC在肝臟分布的位置有不同的觀點。Faktor 等［23］認為，HOC 來源于Hering 管（又被稱為微膽管或終末膽管）和肝門周小膽管；而Burke 等［24］研究認為，HOC 存在于肝門周區(qū)和肝實質(zhì)內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常大鼠肝組織竇周隙內(nèi)偶可見HOC，在肝纖維化組大鼠，HOC 主要位于充滿膠原纖維的竇周隙內(nèi)與肝細胞間，本研究支持HOC位于肝實質(zhì)即肝小葉內(nèi)的觀點。本課題組前期通過體視學(xué)方法結(jié)合光鏡研究結(jié)果表明，大鼠小葉間（包括匯管區(qū)）占肝臟總體積的比例僅有0.4%（正常組）和2.7%（肝纖維化組）［3］，由此說明，無論是在大鼠正常肝組織還是纖維化肝組織匯管區(qū)占整個肝臟的比例非常低，加之盡管透射電鏡的高放大倍數(shù)能準(zhǔn)確分辨出HOC，但由于其視野很小，本實驗隨機取得的電鏡標(biāo)本制作觀察到匯管區(qū)的概率極低，而體視學(xué)定量研究需要的樣本量較大，因此本實驗未分析匯管區(qū)HOC的增生情況。本實驗的另外一個局限性在于未做新生幼稚細胞的免疫組化染色進一步確定其為HOC。在下一步實驗中本課題組將在光鏡下采用免疫組化標(biāo)記HOC，并對肝小葉間（包括匯管區(qū)）和小葉內(nèi)的HOC 進行定量研究。

肝纖維化的治療仍是醫(yī)學(xué)界難題，本研究結(jié)果顯示肝纖維化過程中HOC 大量增生，隨著對HOC 生物學(xué)特性以及在肝纖維化進展中作用的深入研究，相信在未來針對HOC 的靶向干預(yù)有望成為肝纖維化防治的有效措施。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021 年12 月24 日經(jīng)由川北醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審批，批號：2021119。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：彭彬、楊正偉、梅小平負責(zé)設(shè)計研究方案并提供指導(dǎo)性支持；王川林、劉全明、楊霞負責(zé)數(shù)據(jù)收集、整理與分析；王川林、彭彬負責(zé)論文撰寫與修改。