胡 晨 劉玉麗

廣東省惠州市中心人民醫(yī)院 516001

缺血再灌注損傷(Schemia-reperfusion injury,IRI)是造成急性腎損傷(Acute kidney injury,AKI)的常見(jiàn)原因,也是腎臟手術(shù)圍術(shù)期常見(jiàn)并發(fā)癥,嚴(yán)重可出現(xiàn)多系統(tǒng)綜合征,危及患者的生命安全,是亟待解決的臨床問(wèn)題[2]。圍術(shù)期的AKI以IRI為主要表現(xiàn),其機(jī)制與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等誘導(dǎo)的線粒體損傷有關(guān)[2]。右美托咪定(Dexmedetomidine,Dex)是一種高選擇性的α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑,能減小IRI誘發(fā)的線粒體損傷,而線粒體是細(xì)胞器中調(diào)節(jié)功能的重要物質(zhì),也是IR造成的氧化應(yīng)激損傷靶點(diǎn)[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(Silence information regulator 2 homolog,SIRTs)被證實(shí)在細(xì)胞功能的調(diào)控和抗氧化防御中有重要作用,其中SIRT3被證明存在于線粒體中,可介導(dǎo)線粒體蛋白去乙?；鴾p輕線粒體損傷[4]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(Transcription factor A,TFAM)能調(diào)控線粒體DNA的拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性并參與細(xì)胞凋亡[5]。目前關(guān)于Dex能否通過(guò)SIRT3去乙?；疶FAM影響腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的IRI有待于進(jìn)一步研究,故本研究探討其相關(guān)機(jī)制,旨為AKI的機(jī)制研究及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人HK-2細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),鹽酸右美托咪定注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20183219,2ml∶0.2mg),SIRT3抑制劑(3-TYP,大連美侖生物技術(shù)有限公司),RPMI 1640培養(yǎng)基(北京諾為生物技術(shù)有限公司),胰蛋白酶(美國(guó)Biosciences),10%胎牛血清、細(xì)胞用青/鏈霉素(美國(guó)Sigma公司),BCA試劑盒(武漢艾迪康生物科技有限公司)、RIPA蛋白裂解液(北京索寶來(lái)科技有限公司),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、NAD+/NADH檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技),MitoTracker Red CMXRos線粒體紅色熒光探針、質(zhì)粒小提試劑盒(武漢賽默飛世爾科技中國(guó)),線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1,abcam中國(guó)),Protein A/G免疫磁珠(美國(guó)Med Chem Express公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(海聯(lián)邁生物工程有限公司),IL-6、IL-8、IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢生工生物工程有限公司)。兔抗SIRT3、TFAM單克隆抗、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),Tanon凝膠成像系統(tǒng)(北京原平皓生物技術(shù))。

1.2 IRI細(xì)胞模型建立 細(xì)胞復(fù)蘇后培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基,于常規(guī)條件下(5%CO2、37℃)培養(yǎng),細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)培養(yǎng)瓶后,胰酶消化重懸繼續(xù)培養(yǎng)傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,制備2×105個(gè)/孔單細(xì)胞懸液,接種于6孔板中,以無(wú)血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),于37℃、5%CO2、1%O2、94%N2環(huán)境中培養(yǎng),24h后更換正常完全培養(yǎng)基,常規(guī)條件繼續(xù)培養(yǎng)2h復(fù)氧,建立IRI細(xì)胞模型。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將細(xì)胞分為對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、缺血/灌注(I/R)組、Dex組、3-TYP組及Dex+3-TYP組。Dex組、3-TYP組及Dex+3-TYP組在I/R制備前分別給予0.015nmol/L的Dex、50μmol/L 3-TYP孵育2h及0.015nmol/L Dex+50μmol/L 3-TYP共同孵育2h;I/R組及對(duì)照組在建模前加入等量生理鹽水處理,對(duì)照組不予以I/R制備。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HK-2細(xì)胞消化重懸,以2×104/ml接種于96孔板,100μl/孔,按照對(duì)應(yīng)分組處理24h、48h后,更換為CCK-8溶液(10%)濃度,繼續(xù)孵育2h后以酶標(biāo)儀檢測(cè)A450nm的光密度值(OD),OD值越高表示細(xì)胞活性越強(qiáng)。

