張晨燕，付甫剛，譚文超，楊藝琳，柳聽義

1.天津師范大學(xué),天津市水資源與水環(huán)境重點實驗室

2.天津師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院

3.中國電建集團貴陽勘測設(shè)計研究院有限公司

在濕法磷酸的工業(yè)制備中，產(chǎn)生大量的固體副產(chǎn)物磷石膏，大部分磷石膏廢渣仍采用堆存方法處理[1]。據(jù)不完全統(tǒng)計，2022 年我國磷石膏產(chǎn)量約7 300 萬t[2]，每年新增堆存量在4 500 萬t 左右[3]。磷石膏隨意堆放，一方面占用了大量土地資源[4]；另一方面，長時間露天堆放，磷石膏中的可溶性磷等物質(zhì)會被淋溶、浸泡出來[5]，導(dǎo)致附近土壤和水環(huán)境遭受污染[6]。因此，解決堆場磷石膏廢渣引發(fā)的環(huán)境問題已迫在眉睫。目前，對于磷石膏中磷的去除，傳統(tǒng)方法主要有水洗凈化、石灰中和、酸浸和煅燒等工藝[7]，但這些方法存在諸多缺陷，如磷利用率低、環(huán)境風(fēng)險大。生物除磷則利用聚磷菌和固磷植物的新陳代謝作用進行更新?lián)Q代，不需要重復(fù)投加，并將磷以磷酸鹽形式儲存于生物體內(nèi)，避免了二次污染。因此，相比傳統(tǒng)方法，生物除磷具有較好的成本效益，且在原位應(yīng)用方面存在較大優(yōu)勢[8]。雖然在高濃度含磷廢水中，單一的微生物除磷效果較差，但結(jié)合其他方法能夠提高磷的去除率。生石灰能夠快速且有效地去除含磷廢液中的磷，其作用機理是形成磷酸鈣沉淀。除了去除工藝，磷石膏本身富含鈣、磷和硫酸鹽等元素[9]，也可以通過添加其他微量元素制成專用復(fù)合肥，發(fā)揮其潛在價值[10]，近年來以磷石膏制成的農(nóng)業(yè)肥料已廣泛應(yīng)用于全球多個地區(qū)[11]。另一方面，在磷石膏堆場上，采取植被覆蓋也是一種可行的修復(fù)方法[12]，該方法有助于避免陳舊磷石膏粉塵造成的空氣污染，也為磷石膏資源化提供了更為便捷的途徑。

綜上所述，筆者利用磷石膏的類土特性，提出了一種植物-微生物聯(lián)合處理磷石膏的新方法。將適量的改性劑生石灰和土壤混合到磷石膏中，進行初步改性以中和其酸度并降低毒性，從而使其具備維持生物存活的適宜特性；通過在磷石膏堆場附近土壤中篩選富集的聚磷菌株與耐酸植物根部的協(xié)同作用，實現(xiàn)固磷效果，從而減弱堆場排放廢水的酸性，最終解決磷石膏堆積區(qū)磷浸出濃度超標的問題。此外，以磷石膏為主體的原位處理效率大大提高，有助于改善傳統(tǒng)處理方法的低效和潛在的環(huán)境風(fēng)險，為磷石膏堆場生態(tài)復(fù)綠提供有效的解決途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

實驗室土壤樣品取自貴陽龍井灣磷石膏渣場，采樣地原生土壤為亞熱帶酸性黃壤，在磷石膏的作用下土壤的理化性質(zhì)及土壤微生物存活條件發(fā)生變化，自然篩選出具有固磷能力的微生物。

試驗所用的菌種為磷石膏堆場土壤樣品中富集篩選的4 種菌，即假單胞菌（Pseudomonassp.）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和伯克霍爾德菌（Burkholderia contaminans）。利用專有的富集培養(yǎng)基，對原始土樣中的細菌進行富集篩選后，采用稀釋涂布法對富集的菌種進行分離純化。然后在純化固體培養(yǎng)基上挑取單菌落加入到液體富磷培養(yǎng)基中，恒溫（30 ℃、120 r/min）培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至菌種生長到對數(shù)期后，各取1 mL 的混合菌懸液加入含蛭石的富集培養(yǎng)基中，使菌種附著于載體上，在相同條件下培養(yǎng)48 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

