方 媛，李 軼，王 瑋*

西安市第九醫(yī)院1.腫瘤血液科；2.血管介入科，陜西 西安 710054

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種以漿細(xì)胞惡性增殖為特征的血液系統(tǒng)腫瘤。由于極高的轉(zhuǎn)移率和耐藥性,MM的生存率仍不令人滿意[1-2]。環(huán)狀RNA精氨酸-谷氨酸二肽重復(fù)序列(circular RNA arginine-glutamate dipeptide repeat sequence,circRERE)在MM患者中上調(diào),敲低circRERE表達(dá)可通過海綿狀結(jié)合miR-152-3p抑制MM細(xì)胞增殖和硼替佐米抗性,促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡[3-4]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示circRERE序列中含有miR-128-3p的結(jié)合位點(diǎn)。miR-128-3p在MM中表達(dá)下調(diào),lncRNA HCP5通過結(jié)合miR-128-3p促進(jìn)MM的進(jìn)展[5]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,WEE1)在包括MM在內(nèi)的多種類型癌中高表達(dá),抑制WEE1表達(dá)可促使腫瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖[6]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示W(wǎng)EE1是miR-128-3p的潛在靶基因,且在膠質(zhì)瘤中miR-128-3p可靶向負(fù)調(diào)控WEE1表達(dá)[7]?；诖斯P者推測(cè)circRERE可能通過靶向miR-128-3p/WEE1軸來調(diào)節(jié)MM進(jìn)展。故本研究旨在觀察circRERE對(duì)MM細(xì)胞遷移、侵襲和增殖的影響及潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞:人MM細(xì)胞系(U266、RPMI-8226、NCI-H929、LP-1)和人胚腎細(xì)胞系293T(上海雅吉生物科技有限公司);選取西安市第九醫(yī)院的健康體檢者10名作為健康受試者,通過肘靜脈采集外周血5 mL,用CD138富集法從健康受試者外周血中分離正常漿細(xì)胞(normal plasma cells,nPCs),健康受試者均簽署知情同意書,本研究獲得西安市第九醫(yī)院倫理委員會(huì)的審核與批準(zhǔn)(H20221021)。

1.1.2 主要試劑:Lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen公司);BCA試劑盒、RIPA裂解液和噻唑藍(lán)MTT試劑盒(上海碧云天公司);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);兔源一抗anti-磷酸甘油醛脫氫酶(phosphoglyceraldehyde dehydrogen-ase,GAPDH)、anti-WEE1及山羊源二抗(Abcam公司);1%結(jié)晶紫染液(北京索萊寶公司);5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色液(廣州銳博生物公司);雙熒光素酶試劑盒(上海北諾生物科技有限公司);CircRERE、miR-128-3p和U6引物(南京金斯瑞公司設(shè)計(jì)合成);sh-circRERE、sh-NC、miR-128-3p inhibitor、inhibitor-NC、miR-128-3p mimic、mimic-NC、野生型circRERE(circRERE-WT)質(zhì)粒、WEE1-WT質(zhì)粒,突變型circRERE(circRERE-MUT)質(zhì)粒和WEE1-MUT質(zhì)粒(上海吉瑪制藥公司設(shè)計(jì)、合成)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組與轉(zhuǎn)染:nPCs和MM細(xì)胞系(U266、RPMI-8226、NCI-H929、LP-1)以及HEK-293T細(xì)胞均用含1%青霉素-鏈霉素雙抗、10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)增殖期的RPMI-8226細(xì)胞,以5×104個(gè)/孔接種至24孔板內(nèi),待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)棄去培養(yǎng)基,利用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,將細(xì)胞分為對(duì)照組(control)(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、sh-circRERE組、sh-NC組、miR-128-3p inhibitor組、inhibitor-NC組、sh-circRERE+inhibitor-NC組和sh-circRERE+miR-128-3p inhibitor組,轉(zhuǎn)染48 h后收集各組RPMI-8226細(xì)胞。sh-circRERE、sh-NC、miR-128-3p inhibitor和inhibitor-NC的轉(zhuǎn)染量均為50 pmol/L。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)circRERE、miR-128-3p表達(dá):使用Trizol從nPCs和MM細(xì)胞系及1.2.1各組RPMI-8226細(xì)胞中提取總RNA,通過NanoDrop 2000測(cè)定RNA濃度后,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。U6作為miR-128-3p的內(nèi)參,GAPDH作為circRERE的內(nèi)參。采用RT-qPCR試劑盒和RT-qPCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。circRERE、miR-128-3p的定量采用2-ΔΔCt法。引物序列:circRERE:forward 5′-TTTG CAGGAATGTGTGATGG-3′,reverse 5′-ATGAATCC ACTCG GGCTTTA-3′;miR-128-3p:forward 5′-GGGT CACAGTGAACCG-3′,reverse 5′-AACTGGTGTCGTG GAGTCGGC-3′;GAPDH:forward 5′-GTCTCCTCTGA CTTCAACAGCG-3′,reverse 5′-ACCACCCTGTTGCT GTAGCCAA-3′;U6:forward 5′-GTGCTCGCTTCGG CAGCAC AT-3′,reverse 5′-TACCTTGCGAAGTGCTT AAAC-3′。

