孫立杰，郝丹丹

1.赤峰學院附屬醫(yī)院 普外科，內(nèi)蒙古 赤峰 024005；2.赤峰學院 基礎醫(yī)學院 生理學教研室，內(nèi)蒙古 赤峰 024000

肝纖維化(liver fibrosis)是一種由多種慢性肝損傷引起的異常創(chuàng)傷修復反應,其特征是彌漫性細胞外基質(zhì)過度沉積和結締組織異常增生,并可能進一步發(fā)展為肝硬化、肝衰竭或肝癌,缺乏有效的治療方法[1]。因此,研究和開發(fā)抗纖維化藥物仍然是當務之急。鐵死亡(ferroptosis)是一種新發(fā)現(xiàn)的依賴于鐵和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的調(diào)節(jié)性細胞死亡[2]。最近研究表明,鐵死亡通過使肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)失活、抑制肝纖維化和誘導肝細胞死亡參與肝纖維化發(fā)病機制。 本文首先描述了鐵死亡促進肝纖維化發(fā)展的具體機制,重點總結了可誘導HSC鐵死亡的藥物治療肝纖維化的藥理作用機制。本文提示靶向誘導HSC鐵死亡是治療肝纖維化的一種潛在的方法。

1 肝纖維化

肝纖維化導致細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)蛋白質(zhì)(主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白)積聚,形成纖維瘢痕,取代受損的正常組織,最終損害正常肝功能[1]。受損的肝細胞還激活炎性反應細胞,如巨噬細胞和淋巴細胞,以產(chǎn)生多種細胞因子,包括轉(zhuǎn)化生長因子-β (transforming growth factor-β,TGF-β)和血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor, PDGF)。這些細胞因子會導致ECM降解和合成的失調(diào),導致肝纖維化的發(fā)展。如果損傷持續(xù)存在,且未及時采取治療干預措施,肝實質(zhì)將逐漸被過度ECM形成的瘢痕組織取代,導致肝臟標準結構喪失,并形成肝硬化,使肝細胞癌和胃腸道出血等嚴重并發(fā)癥的風險增加。通常,兩種類型的慢性肝損傷,即肝毒性損傷和膽汁淤積性損傷會導致肝纖維化[1]。肝毒性損傷是由外部因素引起的肝細胞慢性細胞損傷引發(fā)的,包括乙型肝炎和/或丙型肝炎病毒感染、酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝病和非酒精性脂肪肝炎。原發(fā)性和/或繼發(fā)性疾病,包括原發(fā)性膽管炎、原發(fā)性硬化性膽管炎和膽道閉鎖,會阻礙或減少肝臟中的膽汁流量,從而導致膽汁淤積損傷[1]。肝纖維化具有共同的分子機制,涉及上皮或內(nèi)皮屏障的破壞、肝細胞的損傷和死亡、慢性炎性反應和HSC的激活[3]。

