黃清昱，陳奇英，孫晟甲，吳幫衛(wèi)，林 杉，阿力木江·買買提江

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院 心內(nèi)科，上海 200040

三分之二的糖尿病相關(guān)死亡是由動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病引起的[1],其危害十分嚴(yán)重。利拉魯肽(liraglutide,Lir)是胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)的類似物,可通過下調(diào)主動(dòng)脈晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(the receptor of advanced glycation endproducts, RAGE)的表達(dá)降低動(dòng)脈粥樣硬化病變程度[2],目前被廣泛用于糖尿病合并心血管疾病患者的治療。但其臨床應(yīng)用局限為需要頻繁的腸胃外注射。為此,既往研究者合成了一種具有緩釋特性的利拉魯肽抗脂肪口服納米制劑[3]。

細(xì)胞膜包被的納米顆粒[cell membrane-coated nanoparticles(NPs),CNPs]被開發(fā)為仿生納米藥物遞送系統(tǒng),可解決合成納米載體的過早清除、毒性和免疫原性問題[4]。有研究表明,血小板與斑塊有較強(qiáng)的親和性,可以靶向動(dòng)脈粥樣硬化病變部位[5-6]?；谝陨习l(fā)現(xiàn),本研究制備了一種具有靶向和緩釋雙功能的新型載藥血小板膜仿生納米載體,該材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,細(xì)胞功能良好。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血小板來源:采集新鮮小鼠全血濃縮血小板,-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑:人胚胎腎細(xì)胞系(human embryonic kidney 293T,HEK293T)、牛血清白蛋白(bovine-serum albumin,BSA)、2-嗎啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulphonic acid,MES)溶液(Sigma-Aldrich公司);氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecylsulfate,SDS)和二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)(阿拉丁公司);利拉魯肽(MCE公司);利拉魯肽檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)(武漢云克隆科技股份有限公司);細(xì)胞和組織裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 血小板膜碎片(platelet membrane fragments,PMF)的制備:按照文獻(xiàn)[7]中的方法制備血小板膜碎片。

1.2.2 BSA納米顆粒的制備:1)BSA活化:稱取120 mg BSA,60 mg SDS和4.4 mg DTT,置于5 mL樣品瓶中,加入3 mL超純水,充分溶解,90 ℃油浴,180 r/min,2 h。2)MES緩沖溶液(0.1 mol/L)的配制:0.97 g MES溶于50 mL超純水中,用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值到4.25～4.8。3)BSA空白納米粒的合成:以1 mL體系為例,取25、50和100 μL活化后的BSA溶液(40 mg/mL),加入到24孔板中,然后加入975 μL MES溶液,在37 ℃,800 r/min振蕩合成4 h。合成的納米粒用100 ku的超濾管,4 000 r/min,10 min 洗滌2～3次,4 ℃保存,備用。

1.2.3 Lir@BSA納米粒的形成:以1 mL體系為例,取25 μL活化后的BSA溶液(40 mg/mL),加入24孔板中,然后加入950 μL MES溶液,在震蕩條件下加入25 μL Lir溶液,最后在37 ℃,800 r/min振蕩合成4 h。合成的納米粒用100 ku的超濾管,4 000 r/min,10 min洗滌2～3次,最后用BCA蛋白試劑盒測(cè)定BSA蛋白濃度,4 ℃保存。

1.2.4 PMF濃度的測(cè)定:用BCA蛋白試劑盒測(cè)定BSA蛋白濃度。

1.2.5 Lir@BSA-PMF納米顆粒的制備:配制1 mg/mL Lir@BSA溶液和1 mg/mL PMF溶液,按照體積比為1∶1混合,之后將上述混合液通過0.22 μm聚碳酸酯膜來回?cái)D出20次,沉淀重懸備用。

1.2.6 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM):檢測(cè)BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF微觀形貌。

1.2.7 動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS):對(duì)比載藥和包膜前后納米顆粒的水合動(dòng)力學(xué)直徑和Zeta電位,判斷血小板膜是否包覆在BSA表面。