有機肥采用動物糞便（主要為雞糞和羊糞）與破碎處理的作物秸稈加水混合發(fā)酵，每3 d 翻動松料1 次，15 d 后發(fā)酵完成，保存?zhèn)溆?。有效營養(yǎng)成分：總養(yǎng)分（氮+五氧化二磷+氧化鉀）的質(zhì)量分數(shù)（以烘干基計）為3.4%，有機質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)（以烘干基計）為27.1%，揮發(fā)性有機酸濃度為37.5 cmol/kg。

生石灰購自天津匯之優(yōu)實驗設(shè)備有限公司，有效CaO 質(zhì)量分數(shù)大于80%，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微生物篩選試驗

稱取土樣3 g，過0.3 mm 篩，倒入含100 mL 富集培養(yǎng)基的三角瓶中[13]，在30 ℃、120 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)1～3 d，從渾濁的培養(yǎng)基中吸取8 mL 培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至另一個富集培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)1～3 d，重復(fù)上述操作4 次，轉(zhuǎn)移量分別為4、2、1、0.5 mL，且每次適當(dāng)增加液體培養(yǎng)基中KH2PO4的量[14]，依次為10、15、20、25、30、35 mg。將最終富集的菌懸液稀釋1×102、1×103、1×104倍，在分離培養(yǎng)基中均勻涂布0.1 mL 不同稀釋梯度的菌懸液，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d，對富集的菌種進行多次分離純化，最后鑒定菌種的類型。

對富集的菌株進行除磷試驗，測定菌種對磷石膏中磷的固定效果。配置磷石膏合成廢液培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分：CH3COONa，0.68 g；蛋白胨，0.1 g；NaHCO3，0.01 g；Na2CO3，0.075 g；NaCl，0.05 g；MgSO4，0.075 g；CaCl2，0.025 g[15]；去離子水1 000 mL。培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌鍋在120 ℃下滅菌20 min。分別將質(zhì)量分數(shù)為1%、3%、6%、12%和18%的磷石膏加入滅菌培養(yǎng)基中充分混合，配置成磷石膏合成廢液培養(yǎng)基，最后添加質(zhì)量分數(shù)為3%的單菌液搖勻，30 ℃、120 r/min 條件下反應(yīng)24 h。取上清液過0.45 μm 濾膜后測定總磷濃度，對比分析不同菌株的固磷率，選定具有高效固磷能力的菌種。

1.3 植物篩選試驗

根據(jù)實際工程修復(fù)要求，在幾種渣場生長良好的植物中選擇羊茅屬植物高羊茅為例進行試驗，植物種子前期進行育種試驗，觀察莖葉長勢、根系的發(fā)育情況及生長周期。試驗前將干燥的種子浸泡在蒸餾水中于室溫通風(fēng)條件下水培24 h，播種深度為0.5 cm。

1.4 土柱中磷石膏、土、生石灰和有機肥的質(zhì)量比試驗

將3 份不同部位采集的濕潤磷石膏樣品離心，用注射器抽取磷石膏上清液10 mL，通過pH 計重復(fù)測量3 次，最后得出磷石膏浸出液pH 為1.4～1.6。將經(jīng)過前處理的磷石膏與實地采集的土樣混合，混合質(zhì)量比分別為10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、0∶10，按比例稱取土壤和磷石膏，倒入50 mL 離心管中搖勻，加入去離子水30 mL，恒溫振蕩1 h，3 000 r/min 離心5 min，注射器抽取上清液測pH。最后，確定磷石膏和土壤混合的幾組優(yōu)勢組合后，再加入適量生石灰，在相同條件下振蕩離心后抽取上清液測pH。將其pH 調(diào)至5～7。

