唐建萍,劉鐘華

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院, 吉林 長(zhǎng)春 130061)

瘢痕疙瘩(keloid scars,KSs)是一種皮膚纖維增殖性疾病,為皮膚損傷后結(jié)締組織過(guò)度增生所產(chǎn)生的[1]。放射治療是目前公認(rèn)的瘢痕疙瘩最重要的臨床治療方法之一[2]。高能電子線照射時(shí),從體表進(jìn)入體內(nèi)深部后都可以維持均勻的劑量分布,目前,已成為瘢痕疙瘩術(shù)后輔助放療的最佳選擇[3]。單純手術(shù)切除是治療瘢痕疙瘩和增生性疤痕的傳統(tǒng)方法,復(fù)發(fā)概率為45%～100%[4]。放療通常作為瘢痕疙瘩的術(shù)后輔助治療,可將瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)概率控制在15%～23%[2]。然而,其復(fù)發(fā)機(jī)制尚不清楚。成纖維細(xì)胞活化蛋白(fibroblast activation protein alpha,FAP)是一種膜上的絲氨酸蛋白酶(二肽基肽酶Ⅳ),可能在瘢痕疙瘩的侵襲性中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5],對(duì)傷口愈合和腫瘤侵襲過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)的降解極為重要。FAP具有蛋白酶和膠原酶活性,但在正常成人組織中FAP通常呈陰性[6],提示FAP可能是治療瘢痕疙瘩的新靶點(diǎn),但目前關(guān)于FAP與放療后瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)關(guān)系的研究很少,因此有必要建立合適的動(dòng)物模型探索新的治療方法。將人源性組織移植到具有免疫能力的嚙齒動(dòng)物體內(nèi)的主要障礙是其自身強(qiáng)大的異種免疫排斥反應(yīng)[7],通過(guò)破壞對(duì)免疫細(xì)胞的發(fā)育、存活和功能起重要作用的相關(guān)基因,已經(jīng)培育出了幾種免疫缺陷小鼠品系[8]。本研究使用三重免疫缺陷(NCG)小鼠,通過(guò)構(gòu)建人瘢痕疙瘩組織PDX異種移植NCG小鼠模型,研究FAP在瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制,以期為瘢痕的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器

60只8周齡NCG小鼠(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(京)-2019-0009,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司);所有小鼠飼養(yǎng)于22 ℃、12 h光/暗循環(huán)的SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中,自由攝取食物和飲水。本研究經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò),所有動(dòng)物操作均符合試驗(yàn)動(dòng)物使用和保護(hù)條例。人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞由8名瘢痕疙瘩患者手術(shù)切除的組織中提取,本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),所有患者知情同意。

DMEM培養(yǎng)基、1%青-鏈霉素、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffered saline,PBS)(Gibco公司,美國(guó));RNA提取試劑盒(Amresco公司,美國(guó));反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR) 試劑盒和PCR引物(上海翊圣生物科技有限公司);4%多聚甲醛組織固定液(上海尚寶生物科技有限公司);免疫組化一抗FAP、CD31抗體(Affinity公司,美國(guó));二抗Kit-9706和過(guò)氧化物酶試劑盒(邁欣科技有限公司);碘化丙啶PI染色液和曲拉通X-100(Triton X-100)(北京博奧拓達(dá)科技有限公司);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);21EX直線加速器放療設(shè)備(Clinac 21ex,Varian醫(yī)療系統(tǒng),瓦里安公司,美國(guó));低溫離心機(jī)(5424R)(Eppendorf公司,德國(guó)),基因擴(kuò)增儀(ETC811)(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司);熒光定量PCR儀(Rotor-Gene Q)(孚約生物科技(上海)有限公司);流式細(xì)胞儀(BD FACS Canto II)(BD公司,美國(guó));多功能酶標(biāo)儀(SPARK)(TECAN公司,瑞士)。