1.2.8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法:利用利拉魯肽檢測(cè)試劑盒檢測(cè)藥物利拉魯肽的包封率、負(fù)載率和Lir@BSA-PMF中藥物利拉魯肽的釋放情況,具體方法如下:根據(jù)差量法測(cè)定負(fù)載率和包封率。將合成Lir@BSA-PMF過程中得到的濾液,用利拉魯肽檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)檢測(cè)濾液中Lir的含量,通過差量法計(jì)算負(fù)載率和包封率,公式如下:負(fù)載率(%)=(藥總量-濾液中藥含量)/(載體總量+藥總量-濾液中藥含量)×100%。包封率(%)=(藥總量-濾液中藥含量)/藥總量×100%。釋放率:將Lir@BSA-PMF納米顆粒放在磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline,PBS)(pH=7.4)溶液中,37 ℃恒溫箱中靜置24 h,在2、4、6、8、10、12和24 h時(shí)間點(diǎn)取出溶液,4 ℃保存。用試劑盒對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的溶液進(jìn)行測(cè)定,利用累積法計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)Lir的釋放量。

1.2.9 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu): 為證明修飾的Lir@BSA-PMF具有完整的膜蛋白質(zhì),用RIPA裂解物裂解PMF和Lir@BSA-PMF并離心(14 000 r/min,5 min)以獲得提取的膜蛋白質(zhì),然后用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將樣品與上樣緩沖液混合并煮沸5 min。將PMF和Lir@BSA-PMF上樣于15% SDS-PAGE膠(每孔35 μg)中,并在120 V下電泳1.7 h。然后將其用考馬斯亮藍(lán)染色60 min,并采集結(jié)果。

1.2.10 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活:將BSA、PMF和Lir@BSA-PMF納米溶液與HEK293T細(xì)胞在體外共培養(yǎng),觀察細(xì)胞的生存情況。HEK293T細(xì)胞在含有10%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取96孔板,每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞,24 h后棄掉培養(yǎng)基,替換為納米材料溶液,同時(shí)設(shè)置空白組,每組分別3個(gè)平行樣品,置于培養(yǎng)箱中孵育24 h。分別在4、8、12、24、48和72 h后棄掉液體,每孔替換上100 μL培養(yǎng)基(含10 μL CCK-8溶液),繼續(xù)在37 ℃,5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后,用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔在450 nm處吸光度(A450 nm)值。再根據(jù)公式:細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組吸光值/空白組吸光值)×100%,計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.11 細(xì)胞內(nèi)活性氧的檢測(cè):使用二氯二氫熒光素二乙酸酯(2′7′-dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)探針檢測(cè)HEK293T細(xì)胞內(nèi)ROS水平:將HEK293T細(xì)胞以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,37 ℃,5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中過夜貼壁培養(yǎng)。將HEK293T細(xì)胞用1 μg/mL的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)預(yù)先處理24 h造模。然后與 BSA、Lir、PMF和Lir@BSA-PMF納米顆粒共孵育48 h,PBS洗滌細(xì)胞2次,每孔加入含10 μmol/L DCFH-DA探針的 PBS孵育48 h。通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

1.2.12 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)檢測(cè)對(duì)納米顆粒攝取能力:將HEK293T細(xì)胞(2×105個(gè)/孔)接種于24孔板中,與標(biāo)記的納米顆粒在37 ℃下分別孵育0、2、4、6和8 h。孵育結(jié)束后,棄藥液,用PBS清洗2次,加入胰蛋白酶消化細(xì)胞,全培養(yǎng)基終止消化,收集細(xì)胞。接下來,為進(jìn)一步研究細(xì)胞對(duì)Lir @BSA-PMF納米系統(tǒng)的攝取,在預(yù)定時(shí)間內(nèi),用激光共聚焦顯微鏡對(duì)HEK293T細(xì)胞中FITC標(biāo)記的NPs進(jìn)行拍照。并用Imagine J軟件對(duì)其熒光值進(jìn)行半定量計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的形貌觀測(cè)

BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF組均為粒徑大小均一的球狀納米粒子。單獨(dú)的BSA納米粒子的尺寸范圍為25～35 nm,而負(fù)載了藥物L(fēng)ir之后,其尺寸范圍在35～50 nm。包裹了血小板膜的納米粒子Lir@BSA-PMF中出現(xiàn)了很多納米碎片,并且Lir@BSA-PMF的納米尺寸范圍為20～35 nm。

2.2 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的尺寸檢測(cè)

單獨(dú)的BSA水合動(dòng)力學(xué)動(dòng)力直徑為28.2 nm,而負(fù)載了藥物之后,Lir@BSA粒徑略微有增加,從28.2 nm增加到32.7 nm,進(jìn)一步包裹納米血小板膜之后,Lir@BSA-PMF粒徑值為26.2 nm(圖2)。

圖1 BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF的透射電鏡顯微鏡照片F(xiàn)ig 1 TEM images of BSA, Lir@BSA and Lir@BSA-PMF

圖2 BSA、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF粒徑分布Fig 2 Particle size distribution of BSA, Lir@BSA and Lir@BSA-PMF

2.3 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的Zeta電位測(cè)定

Lir與BSA納米粒子復(fù)合之后,Zeta電位值發(fā)生改變,Lir@BSA納米顆粒合成成功。包裹血小板膜之后,Lir@BSA-PMF的Zeta電位值進(jìn)一步降低,血小板膜碎片成功包覆在Lir@BSA納米顆粒表面,形成Lir@BSA-PMF仿生納米載體(圖3)。

圖3 BSA、Lir、Lir@BSA和Lir@BSA-PMF的Zeta電位Fig 3 Zeta potential of BSA, Lir, Lir@BSA and

2.4 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的粒徑穩(wěn)定性

Lir@BSA-PMF在PBS(pH=7.4)溶液中具有良好的穩(wěn)定性,48 h內(nèi)納米粒子粒徑維持在25 nm左右(圖4)。

圖4 Lir@BSA-PMF粒徑穩(wěn)定性Fig 4 Particle size stability of Lir@BSA-PMF

2.5 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的包封率和負(fù)載率

測(cè)試結(jié)果顯示:Lir@BSA-PMF的包封率和負(fù)載率分別為85.56%和7.96%。

2.6 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的釋放率

Lir@BSA-PMF在PBS(pH=7.4)溶液中,24 h累計(jì)釋放率為77.06%(圖5)。

圖5 Lir@BSA-PMF中Lir的釋放效率Fig 5 Release efficiency of the Lir in Lir@BSA-PMF

2.7 Lir@BSA-PMF仿生納米載體中完整膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證

在PMF和Lir@BSA-PMF組中檢測(cè)到相同的蛋白質(zhì)條帶分布,血小板膜在包覆藥物L(fēng)ir和BSA納米顆粒之后,仍然保留著相似的膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分布(圖6)。

圖6 PMF和Lir@BSA-PMF的SDS-PAGE分析Fig 6 SDS-PAGE analysis of PMF and Lir@BSA-PMF

2.8 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的生物相容性驗(yàn)證

BSA、PMF和Lir@BSA-PMF組中加入納米粒子后,各組HEK293T細(xì)胞存活率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(圖7)。

圖7 CCK-8檢測(cè)BSA、PMF and Lir@BSA-PMF HEK293T細(xì)胞活力的影響

2.9 Lir@BSA-PMF仿生納米載體對(duì)細(xì)胞氧化損傷的影響

正常的HEK293T細(xì)胞的DCFH-DA熒光強(qiáng)度較低,用1 μg/mL LPS刺激之后,其熒光強(qiáng)度明顯增加,成功構(gòu)建氧化損傷模型。在體外HEK293T細(xì)胞的LPS模型中分別加入BSA、Lir、PMF和Lir@BSA-PMF納米顆粒之后,BSA和PMF組的熒光強(qiáng)度與模型組基本一致,而Lir和Lir@BSA-PMF組的熒光強(qiáng)度逐漸減弱(圖8A)。LPS刺激之后,與正常細(xì)胞相比,LPS模型組的熒光值顯著增加(P<0.05),ROS損傷模型構(gòu)建成功后,在LPS模型細(xì)胞中加入Lir和Lir@BSA-PMF納米粒溶液后,與ROS損傷模型組相比,其熒光值顯著性下降(P<0.05)(圖8B)。

LPSa.model group of LPS stimulation; *P<0.05 compared with control; # P<0.05 compared with LPSa; △ P<0.05 compared with PMF.

