郭 爽，李樹仁，趙 美，郝 瀟

1.河北醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院，河北 石家莊 050011；2.河北省人民醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 石家莊 050057

房顫介導(dǎo)心肌病(atrial fibrillation mediated cardiomyopathy,AMC)指由于陣發(fā)或持續(xù)性心房顫動(atrial fibrillation,AF)引起的心房或心室的擴張、收縮與舒張功能受損,最終發(fā)展為心力衰竭(heart failure,HF),當恢復(fù)竇性心律或心室率得到嚴格控制時,心臟擴大與心衰能夠迅速、甚至完全逆轉(zhuǎn)[1]。臨床中AMC的發(fā)病率并不低,早期診斷干預(yù)可以明顯改善患者預(yù)后。AMC病理過程中發(fā)生不同程度的的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)[2]。

連接蛋白2(junctophilin2,JP2)是介導(dǎo)細胞膜上的L型鈣通道(L-type calcium channel,LTCC)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR)上的蘭尼堿受體(ryanodine receptor2,RyR2)的相互作用的一種連接蛋白,使LTCC與SR保持穩(wěn)定的距離,促進興奮-收縮耦聯(lián)的發(fā)生[3]。JP2在不同病因的心肌病(如擴張性心肌病,缺血性心肌病)中均表達下降[4-5],但目前還沒有研究其在心律失常性心肌病中的表達情況。成纖維生長因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)則在AF和HF的纖維化過程中發(fā)揮著重要作用,FGF23通過增加活性氧并隨后激活STAT3和SMAD3信號轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)房顫患者的心房纖維化[6]。

A.before pacing; B.after establishment of AMC model

因此通過構(gòu)建AMC實驗?zāi)Ｐ?探討電重構(gòu)蛋白—JP2與結(jié)構(gòu)重構(gòu)蛋白—FGF23表達水平的變化,探究AMC的機制,可為臨床AMC的早期診斷與治療提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:普通級雄性新西蘭大白兔(河北省望都縣彤輝養(yǎng)殖有限公司),體質(zhì)量2.5～3 kg,許可證號[SCXK(冀)2016-002]。實驗動物均于河北省人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心動物室單籠飼養(yǎng),室溫(17±3)℃,攝水攝食不限。本研究經(jīng)過河北省人民醫(yī)院動物倫理委員會審查(2023科研倫審第40號)。

1.1.2 主要試劑:水合氯醛和青霉素鈉(華北制藥有限公司),山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗、FGF23 抗體和JP2抗體(Bioss)、兔FGF23試劑盒和兔連接蛋白2 ELISA試劑盒(江蘇晶美生物技術(shù)有限公司)、總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,DP439)。

1.2 方法

1.2.1 兔的分組及處理:將兔分為對照組(control)和房顫介導(dǎo)心肌病模型組,4周后射血分數(shù)下降≤10%者納入AF組,射血分數(shù)下降>10%者納入AMC組。通過左心房電極快速起搏法構(gòu)建房顫介導(dǎo)心肌病動物模型,起搏器起搏模式為AOO,起搏頻率600 beats/min,刺激時程(0.25±0.01)ms,輸出電壓≥5 V,每日描記標準肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖以確保起搏器正常工作,當記錄到房顫心電圖,持續(xù)時間≥1 min,即認為房顫建模成功。對照組只植入起搏器但不起搏。

1.2.2 超聲心動圖檢查:分別于手術(shù)前后對各組動物行超聲心動圖檢查,測定左心房內(nèi)徑(left atrial diameter,LAD),左室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF),左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD)、主動脈、室間隔、左室后壁、右心房內(nèi)徑(right atrial diameter,RAD)、右心室內(nèi)徑(right ventricular diameter,RVD)等超聲指標。以上各測量值均取連續(xù)3次測量的平均值(圖1)。

1.2.3 RT-qPCR檢測各組目的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄:用石蠟包埋組織切片總RNA提取試劑進行樣本RNA提取,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進行PCR擴增,擴增條件:95 ℃ 30 s 預(yù)變性,95 ℃ 5 s變性,60 ℃ 40 s退火延伸,40個循環(huán),目的基因引物序列:FGF23上游引物5′-CAGAGCCTATCCCA ATGCCTC-3′,FGF23下游引物5′-GGCACTGTAGAT GGTCTGATGG-3′,JP2上游引物5′-ACTCTGGCTC CTGGAACTTTG-3′,JP2下游引物5′-GCGCCCCTTG GTCTCTATG-3′。實驗重復(fù)3次,根據(jù)Ct值,按照2-△△Ct相對定量計算公式計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果。

1.2.4 Western Blot檢測心肌組織蛋白表達:使用RIPA細胞裂解液提取蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,根據(jù)上樣量進行濃度調(diào)平,100 ℃煮沸10 min進行蛋白變性,將蛋白上樣并進行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上進行轉(zhuǎn)膜,TBST洗滌1次5 min,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,在脫色搖床上孵育一抗,一抗孵育條件:FGF23抗體(1∶1 000,4 ℃過夜),JP2抗體(1∶1 000,4 ℃過夜),ACTB抗體(1∶5 000,4 ℃過夜)。TBST洗膜3次,各10 min,室溫孵育二抗1 h,TBST洗膜3 次,各45 min,ECL法顯影成像,用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標條帶的吸光度值。