2 鐵死亡參與肝纖維化發(fā)病機制

鐵死亡主要通過兩種途徑參與肝纖維化進程,即鐵死亡可使HSC死亡失活進而抑制肝纖維化和誘導肝細胞死亡參與肝纖維化進程。

2.1 HSC鐵死亡與肝纖維化

HSC激活是導致肝纖維化的核心事件,即HSC激活促進肝纖維化發(fā)生。而誘導HSC死亡從而使HSC失活對肝纖維化具有抑制作用。鐵死亡的特異性調(diào)節(jié)因子誘導或抑制HSC鐵死亡,其中ELAV樣RNA結合蛋白1 (ELAV like RNA binding protein 1, ELAVL1)[4]、含溴多糖的蛋白7(bromodomain-containing protein 7, BRD7)[5]和三元基序蛋白26(tripartite motif-containing protein 26, TRIM26)[6]誘導HSC鐵死亡,而ZFP36環(huán)指蛋白(ZFP36 ring finger protein, ZFP36)[7]抑制HSC鐵死亡。ELAVL1是一種普遍存在的RNA結合蛋白,通過與BECN1/Beclin1 mRNA結合,促進自噬的激活,從而增強細胞凋亡。抑制自噬,完全破壞了ELAVL1介導的鐵死亡;而誘導自噬,與ELAVL2有協(xié)同作用。在小鼠中,鐵死亡誘導劑索拉非尼或伊拉斯汀(erastin)通過抑制泛素-蛋白酶體途徑被上調(diào)ELAVL1的表達。上調(diào)的ELAVL1與BECN1 mRNA結合并促進BECN1/Beclin1的生成,導致鐵蛋白的自噬依賴性降解和HSC的鐵沉降,最終減輕肝纖維化。然而,HSC中ELAVL1的特異性敲除損害了索拉非尼誘導的小鼠肝纖維化中HSC的鐵死亡[7]。BRD7直接結合p53,并促進p53線粒體易位,隨后與溶質(zhì)載體家族25成員28(solute carrier family 25 member 28, SLC25A28)形成復合物并提高SLC25A28活性,導致氧化還原活性鐵過度沉積和HSC鐵死亡發(fā)生。阻斷BRD7與p53的結合能夠抑制HSC中p53的線粒體易位和細胞凋亡。沉默SLC25A28能夠抑制BRD7或p53介導的HSC鐵死亡。鐵死亡誘導劑伊拉斯汀通過誘導HSC鐵死亡來改善小鼠肝纖維化。特異性阻斷HSC的BRD7/P53/SLC25A28軸可以改善伊拉斯汀誘導的HSC鐵死亡?？傊?本研究表明BRD7/p53/SLC25A28軸參與誘導HSC鐵死亡,靶向BRD7/p53/SLC25A28軸成為治療肝纖維化的新靶點[5]。TRIM26是一種E3泛素連接酶,在CCl4誘導的小鼠模型纖維化肝組織中表達下調(diào)。TRIM26過表達抑制了HSC的增殖,促進了脂質(zhì)過氧化,調(diào)控了鐵死亡相關因子的表達,并抵消了鐵抑制劑去鐵胺的作用。此外,TRIM26與溶質(zhì)載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)相互作用,后者是清除脂質(zhì)活性氧的關鍵蛋白,并介導其泛素化。此外,TRIM26過表達誘導小鼠HSC鐵死亡,減輕CCl4誘導的肝纖維化?？傊?TRIM26通過介導SLC7A11的泛素化促進HSC鐵死亡以抑制肝纖維化。TRIM26靶向的SLC7A11抑制可能是一種新的肝纖維化治療策略[6]。ZFP36是一種RNA結合蛋白,可以破壞ATG16L1(autophagy related 16 like 1) mRNA的穩(wěn)定性,從而抑制自噬的激活,進而抑制鐵死亡。鐵死亡誘導劑索拉非尼通過激活泛素連接酶含F(xiàn)-框WD重復域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing 7,FBXW7)下調(diào)ZFP36蛋白的表達。FBXW7過表達促進鐵死亡發(fā)生,而 ZFP36過表達抑制FBXW7對HSC鐵死亡的促進作用,同時ZFP36通過使ATG16L1 mRNA的穩(wěn)定性降低進而抑制自噬的激活,ATG16L1過表達抵消ZFP36對鐵死亡的抑制作用,而FBXW7過表達促進ATG16L1對自噬的激活作用,ZFP36促進ATG16L1的mRNA降解。因此,鐵死亡誘導劑伊拉斯汀和索拉非尼治療可以通過下調(diào)ZFP36、激活鐵自噬和HSC鐵死亡來改善肝纖維化[7]。在小鼠中,伊拉斯汀(erastin)和索拉非尼(sorafenib)通過誘導HSC鐵沉積進而誘導鐵死亡減輕肝纖維化,HSC特異性過表達ZFP36逆轉(zhuǎn)了伊拉斯汀或索拉非尼誘導的HSC鐵死亡,表明ZFP36是一種鐵死亡抑制劑[7]。綜上所述,鐵死亡可使HSC失活,抑制肝纖維化。因此,通過藥物促進HSC鐵死亡,有望治療肝纖維化。