在進行滲濾試驗前，先進行試種試驗，設(shè)置磷石膏∶土∶生石灰∶有機肥質(zhì)量比分別為7∶3∶0.1∶0、7∶3∶0.1∶0.2、7∶3∶0.1∶0.4、7∶3∶0.2∶0、7∶3∶0.2∶0.2、7∶3∶0.2∶0.4、8∶2∶0.1∶0、8∶2∶0.1∶0.2、8∶2∶0.1∶0.4、8∶2∶0.2∶0、8∶2∶0.2∶0.2、8∶2∶0.2∶0.4，共12 組。每組均勻種植2 g 高羊茅種子，每24 h 加水20 mL，室溫下觀察高羊茅長勢，根據(jù)高羊茅發(fā)芽率和平均株高選出幾組優(yōu)勢組，確定最終滲濾土柱試驗的混合比例。

1.5 滲濾土柱試驗

磷石膏、土以及生石灰按一定質(zhì)量比稱取混合后，與已經(jīng)配置的有機肥-微生物液體菌劑均勻混合（表1），放入高15 cm 的定制亞克力滲濾土柱裝置中，其中所用菌種均為2 種聚磷菌1∶1 混合菌劑。高羊茅草籽均勻撒在每個滲濾土柱表層約0.5 cm 深處，保持基質(zhì)水分為60%～80%?；旌虾笫状螡菜? 000～2 200 mL，水分緩慢滲透防止?jié)B濾不均勻，之后日澆水量為50～100 mL，滲濾土柱底部設(shè)有滲濾口，用來收集滲濾液，每隔24 h 取樣5～10 mL，過0.45 μm 濾膜后密封保存待測。在試驗過程中，每間隔3 d 收集不經(jīng)過濾的滲濾液和不同深度土樣于離心管中，加入10 mL 蒸餾水振蕩1 h 充分混合，3 000 r/min 離心5 min 后，取上層清液1 mL 稀釋一定倍數(shù)，涂布于聚磷培養(yǎng)基上生長3 d，進行平板計數(shù)，統(tǒng)計試驗過程中的活菌數(shù)。

表1 磷石膏、土、生石灰、有機肥、微生物和草籽的混合質(zhì)量比對照Table 1 Comparison of mixed mass ratio of phosphogypsum,soil,quicklime,organic fertilizer,microorganism and grass seeds

1.6 測定方法

采用HJ 670—2013《水質(zhì) 磷酸鹽和總磷的測定連續(xù)流動-鉬酸銨分光光度法》[16]測定收集的滲濾液中總磷濃度，在AutoAnalyzer 3 連續(xù)流動化學(xué)分析儀上進行分析。

經(jīng)過多次純化的單菌落固體培養(yǎng)基樣品送至北京六合華大基因科技有限公司進行菌種鑒定。使用細菌基因組DNA 提取試劑盒對待測菌株DNA 進行提取并擴增16S rDNA 序列片段[17]。用擴增出的單片段進行測序，在BLAST 數(shù)據(jù)庫中比對分析確定序列來源，選取同源性比對結(jié)果中序列相似度在99%以上的相關(guān)屬種[18]，在MEGA 11 軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，確定細菌屬種。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷石膏、土壤、生石灰和有機肥的質(zhì)量比確定

不同磷石膏與土壤質(zhì)量比的試驗組pH 如表2所示。從表2 可以看出7∶3、6∶4、5∶5 3 組pH 均在3.5 左右，可以初步提高磷石膏的pH，雖然6∶4、5∶5 2 組pH 在適宜范圍，但在保證微生物和植物適宜存活的pH 下，盡可能選擇磷石膏的質(zhì)量比例高的組，來提高磷石膏的利用率，因此選擇7∶3 組作為最優(yōu)配比。8∶2 組pH 為2.7，略低于7∶3 組，但是單次處理的磷石膏量增加了10%，處理效率和成本更低，所以將8∶2 組作為對照組進行下一步試驗。如表3 所示，磷石膏、土壤以及生石灰混合比例為7∶3∶0.1、7∶3∶0.2、8∶2∶0.1、8∶2∶0.2 的試驗組，其pH 較為適宜（5～6）。選擇上述4 種混合比例用作后續(xù)的滲濾土柱試驗。