1.2.5 ELISA檢測血清JP2、FGF23水平:從各組兔耳緣靜脈取血3～4 mL,離心后取血清凍存于-80 ℃冰箱中保存,根據(jù)兔FGF23 ELISA試劑盒和兔JP2 ELISA試劑盒的操作步驟檢測血清JP2、FGF23水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 超聲心動圖比較

與對照組相比,AMC 組LAD、RAD、RVD增加,LVEF降低,與AF組相比,AMC組LVEF降低,主動脈和RVD增加(表1)。

表1 各組超聲心動圖指標Table 1 Echocardiographic indexes in each

2.2 各組JP2、FGF23基因轉(zhuǎn)錄變化

與對照組相比,AF組FGF23和JP2目的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄增加(P<0.001),AMC組JP2 mRNA轉(zhuǎn)錄降低(P<0.001)。與AF組相比,AMC組FGF23和JP2目的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄降低(圖2)。

*P<0.05 compared with control group;# P<0.05 compared with AF group.

2.3 各組JP2、FGF23蛋白表達變化

與對照組相比,AF組FGF23(P<0.001)和JP2(P<0.01)的表達明顯增加,AMC組JP2表達明顯降低(P<0.001)。與AF組相比,AMC組FGF23和JP2表達下降(圖3,4)。

圖3 Western blot檢測表達心肌組織蛋白Fig 3 Western blot assay of protein expression in myocardial tissues

*P<0.05 compared with control group;# P<0.05 compared with AF group.

2.4 各組血漿JP2、FGF23水平變化

與對照組相比,AF組FGF23和JP2血漿濃度升高,AMC組FGF23水平升高。與AF組相比,AMC組FGF23和JP2血漿濃度偏低(表2)。

表2 血漿JP2、FGF23濃度Table 2 Serum concentration of JP2 and

3 討論

房顫介導(dǎo)心肌病(AMC)是一種繼發(fā)于房顫的在當今的臨床實踐中其發(fā)病率可能被低估,了解AMC的發(fā)病機制十分重要。

JP2是一個由696個氨基酸組成的蛋白質(zhì),其N末端作用于心肌細胞質(zhì)膜,C端嵌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,使兩者之間保持一定的距離,JP2對維持心肌正常的興奮-收縮功能起著至關(guān)重要的作用[7]。JP2不僅可以維持LTCC與RyR2受體的緊密連接,還使處于關(guān)閉狀態(tài)的RyR2受體更加穩(wěn)定。JP2基因敲除小心肌病,最初為特發(fā)性AF患者,因AF長期控制不佳而繼發(fā)性引起心房、心室的擴大,最終發(fā)展為房顫介導(dǎo)心肌病,診斷時需具備兩個條件:1)排除患者有引起心室擴大、心衰的其他病因;2)竇律恢復(fù)并維持時(包括心室率得到嚴格控制),心臟擴大與心衰得到完全性或幾乎完全性逆轉(zhuǎn)[1]。因此對于AMC的診斷是“回顧性”的,鼠表現(xiàn)為明顯的膜連接復(fù)合體(junction membrane complex,JMC)紊亂,更易發(fā)生HF[8-9]。本文研究了JP2在AMC中的表達變化,發(fā)現(xiàn)JP2在AMC中的表達下降。然而,在房顫組中,JP2表達增加。有研究表示JP2表達下降會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泄漏,心肌細胞中自發(fā)Ca2+火花頻率增加[10]。但起搏刺激JP2過度表達的心肌細胞,結(jié)果顯示鈣電流峰值和鈣泄漏頻率更高[11]。因此,JP2的高表達和低表達都會破壞細胞內(nèi)的鈣平衡進而導(dǎo)致心律失常。在代償期的心肌病動物模型中,心肌細胞T小管的體積和表面積都會增加。相反,在心肌肥厚或心力衰竭模型中,其體積和表面積則會減少[12]。由于JP2與T小管共同定位,推測JP2在快速起搏下代償性增加,最終進入失代償期,此時JP2 表達減少,心肌收縮力下降,HF發(fā)生。此外,在一個JP2過度表達模型中發(fā)現(xiàn),RyR2簇的大小增加,但興奮性趨于穩(wěn)定[13]。因此,JP2與RyR2的比例可能比JP2本身的表達對疾病的發(fā)展更有價值。

FGF23在AF的纖維化過程中發(fā)揮著重要作用[14],本文同樣發(fā)現(xiàn)AF組FGF23表達明顯增加,當發(fā)生射血分數(shù)下降時,FGF23的表達相對減少。有研究表示FGF23與左室功能獨立相關(guān)[15]。另外FGF23可能受心律失常的影響而有不同的作用機制,成纖維細胞生長因子可以直接作用于心肌Na+通道、Ca2+通道[16],房顫時心肌細胞發(fā)生鈣重構(gòu),離子通道改變,進而影響FGF23發(fā)揮作用,期待未來大規(guī)模的基礎(chǔ)及臨床研究進行探索。

本研究的一個局限是沒有評估JP2與RyR2的比值,這使無法對膜連接復(fù)合體做出全面的說明。動物試驗樣本量較小,可能導(dǎo)致統(tǒng)計分析不充分或有偏差。此外,由于時間限制,動物試驗產(chǎn)生的短期效應(yīng)可能不同于長期效應(yīng),因此在解釋結(jié)果是否適用于臨床時必須謹慎。

綜上所述,在AMC動物模型中,FGF23表達增加,JP2表達下降。這些發(fā)現(xiàn)可能為開發(fā)針對JP2的抗房顫藥物開辟新的途徑,同時為AMC的發(fā)病機制與診斷研究提供方向。