2.2 肝細胞鐵死亡與肝纖維化

目前,大多數(shù)研究聚焦HSC鐵死亡與肝纖維化關系。近年來少量研究表明,肝細胞的鐵死亡參與肝纖維化的發(fā)病機制,促進肝纖維化發(fā)生。鐵過載是導致鐵死亡的驅(qū)動因素,增加了肝纖維化和肝硬化的風險。鐵過度累積,通過誘導血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)表達,增強肝細胞內(nèi)的鐵死亡,促進肝纖維化的進展;同時,伴隨有體外和體內(nèi)FGF21蛋白水平上調(diào)[8]。在鐵死亡進程中,HO-1可能通過增強鐵釋放發(fā)揮促進死亡作用,從而參與鐵死亡的發(fā)生[8]。因此,肝細胞鐵死亡促進肝纖維化進展,而抑制肝細胞鐵死亡能夠達到治療肝纖維化的目的。在2型糖尿病的db/db小鼠模型中,肝纖維化增加,表現(xiàn)為肝細胞中TGF-β、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原增加[9]。在肝細胞中發(fā)現(xiàn)鐵死亡激活,表明ROS生成增加,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)和谷胱甘肽(glutathione, GSH)活性下調(diào),丙二醛(malondialdehyde, MDA)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal, 4-HNE) 和NADPH氧化酶4(NADPH oxidoreductase 4, NOX4)表達上調(diào),轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFR1)表達增加,鐵轉(zhuǎn)運蛋白1(ferroportin 1, FPN1)表達降低,SLC7A11和Nrf2/HO-1/GPX4信號通路下調(diào)[9]。同時,抗肥胖和糖尿病藥物利拉魯肽可以通過抑制鐵死亡減輕肝纖維化[9]。這一結果提示,肝細胞鐵死亡可能參與T2DM相關肝纖維化的發(fā)病機制。然而,肝細胞中的鐵死亡在肝纖維化的發(fā)展和發(fā)病機制中的確切作用研究尚不深入,調(diào)節(jié)肝細胞鐵死亡的深入分子機制仍需要進一步研究。

3 誘導肝星狀細胞鐵死亡與肝纖維化治療

肝纖維化長期以來一直是全球關注的健康問題,目前還沒有被食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的有效治療藥物。因此,探索基于新發(fā)病機制的治療策略成為治療肝纖維化的潛在突破口。近年來,通過藥物誘導鐵死亡清除激活的HSC治療肝纖維化的研究逐漸引起關注。中藥能通過多機制和多層面抑制肝纖維化的發(fā)展,是治療肝纖維化疾病的重要手段之一。中藥治療肝纖維化具有多靶點、不良反應小、效果好等特點,引起學者關注。