表2 不同比例磷石膏與土壤混合試驗的pHTable 2 pH of a mixture test with different proportions of phosphogypsum and soil

表3 不同比例磷石膏、土壤和生石灰混合試驗的pHTable 3 pH of a mixture test with different proportions of phosphogypsum,soil and quicklime

2.2 菌種篩選

對磷石膏堆場的土壤富集馴化后，成功篩選出4 種聚磷菌，對基因測序結(jié)果進行NCBI-BLAST 比對，采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹[19]，將No.of Bootstrap Replications 參數(shù)設(shè)置為1 000 次，結(jié)果如圖1～圖4 所示。

圖1 菌種P1 系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain P1

圖2 菌種P2 系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain P2

圖3 菌種P3 系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain P3

圖4 菌種P4 系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain P4

如圖5 所示，菌種P1 固體培養(yǎng)基的單菌落呈半透明態(tài)，表面光滑，圓形濕潤，經(jīng)鑒定是一種好氧聚磷菌——假單胞菌（Pseudomonassp.），屬于革蘭氏陰性桿菌，能夠分解利用有機物作為能量來源。菌種P2 可存活的溫度為4～42 ℃，最適生長溫度為25～30 ℃，其陳舊培養(yǎng)物有腥臭味。通過菌種形態(tài)觀察和系統(tǒng)發(fā)育進化樹，菌種P2 鑒定為惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。

菌種P3 菌落表面粗糙不透明，灰白色或黃色，菌落生長后期在固體培養(yǎng)基中呈干燥褶皺狀。在系統(tǒng)發(fā)育樹中與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)親緣關(guān)系最近。菌種P4 菌落表面光滑，圓形凸起，呈淡黃色，通過系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析屬于伯克霍爾德菌(Burkholderia contaminans)。

將4 種菌株進行除磷試驗后發(fā)現(xiàn)所篩菌種均具有固磷能力，平均固磷率為80%，磷石膏添加量會影響到菌種對磷的固定程度。添加磷石膏質(zhì)量分數(shù)為6%時，除枯草芽孢桿菌外其他菌種的固磷率達到了峰值。其中假單胞菌和惡臭假單胞菌的固磷率可達93.2%和94.3%（圖6）。從整體的固磷率來看，假單胞菌和惡臭假單胞菌的固磷能力優(yōu)于伯克霍爾德菌和枯草芽孢桿菌。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，從城市污水處理廠好氧池的活性污泥中分離出的一株惡臭假單胞菌GM6，其具有厭氧釋磷、好氧吸磷的高效聚磷特性[20]，在合成廢水好氧條件下固磷率高達96.6%，充分證明了惡臭假單胞菌屬具有較強的除磷特性，可作為優(yōu)勢菌種用于磷石膏中磷的固定。

圖6 不同菌種的固磷率對比Fig.6 Comparison of phosphorus fixation rates among different strains

對滲濾土柱試驗中不同時間段的滲濾液及土壤中聚磷菌數(shù)量的統(tǒng)計見表4。本試驗篩選的菌株在混合土壤中存活量最高可達6.4×106cfu/mL，土壤中活菌數(shù)量整體比滲濾液高出2 個數(shù)量級且隨時間呈穩(wěn)定存活狀態(tài)，在試驗前期（0～3 d）、中期（4～9 d）、后期（10～12 d）3 個階段中，每組滲濾液中活菌數(shù)量保持穩(wěn)定或緩慢增長趨勢。對比滲濾液活菌數(shù)發(fā)現(xiàn)，A 組的菌種存活數(shù)量整體高于B 組，說明磷石膏與土比例為7∶3 的組更利于菌種生長，經(jīng)過前期富磷篩選后，聚磷菌對磷石膏的適應(yīng)性較強，能夠在土柱中穩(wěn)定發(fā)揮固磷作用。

