秦小英，劉 慧，韓沖芳，賀建東

1.山西醫(yī)科大學(xué) 麻醉學(xué)院，山西 太原 030001；2.山西白求恩醫(yī)院 麻醉科，山西 太原 030001

晝夜節(jié)律作為生物體內(nèi)的一種重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)機(jī)制,利用光信號與外界環(huán)境同步,嚴(yán)密地控制著生物體的飲食、覺醒以及禁食、睡眠等節(jié)律,這種節(jié)律的同步性確保生物體與外界環(huán)境及不同外周器官間生物鐘節(jié)律的一致[1]。缺血性心臟病是糖尿病的主要心血管并發(fā)癥和死亡原因,而血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase-myoglobin,CK-MB)活性和肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnⅠ)含量常作為臨床首選的生化指標(biāo)來檢測急性心肌缺血,且糖尿病患者的心肌更容易受到缺血/再灌注損傷的影響[2]。在糖尿病患者中,晝夜節(jié)律紊亂的發(fā)生率很高,晝夜節(jié)律紊亂會導(dǎo)致糖尿病的胰島素敏感性降低,影響糖尿病控制和預(yù)后[3]。改善晝夜節(jié)律紊亂可以改善血糖水平以及糖尿病的并發(fā)癥,從而提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。然而,對于改善晝夜節(jié)律紊亂對糖尿病心肌缺血/再灌注的研究目前尚不清楚,因此本研究旨在探討間斷補(bǔ)充睡眠是否可減輕晝夜節(jié)律紊亂加重的糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:SPF級SD大鼠,體質(zhì)量250～300 g[山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號:SYXK(晉)2019-0007],嚴(yán)格遵守國家動(dòng)物福利倫理及保護(hù)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物、試劑(盒):1%鏈脲佐菌素(STZ,Sigma-Aldrich公司);ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);REV-ERBα一抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司);BMAL1一抗、GAPDH一抗、二抗(上海艾博抗生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理:將構(gòu)建成功的糖尿病大鼠分為:假手術(shù)組(Sham);缺血/再灌注組(I/R),結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending coronary artery,LDA)30 min,再灌注120 min];晝夜節(jié)律紊亂組(circadian rhythm disorder,Crd),I/R組基礎(chǔ)上,每日持續(xù)24 h光照并提供食物使大鼠晝夜節(jié)律紊亂);間斷補(bǔ)充睡眠組(discontinuous sleep supplementation,Dss),在Crd組基礎(chǔ)上,夜間12 h不提供食物,且每光照3 h關(guān)閉1.5 h讓其補(bǔ)充睡眠。Sham組和I/R組每日光照12 h并規(guī)律進(jìn)食3餐,夜晚關(guān)閉光照并停止提供食物。

大鼠禁食12 h,1%戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉。持續(xù)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。頸部正中第3、4氣管軟骨環(huán)之間行氣管切開術(shù),置入16 G氣管導(dǎo)管行機(jī)控呼吸(參數(shù):潮氣量5 mL/200 g,呼吸頻率60次/min,吸呼比1∶2)。暴露大鼠左側(cè)腹股溝區(qū),結(jié)扎左股靜脈遠(yuǎn)心端,并用28 G套管針穿刺置管。切開胸腔,充分暴露心臟,在左心耳根部下2 mm左右的位置用絲線穿過LDA,在絲線的兩端穿過一段硅膠管,縮緊套管并固定絲線以造成大鼠心肌缺血。結(jié)扎LDA 30 min,心電圖反映出ST段抬高、QRS波增寬增高、T波高尖,同時(shí)結(jié)扎的遠(yuǎn)端心尖及左室前壁組織發(fā)紺且跳動(dòng)無力,為結(jié)扎成功的標(biāo)志;結(jié)扎30 min后進(jìn)行120 min再灌注,ST段回落以及結(jié)扎的遠(yuǎn)端心尖及左室前壁組織逐漸變紅,是再灌注成功的標(biāo)志。Sham組LDA僅穿線不結(jié)扎;I/R組、Crd組和Dss組LDA均結(jié)扎30 min后行120 min再灌注。

1.2.2 三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)法檢測心肌梗死體積百分比:隨機(jī)取5只大鼠,再次結(jié)扎其LDA,通過股靜脈置管注入3 mL 1%伊文氏藍(lán)(Evans blue)染液,當(dāng)正常組織完全上色,缺血區(qū)組織未染色后,立即處死大鼠,取出其心臟。用冷0.9%氯化鈉溶液沖洗心臟,后置于-20 ℃下1 h,垂直于其長軸切成2 mm厚的切片,放入現(xiàn)配的1% TTC溶液中,使之均勻染色,37 ℃孵育5 min,重復(fù)3次。用PBS緩沖液沖洗切片后放入4%甲醛組織固定液中固定15 min,掃描儀掃描心臟切片進(jìn)行保存。正常心肌呈藍(lán)色,缺血區(qū)心肌為磚紅色,梗死的心肌則為灰白色。用Image ProPlus 7.0圖像分析軟件(Media Cybernetics公司)計(jì)算心臟缺血區(qū)體積以及缺血區(qū)梗死體積,然后計(jì)算出心肌梗死體積百分比,公式為:缺血區(qū)梗死體積/缺血區(qū)體積×100%。