3.1 抑制SLC7A11/GPX4軸誘導HSC鐵死亡

目前研究表明,通過抑制SLC7A11/GPX4軸誘導HSC鐵死亡的藥物包括黃連素(berberine)[10]、前胡素(decursin)[11]、漢黃芩苷(wogonoside,WG)[12]、苦瓜提取物 (wild bitter melon extract, WBME)[13]、異甘草素(isoliquiritigenin)[14]、雷公藤紅素(celastrol)[15]、大黃酚(chrysophanol)[16]和雙氫青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)[17]。黃連素亦稱小檗堿,是從中藥黃連中分離的一種季銨生物堿,是一種潛在的抗肝纖維化藥物,但其潛在機制尚不清楚[18]。最近研究顯示,黃連素通過抑制SLC7A11/GPX4軸誘導HSC鐵死亡, 從而抑制肝纖維化[10]。在硫代乙酰胺和四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型中,黃連素明顯減輕小鼠肝纖維化,恢復小鼠肝功能,鐵死亡抑制劑減弱黃連素的抗纖維作用,表明黃連素通過誘導鐵死亡抑制肝纖維化[10]。前胡素是一種來自當歸根的中藥,是一種蛋白激酶C的激活劑,具有抗腫瘤活性,能夠降低四氯化碳誘導的肝纖維化[11]。漢黃芩苷是從黃芩中分離得到的一種黃酮類苷化合物,具有抗炎作用。WG通過誘導HSC的鐵死亡減輕肝纖維化[12]。苦瓜提取物具有促進脂多糖誘導的HSC激活和鐵死亡,發(fā)揮抗肝纖維化作用[13]。 異甘草素是從光果甘草根中分到的黃酮類化合物,具有抗腫瘤的活性, 通過抑制GPX4表達并增加TFR和二價金屬離子轉(zhuǎn)運體(divalent metalion transperter,DMT1)表達,產(chǎn)生大量ROS,誘導HSC鐵死亡,從而減輕肝纖維化[14],而膜內(nèi)在蛋白微囊蛋白1(caveolin-1, Cav-1)通過促進HSC鐵死亡發(fā)揮其抗肝纖維化作用,Cav-1介導的HSC鐵死亡是異甘草素在體內(nèi)外發(fā)揮抗纖維化作用所必需的[14]。雷公藤紅素是具有多種生物活性的天然產(chǎn)物,來源于中藥雷公藤的根皮,它是治療類風濕病藥物的有效成分之一,具有很強的抗氧化作用和抗癌癥新生血管生成作用。最近研究發(fā)現(xiàn),雷公藤紅素通過促進誘導活化的HSC鐵死亡發(fā)揮抗肝纖維化作用[15]。大黃酚又稱為大黃根酸 (chrysophanic acid),來源于蓼科植物掌葉大黃的根和根莖,是一種天然蒽醌,是一種EGFR/mTOR通道抑制劑,對多種細菌有抗菌作用,能止咳、促進腸管運動、促使神經(jīng)興奮和肌肉麻痹,對小鼠黑色素瘤也有明顯的抑制作用。大黃酚通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和鐵死亡減輕乙型肝炎病毒X蛋白誘導的肝星狀細胞活化和肝纖維化[16]。雙氫青蒿素為青蒿素的衍生物,對瘧原蟲紅內(nèi)期有強大且快速的殺滅作用,能迅速控制臨床發(fā)作及癥狀。最近研究顯示,DHA通過誘導活化HSC中的鐵死亡緩解肝纖維化[17]。

3.2 促進鐵蛋白自噬誘導HSC鐵死亡

鐵蛋白自噬(ferritinophagy)是一種核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)介導的自噬過程,可以降解鐵蛋白,將儲存在鐵蛋白中的鐵釋放到動態(tài)鐵池中,并增加細胞中鐵的可用性,從而促進脂質(zhì)過氧化驅(qū)動的鐵死亡。核受體共激活因子4(NCOA4)的上調(diào)可能在分子機制中發(fā)揮關鍵作用。NCOA4 siRNA可抑制DHA誘導的鐵死亡,而NCOA4過表達可增強DHA對鐵死亡的促進作用[17]。青蒿琥酯(artesunate)是青蒿素的水溶性半琥珀酸衍生物,具有抗肝纖維化作用[19-20],其以鐵蛋白介導的方式顯著促進活化HSC的鐵死亡,發(fā)揮抗肝纖維化作用,其抗纖維化作用可被去鐵胺(deferoxamine,DFO)完全消除[21]。

3.3 調(diào)控p53/SLC7A11通路誘導HSC鐵死亡

蒿甲醚(artemether,ART)是青蒿素的另一種衍生物,能夠通過激活p53進而抑制SLC7A11誘導HSC鐵死亡,抑制HSC激活和改善肝纖維化[22]。在肝纖維化小鼠模型中,ART治療顯著減輕了肝損傷并減少了纖維化疤痕的形成。此外,體外實驗還證實,ART治療顯著降低了HSC活化標志物的表達[22]。ART治療的HSC表現(xiàn)出鐵死亡的形態(tài)學特征,ART通過促進鐵和脂質(zhì)過氧化物的積累促進鐵死亡發(fā)生,而鐵死亡抑制劑鐵抑素-1(ferrostatin-1,Fer-1)抑制鐵死亡后完全消除了ART誘導的抗纖維化作用。而腫瘤抑制因子p53是促進ART誘導的HSC鐵死亡的上游分子,敲低p53明顯阻斷ART誘導的HSC鐵死亡,進而加劇肝纖維化[22]。表明ART調(diào)控p53/SLC7A11通路誘導HSC鐵死亡。

