張秀麗，胡孝剛，莫 俊，陳 鈴*

麗水市第二人民醫(yī)院 1.老年呼吸及重癥醫(yī)學(xué)科；2.老年精神科，浙江 麗水 323000

動脈粥樣硬化斑塊是一種高危斑塊,易破裂形成血栓,導(dǎo)致急性心腦血管事件的發(fā)生,以及進(jìn)一步的臨床不良事件,如急性心肌梗死、心臟驟停、急性腦梗死等[1]。大量研究表明,氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)可以調(diào)節(jié)斑塊進(jìn)展[2]。因此,開發(fā)新的藥物抑制氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)對于治療動脈粥樣硬化斑塊具有重要意義。冠心寧片(Guanxinning tablets)是一種由丹參和川芎組成的傳統(tǒng)中藥復(fù)方制劑。已有研究顯示,冠心寧聯(lián)合氯吡格雷、阿司匹林在治療冠狀動脈粥樣硬化斑塊上可以明顯減輕患者的臨床癥狀[3]。但冠心寧片對動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響鮮有報道。相關(guān)研究顯示,抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路可降低ApoE-/-小鼠粥樣硬化斑塊面積[4]。但冠心寧片能否通過調(diào)控Wnt/β-catenin通路抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激進(jìn)而改善大鼠頸動脈粥樣硬化斑塊尚不明確。因此,本研究主要探究冠心寧片對動脈粥樣硬化斑塊形成過程中的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物:96只,8周齡,體質(zhì)量310～320 g,SPF級雄性SD大鼠[廣東藍(lán)島生物技術(shù)有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2019-0010]。本研究獲得本院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑:冠心寧片(0.38 g,正大青春寶藥業(yè)有限公司);阿托伐他汀(atorvastatin)(輝瑞制藥有限公司);維生素D3注射液(海南豪創(chuàng)藥業(yè)有限公司);氯化鋰(lithiumchloridemonohydrate,LiCl)(Wnt/β-catenin信號通路激活劑,上海偉寰生物科技有限公司);大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(high-sensitive C-reactive protein,hs-CRP)以及單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)ELISA檢測試劑盒(上海富雨生物科技有限公司);大鼠氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoproteins,ox-LDL)、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)試劑盒(上海白益生物公司);兔源抗Wnt3a、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(marix metalloproteinase-9,MMP-9)、β-catenin、GAPDH一抗及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物的分組及處理:將大鼠分為對照組(control)、模型組(model,多次注射維生素D3+高脂飼料飼養(yǎng)+液氮冷凍右側(cè)勁總動脈+多次注射異種蛋白的方式構(gòu)建頸動脈粥樣硬化斑塊模型[5])、冠心寧片低、中和高劑量干預(yù)模型組(分別灌胃150、300和600 mg/kg冠心寧片[6])、阿托伐他汀組(灌胃2 mg/kg阿托伐他汀[7])、LiCl組(尾靜脈注射15 mg/kg LiCl[8])、冠心寧片高劑量(600 mg/kg)+LiCl(尾靜脈注射15 mg/kg LiCl)組,每組12只,1次/d,持續(xù)8周。

1.2.2 標(biāo)本收集:末次處理24 h后,收集血清和右側(cè)頸總動脈。

1.2.3 大鼠血脂含量的檢測:利用Olympus Au2700全自動生化分析儀檢測大鼠血清中總膽固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、三酰甘油(triglyceride,TG)以及低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的含量。

1.2.4 ELISA檢測大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量:嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量。

1.2.5 大鼠血清中ox-LDL、MDA含量的檢測:按照試劑盒說明書利用分光光度法檢測大鼠血清中ox-LDL、MDA含量。

1.2.6 HE染色檢測頸總動脈病理:將頸總動脈包埋在石蠟中后切成4 μm厚的切片,再進(jìn)行HE染色,觀察頸總動脈的病理變化情況,并用圖像分析儀測量斑塊面積及動脈總面積,最后統(tǒng)計斑塊總面積/動脈總面積的值的變化。

1.2.7 頸總動脈中Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表達(dá)的Western blot檢測:RIPA裂解液提取頸總動脈總蛋白。取35 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉一系列操作后,再在4 ℃下將膜與一抗Wnt3a(1∶3 000)、MMP-9(1∶2 000)、GAPDH(1∶3 000)、β-catenin(1∶3 000)孵育過夜。再與二抗(1∶4 000)孵育1 h。用ECL試劑檢測蛋白印跡,Image J軟件計算蛋白吸光度值(A值)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 冠心寧片對各組大鼠血脂含量的影響

模型組血清中HDL含量低于對照組,TG、LDL、TC含量高于對照組(P<0.05);與模型組相比,冠心寧片低、中、高劑量組以及阿托伐他汀組HDL含量升高,TG、LDL、TC含量降低,且冠心寧片呈劑量依賴性(P<0.05);與模型組相比,LiCl組HDL含量降低,TG、LDL、TC含量升高(P<0.05);與冠心寧片高劑量組相比,冠心寧片高劑量+LiCl組HDL含量降低,TG、LDL、TC含量升高,(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠血清中TG、TC、HDL、LDL含量比較Table 1 Comparison of TG, TC, HDL and LDL levels in serum of rats in each mmol/L, n=12)