1.5 炎癥因子檢測(cè) 各組干預(yù)24h后細(xì)胞,收集上清液,以ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6、IL-8、IL-10表達(dá)水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)A450nm的OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞炎癥因子水平。

1.6 線粒體損傷情況檢測(cè) (1)線粒體ROS表達(dá)情況:干預(yù)24h后細(xì)胞以線粒體提取試劑盒提取線粒體,加入NAD+/NADH工作液5μmol/L,37℃孵育10min,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度,以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)差在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。(2)線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential,MMP)測(cè)定:各組細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后重懸,與工作濃度為5μmol/L的JC-1共孵育15min(37℃),在熒光顯微鏡下觀察,以紅色與綠色熒光比值衡量線粒體去極化程度。以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)化,觀察比值。比值越高表明線粒體去極化降低MMP增加,反之則去極化增加,膜電位下降。(3)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)開(kāi)放程度:各組細(xì)胞加入1ml的染色工作液混合均勻,37℃震蕩孵育10min,以mPTP熒光檢測(cè)試劑盒及酶標(biāo)儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)488nm、發(fā)射波長(zhǎng)530nm)的熒光強(qiáng)度,熒光強(qiáng)度下降表明mPTP開(kāi)放,增加表明mPTP被抑制。(4)線粒體DNA(mtDNA)檢測(cè):收集各組干預(yù)24h細(xì)胞,DNA提取試劑盒分離DNA,NAD+/NADH確定mtDNA數(shù)量,以β-actin為內(nèi)參基因,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),引物序列:mtDNA-F:ACCGCTAACGCCTTAAGCATACT,mtDNA-R:CCGATCGGACATGFCACCCGTTA,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件,以?xún)?nèi)參基因與目的基因樣本Ct均值得出mtDNA拷貝數(shù)量變化率。

1.7 Western Blot(WB)檢測(cè)SIRT3表達(dá)及TFAM的去乙酰化 各組細(xì)胞提取蛋白經(jīng)裂解液裂解后,4℃情況下12 000r/min離心5min,留取上層血清,經(jīng)抗賴(lài)氨酸乙?；贵w孵育,蛋白G免疫磁珠沉淀免疫復(fù)合物,洗滌后,95℃加熱變性。經(jīng)BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,SDS-PAGE電泳分離,經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,TBST溶液洗膜后室溫封閉,加入TFAM一抗稀釋液(1∶1 000),4℃孵育過(guò)夜,加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1h,ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)測(cè)定蛋白條帶灰度值。SIRT3檢測(cè),取蛋白經(jīng)裂解液裂解后,取上清,檢測(cè)蛋白濃度,其余方法同TFAM檢測(cè)。

1.8 Co-IP驗(yàn)證SIRT3與TFAM相互作用 對(duì)照組、3-TYP組與Dex細(xì)胞提取的總蛋白按照Protein A/G免疫磁珠進(jìn)行蛋白提純,取30μl磁珠加入SIRT3及IgG一抗,充分混合后室溫孵育1h,清洗富集磁珠,蛋白樣本與磁珠充分混合,4℃孵育過(guò)夜,清洗磁珠,8 000r/min離心30s,自然沉淀2min,棄上清,以20倍磁珠體積的TBS溶液清洗沉積物,棄上清,經(jīng)0.1mmol/L甘氨酸清洗磁珠,棄上清加入上樣緩沖液,水浴變性10min行WB檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活力比較 與對(duì)照組比較,I/R組、Dex組、3-TYP組和Dex+3-TYP組24/48h的OD值均下降(P<0.05);與I/R組比較,Dex組和Dex+3-TYP組24/48h的OD值均升高,3-TYP組則下降(P<0.05);與Dex組比較,3-TYP組和Dex+3-TYP組24/48h的OD值均下降(P<0.05);與3-TYP組比較,Dex+3-TYP組24/48h的OD值均升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞活力比較值)