3.4 激活ACSL4通路誘導HSC鐵死亡

?；o酶A合成酶長鏈家族成員4(family member 4 acyl-CoA synthetase long-chain,ACSL4)是多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)代謝中的重要同工酶,其激活促進鐵死亡發(fā)生。DHA通過激活ACSL4誘導活化HSC中的鐵死亡緩解肝纖維化[17]。DHA上調(diào)原代培養(yǎng)HSC中ACSL4的mRNA表達,誘導HSC活化中和鐵死亡發(fā)生,而鐵死亡抑制劑Fer-1和 利普司他丁-1(liproxstatin-1)能夠逆轉(zhuǎn)DHA對HSC鐵死亡的促進作用[17]。表明DHA通過激活ACSL4誘導HSC鐵死亡,進而緩解肝纖維化發(fā)生。

3.5 其他機制

N6甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修飾可能通過穩(wěn)定BECN1 mRNA激活自噬增強HSC鐵死亡[23]。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA) 抑制自噬后減弱DHA誘導的HSC鐵死亡。DHA通過抑制脂肪質(zhì)量和肥胖相關基因 (fat mass and obesity-associated gene,FTO)進而促進 BECN1 mRNA的m6A修飾,進而穩(wěn)定 BECN1 mRNA從而激活自噬,從而誘導鐵死亡發(fā)生[24]。在小鼠中,DHA治療通過觸發(fā)HSC鐵死亡減輕肝纖維化。HSC特異性抑制m6A修飾和自噬可損害DHA誘導的小鼠肝纖維化HSC鐵死亡,為揭示DHA誘導的鐵死亡的分子機制提供了新的含義,指出m6A修飾依賴性鐵死亡是治療肝纖維化的潛在靶點[24]。

4 問題和展望

鐵死亡參與肝纖維化發(fā)病機制,探索靶向抑制鐵死亡治療肝纖維化是一個方興未艾的領域。研究報道,活性小分子化合物能夠通過靶向誘導HSC鐵死亡從而達到治療肝纖維化的作用。但這一領域尚有很多未解課題。首先,目前相對研究透徹的是HSC鐵死亡在肝纖維化進程中的作用,而對肝細胞鐵死亡、肝竇內(nèi)皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell)和炎性細胞(如中性粒細胞、枯否細胞、骨髓源單核細胞和Th17細胞)的鐵死亡在肝纖維化進程中的作用鮮有涉足,迫切需要揭示肝纖維化進程中肝細胞鐵凋亡的調(diào)控機制。其次,鐵死亡可能在不同的細胞類型中發(fā)揮完全相反的作用,誘導HSC中的鐵死亡作為肝纖維化的治療手段,而同時誘導肝細胞中的鐵死亡可能會加重肝纖維化。因此,靶向鐵死亡治療肝纖維化過程中可能起到雙刃劍的作用,并可能有不良反應,需要謹慎進行。通過靶向特定細胞類型的藥物輸送系統(tǒng)可能很大程度的緩解。盡管目前實驗研究表明,鐵死亡參與了肝纖維化的病理機制,通過藥理學手段可以靶向干預鐵死亡,但其詳細機制還有待進一步深度挖掘,其廣闊的應用前景也有待進一步開拓。總之,鐵死亡在肝纖維化發(fā)病進展中具有非常重要的地位,而靶向誘導HSC鐵死亡是治療肝纖維化新的有希望的靶點,是一種潛在的治療方法,探索其他藥物通過調(diào)控鐵死亡治療肝纖維化具有廣闊應用前景,也值得進一步研究。