1.2.3 ELISA檢測血清cTnⅠ含量、CK-MB活性:120 min再灌注后,從右側(cè)頸動(dòng)脈抽取5 mL血樣,靜置2 min后,2 000 r/min離心15 min,離心半徑8.5 cm,隨后嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.4 Western blot測定心肌組織生物鐘基因BMAL1、REV-ERBα的表達(dá)水平:取心肌缺血區(qū)的組織按10 μg/mL的比例加入RIPA裂解液,用超聲波粉碎機(jī)破碎組織樣品后置于冰上裂解10 min,4 ℃離心15 min,12 000 r/min,采取BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取200 μL上清液倒入離心管,以4∶1比例加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液,將其置于100 ℃,10 min,使蛋白徹底變性。將樣品置于冰上進(jìn)行冷卻,4 ℃,2 000 r/min,離心1 min。根據(jù)蛋白分子量調(diào)配SDS-PAGE分離膠和濃縮膠,通過凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜后,用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h,并用TBST洗滌5 min×3次。加入REV-ERBα一抗(1∶1 000)、BMAL1一抗(1∶1 000)、GAPDH一抗(1∶6 000),4 ℃孵育過夜。TBST洗滌5 min×3次,加入二抗(1∶50 000),在室溫下孵育2 h,TBST洗滌5 min×3次。用IPWIN60軟件處理系統(tǒng)來分析目標(biāo)條帶的吸光度值。以GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)BMAL1、REV-ERBα條帶吸光度值與GAPDH條帶吸光度值之比衡量BMAL1、REV-ERBα的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死體積百分比及cTnⅠ含量、CK-MB活性

與Sham組相比,I/R組心肌梗死體積明顯增大,血清CK-MB活性和cTnⅠ含量明顯升高(P<0.05);Crd組同I/R組相比,心肌梗死體積增大,cTnⅠ含量和CK-MB活性升高(P<0.05);Dss組同Crd組相比,心肌梗死體積減小,血清CK-MB活性和cTnⅠ含量降低(P<0.05)(表1)。

表1 大鼠心肌梗死體積百分比及血清中cTnⅠ、 CK-MB的比較

2.2 心肌組織生物鐘基因BMAL1、REV-ERBα的蛋白表達(dá)

與Sham組相比,I/R組心肌生物鐘基因BMAL1表達(dá)下調(diào),REV-ERBα上調(diào)(P<0.05);Crd組同I/R組相比,心肌組織BMAL1表達(dá)下調(diào),REV-ERBα上調(diào)(P<0.05);Dss組同Crd組相比,心肌組織BMAL1表達(dá)上調(diào),REV-ERBα下調(diào)(P<0.05)(圖1,表2)。

圖1 Western blot檢測大鼠心肌組織BMAL1和REV-ERBα的蛋白表達(dá)Fig 1 Western blot assay of protein expression of BMAL1 and REV-ERBα in rat myocardial tissue

表2 大鼠心肌組織生物鐘基因BMAL1、REV-ERBα相對表達(dá)量

3 討論

生物鐘由10個(gè)以上相互關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子組成,所有這些調(diào)節(jié)因子都可能對心臟的代謝過程產(chǎn)生影響,而芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的類似蛋白1(BMAL1)是生物鐘轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的核心組成部分,在心肌細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起著重要作用,并受孤兒核受體REV-ERBα的負(fù)調(diào)控,BMAL1誘導(dǎo)REV-ERBα表達(dá),而REV-ERBα?xí)M(jìn)一步反饋抑制BMAL1的表達(dá)[4],在生物體內(nèi)的反饋調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。此外,BMAL1在心肌細(xì)胞中高度表達(dá),對心臟的代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和收縮功能發(fā)揮了關(guān)鍵作用[5]。晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)生物鐘的運(yùn)行,研究顯示,晝夜節(jié)律紊亂可能會影響生物鐘基因BMAL1和REV-ERBα的轉(zhuǎn)錄,從而加重糖尿病心肌缺血/再灌注損傷[6-9]。在大鼠心肌缺血/再灌注損傷時(shí),BMAL1表達(dá)降低,REV-ERBα表達(dá)升高[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Sham組比較,I/R組心肌梗死體積明顯增大,血清CK-MB活性和cTnⅠ含量明顯升高,心肌組織生物鐘基因BMAL1表達(dá)下調(diào),REV-ERBα上調(diào),提示心肌缺血/再灌注模型制備成功;Crd組同I/R組相比,心肌梗死體積百分比增大、血清CK-MB活性和cTnⅠ的含量升高,同時(shí)心肌組織生物鐘基因BMAL1表達(dá)降低、REV-ERBα表達(dá)升高,表明晝夜節(jié)律紊亂會加重糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷;Dss組與Crd組相比,心肌梗死體積百分比減小、血清中的cTnⅠ含量和CK-MB活性降低,心肌組織鐘基因BMAL1表達(dá)升高,REV-ERBα表達(dá)降低,證明間斷補(bǔ)充睡眠可以減輕晝夜節(jié)律紊亂加重的糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷。

綜上所述,晝夜節(jié)律紊亂加重了糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注損傷,而間斷補(bǔ)充睡眠則可減輕這種損傷,但對于其具體的機(jī)制目前尚不清楚。以上研究結(jié)果提示關(guān)注晝夜節(jié)律對預(yù)防糖尿病的并發(fā)癥是有必要的,但治療糖尿病相關(guān)晝夜節(jié)律紊亂的方法仍需進(jìn)一步研究。