陳衛(wèi)衛(wèi)，廖 煌，史振鴻，羅 穎

海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 心血管內科，海南 ?？?570216

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)主要表現(xiàn)為動脈壁纖維的脂肪病變,病程中伴隨慢性炎性反應,常導致心梗、中風等心血管疾病的發(fā)生,致死率、致殘率極高,是急需重視的疾病之一[1]。在大、中動脈內皮下內膜層血管中,阻塞斑塊的慢性積累會導致嚴重狹窄,血流受限,最終致組織缺氧[2]。包含巨噬細胞在內的多種細胞促進了AS的發(fā)生,其中巨噬細胞在動脈壁內積聚是導致AS的必要條件[3],是參與AS疾病進程的主要炎性細胞。疾病初始期由單核細胞向M1型分化,發(fā)揮清除膽固醇的同時,內化脂蛋白顆粒,發(fā)生泡沫化,伴隨炎性細胞因子、活性氧(reactive oxygen species,ROS)等的分泌[4],進一步促進AS的發(fā)展。巨噬細胞泡沫化是AS的關鍵病理特征,對AS疾病進程具有一定程度的影響,因此明確其泡沫化的分子機制,對AS的治療研究具有重要意義。

核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)被激活后,移位至巨噬細胞核內,參與下游多種脂質代謝靶基因的調控,進一步影響巨噬細胞的脂質代謝。4個半LIM結構域蛋白(four and a half LIM domains protein 2,FHL2)參與多條信號通路,調節(jié)AS、心律失常、心肌肥厚等疾病的發(fā)展,并與細胞的增殖、凋亡有關,能夠與TNF受體相關因子2(TRAF2)、TRAF4和TRAF6相互作用,這些因子是激活NF-κB信號通路的關鍵介質[5]。推測FHL2在動脈粥樣硬化中具有重要作用,但目前關于FHL2調節(jié)AS疾病發(fā)展的研究較少,因此有必要對此進行探討。本研究使用氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)誘導的巨噬細胞泡沫化模型,利用質粒上調或下調FHL2在細胞內的表達水平,研究FHL2影響巨噬細胞泡沫化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和PBS(Hyclone公司),ox-LDL(Solarbio公司),IL-6 ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒和TNF-α ELISA試劑盒(BD公司),BAY 11-7082、油紅O染色試劑盒和PMA(Beyotime公司),兔抗phospho-IκBα單克隆抗體、兔抗IκBα單克隆抗體、兔抗phospho-p65單克隆抗體和兔抗p65單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司),抗FHL2單克隆抗體(Abcam公司),THP-1(人單核細胞)(中國科學院細胞庫)。本研究所用質粒及siRNA由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:將THP-1細胞培養(yǎng)至匯合度達70%～80%后,將細胞傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。使用含100 ng/mL PMA的培養(yǎng)基刺激THP-1細胞,將其誘導為THP-1巨噬細胞。使用Lipo 2000,按說明書要求操作,將構建好的FHL2過表達質粒、FLH2小干擾RNA(si-FLH2)及相應的對照質粒和siRNA轉染至細胞中,之后換含50 μg/mL ox-LDL的培養(yǎng)基孵育細胞48 h,使其內化脂質轉化為THP-1泡沫細胞。將細胞分為對照組(control組);ox-LDL組;FHL2+ox-LDL組;si-FHL2+ox-LDL組。為明確FHL2緩解細胞泡沫化的機制增加BAY 11-7082+FHL2+ox-LDL組。

1.2.2 轉染基因表達的驗證:細胞轉染24 h后,提取細胞總蛋白,確定濃度后,加樣,利用SDS-PAGE膠分離,轉膜,5%脫脂奶粉封閉,洗3次,加入1∶1 000稀釋的一抗(FHL2)孵育過夜,洗3次,加入二抗,ECL顯色液顯色曝光,檢測FHL2的表達情況。

1.2.3 ELISA檢測細胞因子的分泌:收集各處理組細胞的培養(yǎng)上清,按要求處理樣品后,按照說明書所述操作,讀取A450數(shù)值。

1.2.4 油紅O染色檢測巨噬細胞泡沫化程度:取各組細胞,吸去細胞培養(yǎng)基,取適量染色洗滌液,覆蓋細胞20 s,棄掉洗滌液,加入油紅O染色工作液,染色15～20 min,洗滌液洗30 s,棄掉,加入PBS靜置30 s,棄掉后,在加入300 μL PBS,顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)。

1.2.5 Western blot檢測NF-κB的活化:本部分所用一抗為:p-IκBα、IκBα、p-p65、p65。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 成功誘導THP-1巨噬細胞

PMA刺激48 h后細胞呈不規(guī)則長梭形,有偽足且貼壁,形態(tài)特征與巨噬細胞吻合(圖1)。因此,成功誘導THP-1巨噬細胞用于后續(xù)實驗。

圖1 PMA誘導前后THP-1細胞形態(tài)Fig 1 Morphology of THP-1 cells after PMA treatment(n=3)

2.2 FHL2敲低及過表達細胞株構建

將FHL2質粒、si-FHL2轉染至誘導成功的細胞中,si-FHL2組FHL2蛋白表達較對照組明顯下降,FHL2組中上調(P<0.05)(圖2)。成功構建了敲低表達或過表達FHL2的細胞,可用于后續(xù)研究。

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

2.3 敲低FLH2能降低IL-6、IL-1β、TNF-α分泌水平

si-FHL2+ox-LDL組細胞IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平較ox-LDL組明顯降低,而ox-LDL組、FHL2+ox-LDL組細胞因子分泌水平與control組相比明顯上調(P<0.01),其中FHL2+ox-LDL組上調更為顯著(P<0.001)(圖3)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with control group; # P<0.01, # # P<0.001 compared with ox-LDL group.