1.2.3 Western blot檢測(cè)WEE1表達(dá): 用RIPA裂解液提取nPCs和MM細(xì)胞及1.2.1各組RPMI-8226細(xì)胞總蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)樣品使用BCA法進(jìn)行定量。然后將蛋白質(zhì)通過凝膠電泳分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉阻斷1 h后,4 ℃下與兔源anti-GAPDH、anti-WEE1一抗過夜孵育。次日,用山羊源二抗在室溫下孵育膜2 h。最后,根據(jù)制造商的說明,滴加ECL發(fā)光液顯色。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析,定量蛋白表達(dá)。

1.2.4 MTT法和EdU免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖:MTT實(shí)驗(yàn):RPMI-8226細(xì)胞接種至96孔板(1×104個(gè)/孔),孵育48 h,添加MTT試劑,4 h后加入DMSO,繼續(xù)孵育10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處吸光度(A)。增殖率(%)=(A轉(zhuǎn)染處理組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

EdU免疫熒光染色:轉(zhuǎn)染后的RPMI-8226細(xì)胞分別在添加50 μmol/L EdU標(biāo)記液的培養(yǎng)基中孵育2 h,4%多聚甲醛固定后,甘氨酸孵育后,阿波羅染色(Apollo)30 min,5 μg/mL DPAI進(jìn)行DNA染色30 min,熒光顯微鏡下檢測(cè)EdU陽性細(xì)胞。

1.2.5 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移:RPMI-8226細(xì)胞接種至24孔板(5×104個(gè)/孔),孵育48 h后棄去培養(yǎng)基,用100 μL槍頭在孔中間豎著劃一條直線,PBS清洗2遍去除劃下的細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,而后于倒置顯微鏡下拍照,借助Image J軟件計(jì)算細(xì)胞劃痕面積愈合率。

1.2.6 Transwell小室法檢測(cè)各組RPMI-8226細(xì)胞侵襲:預(yù)先于Transwell小室的上表面涂上Matrigel膠,收集轉(zhuǎn)染的RPMI-8226細(xì)胞,在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中重懸。將4×104個(gè)細(xì)胞接種于孔徑為8.0 μm的24孔室的上室,將含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑加入下腔。37 ℃,孵育48 h,用棉簽輕輕拭去上表面的細(xì)胞,隨后置于固定液中30 min,PBS清洗、晾干后置于1%結(jié)晶紫染液中染色10 min,借助倒置顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,即為侵襲細(xì)胞數(shù)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-128-3p與circRERE或WEE1的靶向作用關(guān)系:通過ENCORI在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-128-3p與circRERE或WEE1的結(jié)合位點(diǎn)。將circRERE、WEE1野生序列或突變序列分別插入到pmiRGLO載體,構(gòu)建circRERE-WT/MUT質(zhì)粒、WEE1-WT/MUT質(zhì)粒。