表4 土壤和滲濾液中活菌數(shù)量對比Table 4 Comparison of viable bacteria quantity in leachate and soil cfu/mL

2.3 植物篩選

通過育種試驗發(fā)現(xiàn)，高羊茅室溫下發(fā)芽時間為2～3 d，且根系發(fā)達，成活率高（圖7）。通過調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)結(jié)縷草、香根草也具有固磷能力，將高羊茅、結(jié)縷草和香根草種植在相同比例的土柱中觀察三者長勢，高羊茅在土柱中的長勢更好且發(fā)芽率維持在90%以上，更適宜用于磷石膏中磷的去除。有研究表明，高羊茅覆蓋的地下滲濾系統(tǒng)處理含磷廢水過程中，高羊茅植株內(nèi)含有的總磷濃度在4.6～5.9 g/kg，地下滲濾系統(tǒng)中其對磷的去除率可達30%[21]。一些菌類能幫助高羊茅有效利用土壤中難溶態(tài)磷（如Ca-P、A1-P）或礦化有機磷[22]，從而促進植物對難溶態(tài)磷的吸收和利用，如叢枝菌根、內(nèi)生真菌等。內(nèi)生真菌可促進高羊茅對可溶性磷的利用，在水溶性磷條件下菌種對高羊茅地上部生長具有一定貢獻。高羊茅還可作為降解植物與微生物聯(lián)合修復(fù)柴油污染土壤[23]。結(jié)合育種分析，在本試驗中高羊茅生長周期短、適應(yīng)能力強、根系旺盛，可以作為磷超標土壤的修復(fù)植物。

圖7 固磷植物長勢對比Fig.7 Comparison of growth of phosphorus fixation plants

2.4 磷固定化效果

如圖8 所示，隨著生石灰的質(zhì)量比增加，A1F4、A2F4、A3F4 這3 組磷的浸出濃度有較大幅度的下降，說明本試驗中生石灰除了有調(diào)節(jié)pH 的作用外還有較好的固磷效果。當(dāng)生石灰的質(zhì)量比為2%時，A 組磷的浸出濃度均在4 mg/L 以下，達到了GB 18918—2002《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》[24]中的三級標準，與未添加菌液的A3F3 和A3F2 組相比，添加液體菌劑的A3F4 和A3F1 組磷的浸出濃度更低，均在1 mg/L以下，達到了一級A 類標準，且效果更加穩(wěn)定。從A3F4 和A3F1 2 組0～10 d 的數(shù)據(jù)來看，有機肥對微生物-植物的固磷能力影響不大，但從第10 天開始，添加有機肥后的磷浸出濃度更低，說明有機肥提供營養(yǎng)元素，維持微生物-植物長期穩(wěn)定生長、固磷。而從整體上看，種植高羊茅會使磷的浸出濃度略有下降。

圖8 磷石膏與土質(zhì)量比為7∶3 組的磷浸出濃度對比Fig.8 Comparison of phosphorus leaching concentration in phosphogypsum to soil ratio 7∶3 group

從B 組的4 組試驗（圖9）分析得出，土柱中生石灰的質(zhì)量比從0%增加到2%時，磷浸出濃度的降幅可達70 mg/L，由于生石灰能促進可溶磷轉(zhuǎn)化為難溶物質(zhì)，加入改性劑生石灰后，磷石膏中可溶磷得到有效降低，混合土柱的磷浸出濃度隨著生石灰用量的增加而降低[25]。對試驗數(shù)據(jù)進行線性擬合，發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加1%的生石灰時，磷浸出濃度的降幅最大且在后期可以降至10 mg/L 左右，可以作為初步處理方案。未添加微生物菌劑和植物的B3F5 組，磷的浸出濃度會隨著時間推移而上升，說明單純添加生石灰改良磷石膏，在長期處理中效果不好，處理不當(dāng)可能對環(huán)境造成二次污染。