2.2 細(xì)胞炎癥因子水平比較 與對(duì)照組比較,I/R組、Dex組、3-TYP組和Dex+3-TYP組IL-6、IL-8水平均升高,IL-10水平均下降(P<0.05)。與I/R組比較,Dex組和Dex+3-TYP組IL-6、IL-8水平均下降,3-TYP組IL-6、IL-8則升高;Dex組和Dex+3-TYP組的IL-10水平均升高,3-TYP組IL-10則下降(P<0.05)。與Dex組比較,3-TYP組和Dex+3-TYP組IL-6、IL-8水平均升高,IL-10水平均下降(P<0.05)。與3-TYP組比較,Dex+3-TYP組IL-6、IL-8水平均下降,IL-10水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞炎癥因子水平比較

2.3 線粒損傷指標(biāo)比較 與對(duì)照組比較,I/R組、Dex組、3-TYP組和Dex+3-TYP組ROS水平升高,MMP、mPTP及mtDNA均下降(P<0.05)。與I/R組比較,Dex組和Dex+3-TYP組ROS水平均下降,MMP、mPTP及mtDNA均升高;3-TYP組的ROS水平升高,MMP、mPTP及mtDNA則下降(P<0.05)。與Dex組比較,3-TYP組和Dex+3-TYP組ROS水平均升高,MMP、mPTP及mtDNA均下降(P<0.05)。與3-TYP組比較,Dex+3-TYP組ROS水平下降,MMP、mPTP及mtDNA升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組線粒損傷指標(biāo)比較

2.4 SIRT3表達(dá)及TFAM乙?；奖容^ 與對(duì)照組比較,其余各組SIRT3蛋白表達(dá)水平均降低,TFAM乙?；骄?P<0.05)。與I/R組比較,Dex組與Dex+3-TYP組的SIRT3蛋白表達(dá)水平升高,TFAM乙酰化水平下降;3-TYP組的SIRT3蛋白表達(dá)水平下降,TFAM乙?；缴?P<0.05)。與Dex組比較,3-TYP組與Dex+3-TYP組的SIRT3蛋白表達(dá)水平均下降,TFAM乙酰化水平均升高(P<0.05)。與3-TYP組比較,Dex+3-TYP組的SIRT3蛋白表達(dá)水平升高,TFAM乙?；较陆?P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞SIRT3表達(dá)及TFAM乙酰化水平比較