取對(duì)數(shù)增殖期的293T細(xì)胞,以5×104個(gè)/孔接種至24孔板內(nèi),待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)利用Lipofectamine2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染,實(shí)驗(yàn)分組如下:1)circRERE-WT+miR-128-3p mimic組、circRERE-WT+mimic-NC組、circRERE-MUT+miR-128-3p mimic組、circRERE-MUT+mimic-NC組;2)WEE1-WT+miR-128-3p mimic組、WEE1-WT+mimic-NC組、WEE1-MUT+miR-128-3p mimic組、WEE1-MUT+mimic-NC組。48 h后,收集細(xì)胞,用裂解緩沖液裂解。根據(jù)制造商的方案,使用雙熒光素酶試劑盒評(píng)估熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CircRERE、miR-128-3p、WEE1在MM細(xì)胞系中的表達(dá)

與正常漿細(xì)胞nPCs比較,MM細(xì)胞RPMI-8226、U266、NCI-H929、LP-1中circRERE、WEE1表達(dá)增加,miR-128-3p表達(dá)減少(P<0.05)(圖1)。其中,RPMI-8226細(xì)胞中circRERE、WEE1表達(dá)水平最高,miR-128-3p表達(dá)水平最低,故選擇RPMI-8226細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

*P<0.05 compared with nPCs cells; # P<0.05 compared with RPMI-8226 cells.

2.2 各組RPMI-8226細(xì)胞中circRERE、miR-128-3p、WEE1的表達(dá)

與對(duì)照組比較,sh-circRERE組RPMI-8226細(xì)胞circRERE、WEE1表達(dá)減少,miR-128-3p表達(dá)增加(P<0.05);miR-128-3p inhibitor組miR-128-3p表達(dá)減少,WEE1表達(dá)增加(P<0.05);與sh-circRERE組比較,sh-circRERE+miR-128-3p inhibitor組RPMI-8226細(xì)胞miR-128-3p表達(dá)減少,WEE1表達(dá)增加(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group.

2.3 敲低circRERE和/或miR-128-3p表達(dá)后RPMI-8226細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

與對(duì)照組比較,sh-circRERE組RPMI-8226細(xì)胞增殖率、EdU陽性細(xì)胞比例、劃痕面積愈合率、侵襲數(shù)均減少(P<0.05),miR-128-3p inhibitor組增殖率、EdU陽性細(xì)胞比例、侵襲數(shù)、劃痕面積愈合率均增加(P<0.05);sh-circRERE+miR-128-3p inhibitor組與sh-circRERE組比較,增殖率、EdU陽性細(xì)胞比例、侵襲數(shù)、劃痕面積愈合率均增加(P<0.05)(圖3,4,5)。

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group.

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group;Scale bar=200 μm.

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group.

2.4 CircRERE/miR-128-3p、miR-128-3p/WEE1靶向關(guān)系驗(yàn)證

ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-128-3p與circRERE、WEE1的結(jié)合位點(diǎn)(圖6A)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)中,circRERE-WT+miR-128-3p mimic組與circRERE-WT+mimic-NC組比較,熒光素酶活性下降(P<0.05);WEE1-WT+miR-128-3p mimic組與WEE1-WT+mimic-NC組比較,熒光素酶活性下降(P<0.05)(圖6B)。

A.binding sites prediction of miR-128-3p and circRERE or WEE1; B,C.double luciferase experiment confirmed the targeting relationship between miR-128-3p and circRERE(B) or between miR-128-3p and WEE1(C); *P<0.05 compared with mimic-NC.