圖9 磷石膏與土質(zhì)量比為8∶2 組的磷浸出濃度對比Fig.9 Comparison of phosphorus leaching concentration in phosphogypsum to soil ratio 8∶2 group

為了更好地分析不同菌種在混合土柱中的作用效果，在混合最優(yōu)比例A3F4 組中，投加4 種不同的菌種配比，分別是P1 與P2 混合（M1）、P2（M2）、P3 與P4 混合（M3）、P1 與P3 混合（M4），磷浸出濃度如圖10 所示。隨著時間的推移，4 組試驗磷的浸出濃度整體呈下降趨勢。M1 的磷浸出濃度低于其他3 組，說明聚磷菌有明顯的攝磷能力。M3 組磷浸出濃度明顯高于其他3 組，原因是在伯克霍爾德菌和枯草芽孢桿菌2 種菌的協(xié)同作用下，土柱中一部分磷的形態(tài)發(fā)生了變化，從難溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶磷浸出。但是在聚磷植物對有效態(tài)磷的吸收利用以及秸稈有機肥吸附的共同作用下，土柱中浸出的磷濃度依然下降到10 mg/L 以下，說明微生物在低濃度磷的去除中起到關(guān)鍵作用。M4 組磷浸出濃度略低于M2 組，該過程聚磷菌會過量吸收解磷菌釋放的磷酸鹽并儲存于體內(nèi)，使得浸出液中磷濃度降低。

圖10 A3F4 組中投加不同菌種后磷浸出濃度對比Fig.10 Comparison of phosphorus leaching concentration in A3F4 group after adding different strains

如圖11 所示，當(dāng)混合配比為磷石膏∶土∶生石灰∶有機肥∶微生物∶草籽質(zhì)量比為8∶2∶0.2∶0.2∶0.03∶0.03的對照條件下B3F4-M1 組投加假單胞菌和惡臭假單胞菌混合菌種磷浸出濃度最低，聚磷效果最好。假單胞菌與伯克霍爾德菌混合的B3F4-M4 組，浸出液磷濃度的下降速度最快。從整體固磷效果看，磷石膏與土壤按7∶3 比例混合時，相比8∶2 的比例，其磷的浸出濃度更低，因此磷石膏∶土壤為7∶3 更加有利于固磷。

圖11 B3F4 組中投加不同菌種后磷浸出濃度對比Fig.11 Comparison of phosphorus leaching concentration in B3F4 group after adding different strains

經(jīng)測定，磷石膏浸出液初始濃度為633.9 mg/L，與土壤、生石灰、微生物、有機肥和高羊茅植物混合后，定期澆灌模擬自然滲透，收集滲濾液測定總磷濃度，一段時間后磷浸出濃度基本穩(wěn)定在3 mg/L以下。其中A 組中最優(yōu)比例A3F4 菌液組磷浸出濃度整體穩(wěn)定在1 mg/L 以下，達到GB 18918—2002《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》中的一級A 類標準，B 組中最優(yōu)組B3F4 的磷浸出濃度整體不超過4 mg/L，達到二級標準，所以A 組的混合比例是處理效果最顯著、長期處理最穩(wěn)定的。但是綜合考慮成本效益，可以考慮B 組的混合比例處理。添加微生物同時種植高羊茅植物后磷浸出濃度低于未添加組，微生物在固磷的同時可以鈍化土壤磷石膏中其他有害重金屬并與植物協(xié)同改善土壤生態(tài)系統(tǒng)，所以微生物和植物協(xié)同處理效果更為明顯并且實現(xiàn)了磷石膏的綠色綜合利用。