1.2 組織來(lái)源、制備、異種移植及電子線照射

將瘢痕組織用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2次,并在無(wú)菌條件下切成邊長(zhǎng)為3 mm的正方體組織塊。將60只8周齡NCG小鼠以0.1 mL/10 g體質(zhì)量、5%水合氯醛腹腔注射麻醉,在臀大肌上方背中線兩側(cè)做1 cm切口,將瘢痕組織塊植入皮下,最后縫合創(chuàng)口。將兩側(cè)皮下移植物分為兩組,左側(cè)為未照射組,右側(cè)為照射組。照射組的組織塊植入小鼠體內(nèi)1周后,對(duì)移植小鼠右側(cè)移植物應(yīng)用6 MeV進(jìn)行電子線照射,劑量率為600 cGy/min,劑量為10 Gy,非目標(biāo)區(qū)域用2 cm的鉛板屏蔽。

1.3 原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及電子線照射

將瘢痕組織用磷酸鹽緩沖鹽水洗滌2次,在無(wú)菌條件下切成邊長(zhǎng)為3 mm的正方體組織塊。將組織塊間隔1 cm放入培養(yǎng)皿中,加入含有10%FBS和1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約1周可見(jiàn)原代成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣爬出,當(dāng)原代成纖維細(xì)胞達(dá)到90%的融合度時(shí)進(jìn)行胰酶消化并傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3代時(shí)開(kāi)始細(xì)胞試驗(yàn)。將細(xì)胞分為未照射組和照射組,照射組細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)應(yīng)用6 MeV電子線照射,劑量率為600 cGy/min,劑量為10 Gy,非目標(biāo)區(qū)域用2 cm的鉛板屏蔽。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中mRNA水平

收集未照射組和照射組細(xì)胞,用RNA提取試劑盒提取兩組細(xì)胞總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行mRNA定量分析。引物序列:FAP上游引物5′ GGAAGTGCCTGTTCCAGCAATG-3′,下游引物5′- TGTCTGCCAGTCTTCCCTGAAG-3′ ;Vimentin上游引物5′-AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA-3′,下游引物5′-ATCTGGCGTTCCAGGGACTCAT-3′ ;Beta-actin上游引物5′-ATTGCCGACAGGATGCAGAAG-3′,下游引物5′-CCATGCCAATCTCATCTTGT-3′ 。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠移植物內(nèi)FAP和CD31的表達(dá)

收集兩組小鼠移植物組織,用4%多聚甲醛固定20 min,石蠟包埋,切片至4 μm厚度,將組織切片進(jìn)行抗原修復(fù);應(yīng)用一抗FAP(1∶200) 和CD31(1∶200)孵育,然后應(yīng)用二抗Kit-9706(1∶1 000)孵育,并使用過(guò)氧化物酶試劑盒檢測(cè)免疫反應(yīng)性;應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析。

1.6 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖

應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8評(píng)估細(xì)胞增殖。將成纖維細(xì)胞(3×103細(xì)胞/孔)接種到96孔板中,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);加入CCK-8溶液2 h,在450 nm處測(cè)定吸光度(A)值。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

在未照射組和照射組的成纖維細(xì)胞達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行胰蛋白酶化。將細(xì)胞用PBS清洗2次,在-20 ℃、70%乙醇中固定12 h,用300 μL PI(終濃度為50 mg/L)和0.1% Triton X-100在37 ℃下放置15 min;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期不同階段的細(xì)胞分布。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 建立人源瘢痕疙瘩組織異種移植NCG小鼠模型

將瘢痕手術(shù)后的組織切成邊長(zhǎng)為3～4 mm的正方形組織塊,并在無(wú)菌條件下將切好的組織塊植入NCG小鼠雙側(cè)背部皮下并縫合(見(jiàn)圖1 a)。在本研究中,移植20周后,能夠觀察到明顯的組織體積減小,但移植物仍然可見(jiàn);移植3周后建立了穩(wěn)定的新生血管(見(jiàn)圖1 b)。移植4周后,用單次10 Gy的電子線照射移植小鼠的右側(cè)移植物(見(jiàn)圖1 c)。結(jié)果顯示,本研究成功構(gòu)建了人源瘢痕疙瘩異種移植小鼠模型。