3 討論

CircRNA的異常表達(dá)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用,被認(rèn)為是MM發(fā)病的關(guān)鍵因素[8]。CircRERE在MM組織和細(xì)胞中呈高表達(dá),且其能夠增強(qiáng)MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米的耐藥性,有望成為MM潛在的治療靶點(diǎn)[3]。在本研究中,circRERE在MM細(xì)胞中呈高表達(dá),敲低其表達(dá)可降低RPMI-8226細(xì)胞的增殖率、劃痕愈合率和侵襲細(xì)胞數(shù),表明circRERE可能作為一種促癌基因參與MM進(jìn)展,敲低circRERE可抑制RPMI-8226細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)結(jié)合以使其降解或抑制其翻譯,負(fù)調(diào)控下游靶標(biāo)的表達(dá),能夠影響增殖、凋亡、遷移等過程,與MM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9]。miR-128-3p為miRNA家族一員,在MM中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)能夠抑制MM進(jìn)展。在本研究中,miR-128-3p在MM細(xì)胞中呈低表達(dá),并且在MM細(xì)胞中抑制miR-128-3p表達(dá)會(huì)刺激細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,表明miR-128-3p在MM中作為抑癌基因發(fā)揮作用。

CircRNA主要通過發(fā)揮miRNA海綿的功能來調(diào)節(jié)基因表達(dá),從而調(diào)控腫瘤的生物學(xué)過程[10]。Circ_0000190通過調(diào)控miR-767-5p/MAPK4軸抑制MM的進(jìn)展[11];Circ_0007841通過介導(dǎo)miR-129-5p/JAG1軸增加MM細(xì)胞對(duì)硼替佐米的耐藥性[12]。為了探究circRERE在MM中的調(diào)控機(jī)制,本研究通過生物信息學(xué)工具、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)篩選并鑒定了circRERE的靶標(biāo)miRNA。結(jié)果顯示,miR-128-3p是circRERE的靶標(biāo);敲低circRERE表達(dá)后RPMI-8226細(xì)胞miR-128-3p表達(dá)增加,提示circRERE可能通過抑制miR-128-3p表達(dá)參與MM進(jìn)展。在敲低circRERE的同時(shí)下調(diào)miR-128-3p表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)miR-128-3p可明顯減弱敲低circRERE對(duì)RPMI-8226細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,證實(shí)敲低circRERE可上調(diào)miR-128-3p表達(dá),從而阻斷MM細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

WEE1是一個(gè)與細(xì)胞周期有關(guān)的基因,其能夠調(diào)控G2/M檢查點(diǎn)阻滯,為細(xì)胞在有絲分裂開始之前的受損DNA修復(fù)提供時(shí)間和條件,促進(jìn)包括MM在內(nèi)的多種癌的進(jìn)展,為MM潛在的治療靶點(diǎn)[13]。在本研究中,MM細(xì)胞系中WEE1表達(dá)的水平顯著升高,使用生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn),WEE1被預(yù)測(cè)和驗(yàn)證為miR-128-3p的靶標(biāo)。miR-128-3p能夠通過靶向調(diào)控WEE1而促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生存并增強(qiáng)其對(duì)替莫唑胺的耐藥性[7]。有報(bào)道指出在胃癌中miR-128-3p能夠通過調(diào)節(jié)CLDN18影響胃癌的侵襲和遷移[14]。本研究結(jié)果顯示,敲低miR-128-3p表達(dá)后RPMI-8226細(xì)胞WEE1表達(dá)增加,而敲低circRERE表達(dá)后RPMI-8226細(xì)胞miR-128-3p表達(dá)增加,WEE1表達(dá)減少,表明miR-128-3p可能通過靶向負(fù)調(diào)控WEE1表達(dá)而抑制RPMI-8226細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。這些提示敲低circRERE可能通過上調(diào)miR-128-3p,抑制WEE1表達(dá),促進(jìn)MM進(jìn)展。

綜上所述,敲低circRERE可能通過靶向上調(diào)miR-128-3p、下調(diào)WEE1抑制RPMI-8226細(xì)胞遷移、侵襲和增殖,為開發(fā)MM治療的有效靶點(diǎn)提供了參考依據(jù)。未來可采用更多的細(xì)胞系并結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circRERE在MM中的作用與分子機(jī)制。