2.5 微生物除磷機理分析

通過菌種鑒定試驗發(fā)現(xiàn)，所篩的菌種P1 和P2 都屬于聚磷菌（PAOs）。混合土柱中PAOs 通過與高羊茅根系的相互協(xié)同作用實現(xiàn)高效固磷。如圖12 所示，PAOs交替暴露于富碳厭氧和缺碳好氧土柱條件下，其吸收大量磷并在細胞內(nèi)累積多聚磷酸鹽[26]。PAOs 利用胞內(nèi)多聚磷酸鹽（Poly-P）[27]、糖原（Gly）[28]的水解獲得的能量，吸收介質(zhì)中揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）作為碳源[29]，并將其轉(zhuǎn)化為聚羥基脂肪酸（PHAs）儲存在細胞內(nèi)[30]，同時在多聚磷酸鹽降解過程中少量無機磷酸鹽（Pi）被釋放到細胞外[31]；有氧條件下，PAOs 氧化分解PHAs獲得能量以維持細胞的運轉(zhuǎn)[32]，產(chǎn)生的能量用于ADP 結(jié)合磷酸鹽合成Poly-P 和三磷酸腺苷（ATP）[33]，從而使介質(zhì)中的大部分可溶Pi 被聚磷菌超量攝取儲存[34]。一般來說，細菌體內(nèi)的含磷量僅占細胞干重的2%左右，但聚磷菌在好氧條件下從外部介質(zhì)中吸收過量的磷后，體內(nèi)的磷可能超過10%，甚至高達30%[35]。Poly-P 一般呈顆粒態(tài)溶解于細胞質(zhì)中或與細胞質(zhì)中的RNA 等化合物結(jié)合[36]，在細胞質(zhì)膜、細胞壁或其他細胞器膜中也分布有Poly-P[37]。研究表明，Poly-P 不僅是一種營養(yǎng)儲存成分或可轉(zhuǎn)換的能量源，還維持著細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和滲透調(diào)節(jié)、基因甚至酶活性的調(diào)節(jié)、參與應(yīng)激反應(yīng)[38]以及通過螯合作用對重金屬進行解毒[39]。生物體聚磷現(xiàn)象廣泛存在于細菌、真菌、原生動物、昆蟲、藻類、高等植物甚至哺乳動物中[40]。經(jīng)證實，假單胞菌中有聚磷顆粒，在EBPR 活性污泥中也曾分離到假單胞菌，其具有吸放磷并積累過量磷的能力[41]。無碳預(yù)培養(yǎng)后的假單胞菌在富磷培養(yǎng)基中可產(chǎn)生過量攝磷現(xiàn)象且磷攝入量很快達到峰值，此后逐漸下降，但未出現(xiàn)釋磷過程[42]。VFAs是聚磷菌轉(zhuǎn)化和能量儲存的必要碳源。系統(tǒng)中含有的VFAs 越多，合成的PHAs 越多[43]，厭氧階段細菌釋放磷越徹底，好氧階段合成的聚磷酸鹽越多，整體除磷效果越好[44]。VFAs 是厭氧發(fā)酵的中間產(chǎn)物[45]。試驗中動物糞便和作物秸稈混合發(fā)酵體系可在1～3 d 內(nèi)迅速啟動產(chǎn)酸階段[46]，積累大量VFAs，將富含VFAs 的有機肥投加到土柱中時，假單胞菌以VFAs為底物，在好氧情況下有明顯的除磷作用，其效果與厭氧-好氧培養(yǎng)相似[47]。在足夠的VFAs時，假單胞菌在直接好氧培養(yǎng)中也能有效除磷[48]。微生物在植物去除和吸收某些營養(yǎng)素方面起著主導(dǎo)作用，植物的根分泌物也為微生物創(chuàng)造了適宜的生存環(huán)境[33]。菌根在作物磷營養(yǎng)中起著極其重要的作用。土壤中，尤其是根際土壤中存在大量具有解磷能力的微生物。土壤中的磷可以通過吸附、絡(luò)合、沉淀及同化到微生物和植物生物質(zhì)中而被去除[49]。聚磷假單胞菌能抑制植物病原微生物的生長，改善植物營養(yǎng)，促進植物生長。同時，假單胞菌可以降解土壤中的有毒物質(zhì)，可以開發(fā)為生產(chǎn)植物微生態(tài)制劑的理想菌株[50]。通過育種發(fā)現(xiàn)高羊茅的根系發(fā)達，遍布土柱土壤中，可以在土層深處尋找營養(yǎng)物質(zhì)。根系本身會通過主動運輸吸收一部分磷，也會為假單胞菌提供適宜的微環(huán)境。聚磷菌在固磷的同時，不僅能夠促進植物的吸收利用，還可以幫助分解土壤中的有毒重金屬。固磷菌和高羊茅二者通過協(xié)同作用可發(fā)揮更好的效果。聚磷菌在土柱中的作用是高效而持久的。通過除磷試驗發(fā)現(xiàn)4 種菌中惡臭假單胞菌屬的固磷效果最好，在24 h 內(nèi)可以去除94.3%磷石膏中的磷，在試驗過程中種群數(shù)量穩(wěn)定，有一部分菌種會隨著降水浸出，但是土柱中的菌種數(shù)量比滲濾液高出2 個數(shù)量級，聚磷菌繁殖能力快，不需要重復(fù)投加，在土柱中持續(xù)發(fā)揮作用。在原位應(yīng)用中聚磷菌可以持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮作用。土壤中厭氧與好氧狀態(tài)交替存在，聚磷菌在厭氧狀態(tài)釋放的有效態(tài)磷被富磷植物高羊茅吸收利用，而好氧條件下，聚磷菌發(fā)揮固磷作用超量吸磷，通過植物-微生物協(xié)同作用實現(xiàn)磷的固定，有效改善磷石膏堆場含磷廢水的浸出問題，為磷石膏堆場生態(tài)覆綠提供了有效的解決途徑。