2.4 FLH2表達下調緩解細胞泡沫化

與對照組相比,ox-LDL組細胞內脂滴較大且數(shù)量較多,FHL2+ox-LDL組泡沫化更為明顯,而si-FHL2+ox-LDL組細胞ox-LDL組、FHL2組相比,脂滴明顯減小、減少,泡沫化程度較輕(圖4)。

圖4 油紅O染色檢測泡沫化Fig 4 Detection of foaming by oil red O staining (n=3)

2.5 FLH2調節(jié)NF-κB信號通路的活化緩解細胞泡沫化

與對照組相比,ox-LDL組p-P65、p-IκBα表達水平顯著增加,其中FHL2+ox-LDL組上調更為顯著,而si-FHL2+ox-LDL組細胞則表現(xiàn)為表達水平降低(P<0.05)(圖5A)。與FHL2+ox-LDL組相比,BAY 11-7082+FHL2+ox-LDL組p-IκBα表達水平降低(圖5C)。與ox-LDL組相比,FHL2+ox-LDL組細胞泡沫化嚴重,而BAY 11-7082+FHL2+ox-LDL組與FHL2+ox-LDL組相較,泡沫化程度相對較輕(圖5B)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control; # P<0.05 compared with ox-LDL; ▲ P<0.001 compared with FHL2+ox-LDL.

3 討論

AS的主要特點表現(xiàn)為動脈脂質沉積,常伴有平滑肌細胞增殖,逐步形成硬化斑塊,炎癥幾乎參與了AS的所有階段,是AS起始和發(fā)展過程中生理病理變化的基礎[6],分為脂肪條狀、粥樣及復雜硬化斑塊、臨床病理并發(fā)癥等4個階段,復雜粥樣硬化斑塊的主要特征為泡沫細胞的積累[7]。泡沫細胞是巨噬細胞內化脂蛋白后,自身脂質代謝紊亂形成的。巨噬細胞是機體主要的免疫細胞之一,能夠分泌產(chǎn)生相關細胞因子,調節(jié)機體的炎性反應,進而影響AS的疾病進程[7]。

FHL蛋白由4個完整和一個半LIM結構域組成,屬于一個家族,包括FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和ACT,其中FHL1和FHL3主要在骨骼肌中表達,FHL2則主要在心臟中表達。FHL2是一種多功能的適配器蛋白,能與細胞表面受體、胞質適配器和結構蛋白、激酶和核轉錄因子相互作用,參與細胞的增殖、凋亡、黏附遷移及基因的表達[8],FHL2已被發(fā)現(xiàn)在心血管發(fā)育、AS、血管生成中發(fā)揮重要作用[9]。FHL2缺失的小鼠在高膽固醇飲食后,其AS病變較正常小鼠減輕[10];高脂飲食后ApoE/FHL2-/-小鼠AS斑塊較小,且巨噬細胞含量減少[11]。在本文中,通過在細胞中轉染si-FHL2,經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn)巨噬細胞的泡沫化程度減輕,相關炎性細胞因子的分泌也下調,緩解AS的發(fā)展。

NF-κB信號通路能調節(jié)巨噬細胞炎性反應,影響炎性因子的分泌。通常情況下,NF-κB信號通路中IκB與異二聚體結合,通路不被激活,當細胞被刺激后,IκB磷酸化降解,異二聚體轉移至胞質中,調節(jié)IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性細胞因子的分泌[12]。而IL-6、TNF-α、IL-1β均可對AS產(chǎn)生調節(jié)作用。通過抑制IL-6的信號轉導能夠減少AS的發(fā)生[13];雷洛昔芬通過抑制IL-6/STAT3信號通路抑制AS的發(fā)展[14]。TNF-α作為一種促AS細胞因子,敲除TNF-α、ApoE的小鼠AS減輕,炎癥標志物減少[15-16]。IL-1β被阻斷后,血液單核細胞的炎性反應減弱,進而AS斑塊減小[15]。因此在本研究中,通過ELISA檢測了這三種細胞因子的分泌情況,結果顯示轉染siFHL2后,IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌水平均下調。為進一步明確FHL2調節(jié)AS的機制,si-FHL2可以下調phospho-p65、phospho-IκBα的表達,NF-κB信號通路不被激活。且使用BAY 11-7082處理后,FHL2組細胞泡沫化程度相對減輕。綜上,下調FHL2的表達可以通過調節(jié)NF-κB信號通路的活化,下調IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌水平,緩解THP-1巨噬細胞泡沫化。本研究為AS的治療提供了新的思路,為明確FHL2在動脈硬化疾病中的潛在作用提供實驗依據(jù)。