2.2 冠心寧片對各組大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量的影響

模型組MCP-1、hs-CRP含量高于對照組(P<0.05);冠心寧片低、中、高劑量組以及阿托伐他汀組MCP-1、hs-CRP含量低于模型組,且冠心寧片呈劑量依賴性(P<0.05);LiCl組MCP-1、hs-CRP含量高于模型組(P<0.05);冠心寧片高劑量+LiCl組MCP-1、hs-CRP含量高于冠心寧片高劑量組(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠血清中MCP-1、hs-CRP含量比較

2.3 冠心寧片對各組大鼠血清中ox-LDL、MDA含量的影響

模型組ox-LDL、MDA含量高于對照組(P<0.05);冠心寧片低、中、高劑量組以及阿托伐他汀組ox-LDL、MDA含量低于模型組,且冠心寧片呈劑量依賴性(P<0.05);LiCl組ox-LDL、MDA含量高于模型組(P<0.05);冠心寧片高劑量+LiCl組ox-LDL、MDA含量高于冠心寧片高劑量組(P<0.05)(表3)。

表3 各組大鼠血清中ox-LDL、MDA含量比較

2.4 冠心寧片對各組大鼠頸總動脈病理變化的影響

對照組大鼠動脈內(nèi)壁光滑,無斑塊形成;模型組大鼠動脈管內(nèi)壁可見大量斑塊附著;與模型組比較,冠心寧片低、中、高劑量組、阿托伐他汀組斑塊總面積/動脈總面積減小,且冠心寧片呈劑量依賴性(P<0.05);LiCl組斑塊總面積/動脈總面積高于模型組(P<0.05);冠心寧片高劑量+LiCl組斑塊總面積/動脈總面積高于冠心寧片高劑量組(P<0.05)(圖1,表4)。

Arrows indicate plaques.

表4 各組大鼠斑塊總面積/動脈總面積比較

2.5 冠心寧片對各組大鼠頸總動脈中MMP-9蛋白及Wnt/β-catenin通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

模型組Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表達(dá)高于對照組(P<0.05);冠心寧片低、中、高劑量組以及阿托伐他汀組頸總動脈中Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表達(dá)低于模型組,且冠心寧片呈劑量依賴性(P<0.055);LiCl組Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表達(dá)高于模型組(P<0.05);冠心寧片高劑量+LiCl組頸總動脈中Wnt3a、MMP-9、β-catenin蛋白表達(dá)高于冠心寧片高劑量組(P<0.05)(圖2,表5)。

A.control; B.model; C.Guanxinning tablets (150 mg/kg); D.Guanxinning tablets (300 mg/kg); E.Guanxinning tablets (600 mg/kg); F.atorvastatin; G.LiCl; H.Guanxinning tablets (600 mg/kg)+LiCl.

表5 各組大鼠頸總動脈中MMP-9、Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)比較

3 討論

動脈粥樣硬化斑塊是由動脈內(nèi)膜內(nèi)脂質(zhì)沉積、炎性因子激活和氧化應(yīng)激增強(qiáng)而形成的。據(jù)報道,動脈粥樣硬化中的血脂異常以HDL降低和TG、TC和LDL升高為特征[9]。在斑塊破裂階段,MCP-1通過增厚內(nèi)膜等過程促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展[10];降低炎性因子hs-CRP含量可抑制ApoE(-/-)小鼠的動脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展[11];活性氧能夠氧化和修飾ox-LDL,進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及動脈粥樣硬化斑塊形成[12];MMP-9可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白降解,其表達(dá)和活性與斑塊進(jìn)展和隨之而來的心血管并發(fā)癥事件密切相關(guān)[13]。本研究顯示,與對照組比較,模型組大鼠血清中TG、TC、LDL含量、MCP-1、hs-CRP含量、ox-LDL、MDA含量升高,HDL含量降低,大鼠頸總動脈中MMP-9蛋白表達(dá)升高,大鼠斑塊總面積/動脈總面積增大,表明血脂異常、氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)參與了大鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。

冠心寧片是由丹參、川芎構(gòu)成的一種植物藥,據(jù)報道,冠心寧片可減輕西藏小型豬冠狀動脈粥樣硬化[14]。本研究顯示,冠心寧片可呈劑量依賴性地抑制動脈粥樣硬化斑塊大鼠氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng),提示冠心寧片可能成為治療動脈粥樣硬化斑塊的潛在有效藥物。Wnt/β-catenin信號通路的紊亂經(jīng)常會導(dǎo)致各種嚴(yán)重疾病,抑制Wnt/β-catenin信號通路可改善大鼠動脈粥樣硬化[15]。本研究發(fā)現(xiàn),與模型組比較,LiCl組大鼠頸總動脈中Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)升高,大鼠斑塊總面積/動脈總面積增大,氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)增強(qiáng),且LiCl為Wnt/β-catenin信號通路激活劑,表明Wnt/β-catenin信號通路確實(shí)參與了大鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成。此外,冠心寧片可下調(diào)模型大鼠頸總動脈中β-catenin、Wnt3a蛋白表達(dá),且下調(diào)作用呈劑量依賴性,這就促使研究者猜測冠心寧片抑制大鼠動脈粥樣硬化斑塊的形成的機(jī)制可能與阻斷Wnt/β-catenin通路有關(guān)。為了探究上述猜想是否與實(shí)際情況一致,本實(shí)驗用高劑量冠心寧片和Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl同時處理模型大鼠,結(jié)果顯示,LiCl逆轉(zhuǎn)了高劑量冠心寧片對模型大鼠氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)的抑制作用。

綜上所述,冠心寧片影響大鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的機(jī)制可能與調(diào)控Wnt/β-catenin通路有關(guān)。