圖12 混合土柱中微生物-植物聚磷機理Fig.12 Mechanism of microbial-plant phosphorus accumulation in mixed soil column

3 結(jié)論

（1）在磷石膏堆場土壤中篩選出4 種聚磷菌，經(jīng)過基因測序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹確定菌種為假單胞菌、惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌和伯克霍爾德菌。土柱試驗中投加的假單胞菌存活量最高可達6.4×106cfu/mL，土柱中活菌數(shù)量整體比滲濾液中高出2 個數(shù)量級且隨時間呈穩(wěn)定存活狀態(tài)。磷石膏與土壤質(zhì)量比為7∶3 的組，菌種存活數(shù)量整體高于8∶2 的組。添加磷石膏質(zhì)量分數(shù)為6%時，假單胞菌和惡臭假單胞菌的固磷率可達93.2%和94.3%。經(jīng)過前期富磷篩選后，聚磷菌對磷石膏混合土壤的適應(yīng)性較好，能有效地固定轉(zhuǎn)化磷石膏中的磷元素。

（2）土柱中添加的生石灰可以調(diào)節(jié)pH 并初步固磷，提高生石灰的質(zhì)量比，滲濾液總磷濃度大幅度下降，有效固定了磷石膏中的高濃度磷。在此基礎(chǔ)上，生物除磷可以根據(jù)實際需要降低總磷濃度。添加液體菌劑和植物后，二者的協(xié)同作用使磷的浸出濃度不超過1 mg/L，達到GB 18918—2002 中的一級A類標準，實現(xiàn)無害化穩(wěn)定固磷。

（3）當(dāng)磷石膏∶土∶生石灰∶有機肥∶微生物∶草籽質(zhì)量比分別為7∶3∶0.2∶0.2∶0.03∶0.03、8∶2∶0.2∶0.2∶0.03∶0.03 時，投加假單胞菌和惡臭假單胞菌混合菌種的2 組磷浸出濃度低于其他對照組，其固磷效果最佳。目前雖不能完全脫離生石灰改性磷石膏的前提，但是生物法聯(lián)用的綠色處理最大程度上減少了生態(tài)危害，長期效果穩(wěn)定，可以作為新的處理方向繼續(xù)探索。