圖1 人源瘢痕疙瘩組織移植NCG小鼠及其照射方式Fig.1 Human keloid tissue transplantation of NCG mice and its radiotherapy

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)兩組小鼠移植物和熒光定量PCR檢測(cè)兩組細(xì)胞CD31和FAP表達(dá)

通過(guò)免疫組化檢測(cè)未照射組和照射組照射4周后小鼠移植物中CD31和FAP表達(dá)情況,結(jié)果顯示,照射組移植物較未照射組的CD31表達(dá)量明顯減少,而FAP的表達(dá)量明顯升高(P<0.001)。見(jiàn)圖2 a。在體外實(shí)驗(yàn)中,熒光定量PCR結(jié)果顯示,照射組的成纖維細(xì)胞FAP(P<0.001)和Vimentin(P<0.01)的表達(dá)量在第4周明顯高于未輻照組(見(jiàn)圖2 b)。以上結(jié)果提示電子線照射可以誘導(dǎo)激活瘢痕組織中的成纖維細(xì)胞,上調(diào)FAP表達(dá)水平,促進(jìn)瘢痕組織復(fù)發(fā)。

圖2 組織及細(xì)胞中相關(guān)指標(biāo)表達(dá)變化Fig.2 Expression of indicated molecule in tissues and cells

2.3 CCK-8檢測(cè)兩組原代成纖維細(xì)胞增殖能力

本研究結(jié)果顯示,輻照后的瘢痕組織原代成纖維細(xì)胞會(huì)具有更強(qiáng)的增殖能力(見(jiàn)圖3 a)。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示,與未照射組比較,照射組在450 nm處A值更高(P<0.05),表示其細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)(見(jiàn)圖3 b)。

圖3 兩組原代成纖維細(xì)胞增殖能力Fig.3 Proliferation ability of primary fibroblasts in two groups

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析兩組成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期

KEGG分析顯示,輻照顯著增加了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。因此,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析兩組成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期變化,結(jié)果顯示,與未照射組比較,照射組照射后4周明顯促進(jìn)成纖維細(xì)胞進(jìn)入S期,加速了細(xì)胞的增殖(見(jiàn)圖4 a)。體外試驗(yàn)證明,成纖維細(xì)胞照射后第3天開(kāi)始,進(jìn)入S期的細(xì)胞比例明顯超過(guò)未照射組(見(jiàn)圖4 b)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞周期Fig.4 Cell cycle identification by flow cytometry

3 討 論

瘢痕疙瘩是一種纖維增生性疾病和人類特有的生理現(xiàn)象,可發(fā)生在遺傳易感人群中[9]。因此,由于瘢痕疙瘩僅能在人體上產(chǎn)生,是很難通過(guò)動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)科學(xué)研究的。免疫缺陷小鼠品系的培育為研究體內(nèi)瘢痕疙瘩的病理提供了一種新的方法,這種人源組織異種移植小鼠模型(PDX模型)在移植后幾周到幾個(gè)月仍然存活[8,10]。本研究利用NCG小鼠建立了人源性瘢痕疙瘩組織的PDX模型,移植物成功在小鼠體內(nèi)存活了長(zhǎng)達(dá)20周。雖然隨著時(shí)間的推移,能夠觀察到明顯的組織損失,但所有移植物在20周內(nèi)保持了其原始的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)特征,為臨床研究和分子機(jī)制提供了足夠長(zhǎng)的窗口期。