2.10 Lir@BSA-PMF仿生納米載體的細(xì)胞吞噬效果

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),Lir@BSA-PMF納米粒子在細(xì)胞中的綠色熒光強(qiáng)度逐漸增多(圖9A)。隨著時(shí)間的增加,細(xì)胞吞噬量逐漸增加(圖9B)。

圖9 Lir@BSA-PMF納米顆粒的細(xì)胞吞噬效果Fig 9 Lir@BSA-PMF Effect of cellular phagocytosis of

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是以斑塊和炎癥為特征的動(dòng)脈血管疾病,高脂血癥、高血壓、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激引起的慢性動(dòng)脈損傷是導(dǎo)致其發(fā)生發(fā)展的主要原因[8]。目前該疾病主要的治療方法是藥物治療。GLP-1在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)中具有特殊地位,因?yàn)樗哂写碳ひ葝uβ細(xì)胞分泌胰島素的能力[9]。GLP-1受體激動(dòng)劑是對(duì)GLP-1結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾后獲得,其半衰期進(jìn)一步延長(zhǎng),外源性給藥后可提高體內(nèi)活性的GLP-1水平,使其在體內(nèi)達(dá)到有效濃度,從而改善胰島素敏感性,并發(fā)揮降低血糖、血壓及體質(zhì)量的作用[10]。本研究使用的藥物利拉魯肽作為GLP-1受體激動(dòng)劑,是T2DM治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[11]。

近期研究結(jié)果顯示將藥物與納米粒子結(jié)合起來形成納米載藥,可降低藥物毒性以及增加在特定部位的富集,利于動(dòng)脈粥樣硬化的治療[12]。本研究使用的BSA納米載體是牛血清中的一種球蛋白,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BSA、PMF和Lir@BSA-PMF本身對(duì)HEK293T細(xì)胞均無殺傷能力,Lir@BSA-PMF穩(wěn)定規(guī)則的納米球狀結(jié)構(gòu)可被細(xì)胞攝取。相比于單獨(dú)的納米顆粒,包裹血小板膜碎片的納米顆粒尺寸有輕微減小,且粒徑分布變寬,這可能與Lir@BSA-PMF的制備過程中來回?cái)D出有關(guān)。在來回?cái)D出的過程中納米顆粒形狀變得更加規(guī)整,同時(shí)也可能會(huì)出現(xiàn)部分納米顆粒被擠碎的現(xiàn)象。

藥物遞送過程中的生物屏障可阻止納米藥物載體在患病部位的積累,從而會(huì)限制藥物治療時(shí)的有效率[13]。另外有研究表明,血小板可通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞遷移富集到動(dòng)脈粥樣硬化斑塊上[14]。本研究使用血小板膜片對(duì)納米顆粒進(jìn)行修飾,制備的仿生納米藥物遞送系統(tǒng)是由血小板膜偽裝成的納米顆粒,更加容易在復(fù)雜的生物環(huán)境中運(yùn)行[15];納米顆粒表面保留的膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可延長(zhǎng)其在血液中的循環(huán),同時(shí)具有靶向斑塊遞送以及受控釋放的特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示Lir@BSA-PMF載藥納米仿生載體24 h內(nèi)可持續(xù)緩慢釋放藥物利拉魯肽。

綜上所述,本研究制備的Lir@BSA-PMF載藥納米仿生載體具有良好的生物相容性和抗氧化損傷能力,具備優(yōu)異的藥物包封率和藥物緩釋效果,同時(shí)可被細(xì)胞攝取并且保留了血小板膜上的蛋白質(zhì)。