2.5 SIRT3與TFAM的結(jié)合情況 IP SIRT3蛋白條帶顯示,使用SIRT3進(jìn)行沉淀試驗(yàn),SIRT3與TFAM均被沉淀,證實(shí)SIRT3與TFAM之間存在相互作用。見(jiàn)圖1。

圖1 Co-IP檢測(cè)SIRT3和TFAM的物理相互作用

3 討論

AKI除可在短期內(nèi)造成高死亡率外,還被認(rèn)為是慢性腎臟病發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素,其機(jī)制涉及腎小管、微血管及炎癥的不同信號(hào)通路和分子[6]。線粒體功能障礙在IRI引起的AKI發(fā)生發(fā)展中有關(guān)鍵作用[7]。線粒體是高速動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器,豐富的線粒體能夠產(chǎn)生足夠的腺嘌呤核苷三磷酸維持腎臟生理功能[8],因此減輕腎臟細(xì)胞線粒體功能障礙是IRI及AKI治療的研究熱點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示,干預(yù)后的各組OD值、IL-10水平,線粒體MMP、mPTP及mtDNA較對(duì)照組下降,線粒體ROS水平及IL-6、IL-8水平較對(duì)照組升高,而3-TYP干預(yù)后的變化更為明顯,經(jīng)Dex干預(yù)后的OD值、IL-10水平,線粒體MMP、mPTP及mtDNA則升高,線粒體ROS水平及IL-6、IL-8水平下降,Dex+3-TYP組變化介于I/R組與Dex組之間,說(shuō)明Dex可增加IRI的HK-2細(xì)胞活性,抑制炎癥及氧化應(yīng)激損傷,改善線粒體功能。Dex是臨床常用的鎮(zhèn)靜、止痛類(lèi)藥物,有調(diào)節(jié)免疫、抗感染、抗氧化應(yīng)激及抑制交感神經(jīng)的作用[9]。腎IRI時(shí)發(fā)生劇烈的氧化應(yīng)激損傷,使內(nèi)皮細(xì)胞生成前列腺素E2及一氧化氮,細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性下降,ROS增多,而ROS可促進(jìn)前列腺素、白三烯等物質(zhì)的合成,增加IL-6、IL-8等炎癥介質(zhì)的釋放,抗炎因子IL-10水平降低,加重細(xì)胞損傷[10]。楊昊天等[11]研究發(fā)現(xiàn),Dex具有抗氧化作用,能減輕急性氧化應(yīng)激腎損傷模型大鼠的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平,改善腎損傷,在應(yīng)激綜合征中具有潛在的治療作用。宋云飛等[12]則證實(shí)Dex能減輕APP/PS1小鼠海馬區(qū)炎性因子的分泌,抑制細(xì)胞凋亡。吳華兵[13]研究中亦發(fā)現(xiàn)Dex能抑制缺氧/復(fù)氧條件下心肌細(xì)胞PTEN誘導(dǎo)激酶1/E3泛素連接酶通路介導(dǎo)的線粒體自噬,減輕氧化應(yīng)激損傷。上述研究證實(shí)了Dex在抗氧化應(yīng)激、抗炎及改善線粒體功能方面的作用,與本研究結(jié)果具有同質(zhì)性。

SIRT3是主要的線粒體乙酰轉(zhuǎn)移酶,能調(diào)節(jié)線粒體的穩(wěn)態(tài)、代謝、基因轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激反應(yīng)和基因組的穩(wěn)定性,參與機(jī)體各種生理病理過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),Sirt3缺陷型小鼠的壽命短于野生型,這可能與缺乏Sirt3調(diào)節(jié)的心臟線粒體功能障礙和造血干細(xì)胞中的ROS穩(wěn)態(tài)失調(diào)引起的心力衰竭有關(guān)[14]。Si等[15]則認(rèn)為Dex減輕腎IRI需要Sirt3的激活。TFAM是位于人和小鼠10號(hào)染色體長(zhǎng)臂21區(qū)上的高遷移率蛋白,能與線粒體DNA上的輕鏈啟動(dòng)子和高呼吸活性的細(xì)胞上游識(shí)別位點(diǎn)特異性結(jié)合刺激轉(zhuǎn)錄,調(diào)控mtDNA拷貝數(shù)并影響線粒體功能。TFAM的乙?；筎FAM的基因表達(dá)及蛋白質(zhì)活性被抑制,影響TFAM對(duì)線粒體功能的調(diào)控作用。本研究結(jié)果中,干預(yù)后的各組SIRT3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低,TFAM乙?；捷^對(duì)照組升高,3-TYP干預(yù)后的細(xì)胞變化最明顯,而Dex干預(yù)后SIRT3蛋白表達(dá)水平則有所升高,TFAM乙?；较陆?Dex+3-TYP組變化介于I/R組與Dex組之間,Co-IP檢測(cè)SIRT3和TFAM存在物理相互作用,結(jié)果提示Dex可通過(guò)SIRT3去乙?；瘻p輕HK-2細(xì)胞的IRI。

綜上所述,Dex能減輕HK-2細(xì)胞的IRI,提高細(xì)胞活性,抑制炎癥,改善線粒體功能,其機(jī)制可能與SIRT3去乙?；疶FAM有關(guān)。