研究[11]表明,電子線照射瘢痕疙瘩具有良好的臨床療效,最近的數(shù)據(jù)[4]顯示,手術(shù)切除瘢痕疙瘩后隨即進(jìn)行電子線照射可將復(fù)發(fā)概率降低到8.6%,而傳統(tǒng)瘢痕疙瘩手術(shù)的復(fù)發(fā)概率高達(dá)45%～100%。關(guān)于最佳照射時(shí)間,大多數(shù)研究[12]建議在瘢痕疙瘩手術(shù)切除后24～48 h內(nèi)應(yīng)進(jìn)行電子線輔助放射治療。從放療分子機(jī)制上看,此時(shí)在切口肉芽組織中占主導(dǎo)地位的成纖維細(xì)胞是對(duì)輻射敏感組織。因此,這種放療策略可以有效抑制成纖維細(xì)胞的增殖和分裂,減少膠原沉積。然而,對(duì)于最佳照射劑量和分割方案尚未達(dá)成共識(shí)。在既往研究[13]中,瘢痕疙瘩的治療基本上均為術(shù)后輔助放療,劑量分割方式為12～20 Gy/3～5次。本研究證實(shí),與正常分割方案相比,20 Gy/5次的輻射可產(chǎn)生更好的局部控制率。最近的研究[14]表明,對(duì)瘢痕疙瘩切除術(shù)后盡快使用大分割的高能電子線放療是一種很好的臨床治療方法。單次8～10 Gy的電子線輔助放療也被證實(shí)對(duì)治療瘢痕疙瘩是有效和安全的[15-16]。既往研究[17]表明,對(duì)于不可切除的瘢痕疙瘩,根治性放療亦可達(dá)到令人滿意的療效。因此,術(shù)后輔助放療已成為瘢痕疙瘩最為常見(jiàn)的治療方法。

在本研究通過(guò)電子線照射人源瘢痕疙瘩的PDX模型探討FAP對(duì)輻照后瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)的作用及其機(jī)制,血管作為輻照敏感組織,其狀態(tài)直接影響移植物的存活周期。本研究提示照射后4周移植物的血管網(wǎng)絡(luò)遭到嚴(yán)重破壞,表明輻照可迅速破壞移植物的新生血管系統(tǒng),導(dǎo)致其產(chǎn)生輻射抗性。本研究觀察到輻照后的瘢痕疙瘩組織迅速?gòu)?fù)發(fā),并且伴隨著FAP和Vimentin的表達(dá)回升。FAP是一種脯氨酸選擇性絲氨酸蛋白酶,在瘢痕疙瘩組織和腫瘤基質(zhì)(癌癥/腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞,CAFs/TAFs)中過(guò)度表達(dá),但在大多數(shù)正常成人組織中檢測(cè)不到[18-19]。FAP通過(guò)絲氨酸蛋白酶活性在基質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用[20],放療后腫瘤復(fù)發(fā)通常是由腫瘤輻射抗性成分引起的,這是由癌細(xì)胞內(nèi)在特性和外部微環(huán)境共同作用的結(jié)果[21]。越來(lái)越多的證據(jù)[22-24]表明:FAP陽(yáng)性的腫瘤CAFs可能提供更具免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境,以抵抗免疫細(xì)胞/放療/化療的殺傷,從而提高腫瘤存活率。此外,移植瘤模型結(jié)果表明,FAP陽(yáng)性基質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)削弱T細(xì)胞抗腫瘤活性來(lái)促進(jìn)免疫抑制[25]。然而,誘導(dǎo)FAP表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。本研究結(jié)果首次揭示了電子線照射可提升體外和體外FAP的表達(dá)水平,未照射組FAP陽(yáng)性組織的減少與組織損失呈正相關(guān)關(guān)系,而照射組FAP陽(yáng)性組織的復(fù)發(fā)也與移植物體積成正比。此外,轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示,輻照顯著增強(qiáng)了移植物的翻譯活性,促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示,無(wú)論是體內(nèi)還是體外試驗(yàn),輻照均促進(jìn)成纖維細(xì)胞的S期細(xì)胞比例的增加,并提高其增殖能力。本研究發(fā)現(xiàn),電子線僅在原代人瘢痕疙瘩衍生成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)FAP表達(dá),也試圖檢測(cè)輻射誘導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞細(xì)胞系FAP表達(dá),但該細(xì)胞系顯示出較差的放射敏感性(數(shù)據(jù)未顯示)。

綜上所述,本研究結(jié)果顯示,FAP在手術(shù)切除和放療后瘢痕復(fù)發(fā)組織中的顯著表達(dá),表明輻照可能增強(qiáng)FAP陽(yáng)性細(xì)胞豐度,其與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)。