盧慧瑩，王建國(guó)

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，河南 新鄉(xiāng) 453002

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一種原發(fā)性肝癌,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示[1],中國(guó)肝癌死亡率約占世界的1/2,嚴(yán)重威脅患者的生命健康。研究發(fā)現(xiàn)[2],腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為與表觀穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān),其中RNA等動(dòng)態(tài)化學(xué)修飾是表觀調(diào)控的前沿領(lǐng)域。脂肪質(zhì)量和肥胖相關(guān)(fat mass and obesity associated,FTO)蛋白是N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)的去甲基化酶,可調(diào)控m6A修飾的水平并和m6A甲基轉(zhuǎn)移酶共同作用,進(jìn)而維持體內(nèi)m6A甲基化修飾的動(dòng)態(tài)平衡[3]。研究發(fā)現(xiàn)[4],FTO在宮頸癌、乳腺癌等腫瘤中有癌基因的功能,在肝內(nèi)膽管癌、卵巢癌、腎癌等中有抑癌基因的作用,但目前在肝細(xì)胞癌中的報(bào)道較少。叉頭盒蛋白O1(forkhead box protein O1,FoxO1)是叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族一個(gè)關(guān)鍵成員,其通過(guò)減少癌細(xì)胞的過(guò)度增殖來(lái)抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄活性,從而參與了早期惡性腫瘤的形成和發(fā)展。FoxO1還能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的分化,并降低其異型性水平。目前已有研究發(fā)現(xiàn)[5],FoxO1的表達(dá)缺失與肝細(xì)胞癌的臨床分期進(jìn)展或癌細(xì)胞形態(tài)的改變密切相關(guān),且在FTO抑制人肝細(xì)胞癌增殖中的作用研究較少。因此,本研究旨探究m6A去甲基化酶FTO在肝細(xì)胞癌中的表達(dá),及能否調(diào)控FoxO1,影響肝細(xì)胞癌增殖。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系:人肝癌細(xì)胞系HepG2、正常肝細(xì)胞系HL7702(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))。

1.1.2 試劑:胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司);DMEM培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich公司);FTO干擾RNA(si-FTO)、FTO過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(FTO Over-expression)(上海生工生物工程有限公司);FoxO1抗體(Abcam公司);FoxO1干擾RNA(si-FoxO1)(瑞博生物公司);EpiQuik m6A RNA(甲基化定量檢測(cè)試劑盒)(Epigentek公司);annexinV-FITC凋亡試劑盒、CCK-8試劑盒(南京凱基生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 從基因庫(kù)檢測(cè)患者生存期:于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載并整理(TCGA-GOAD)項(xiàng)目的STAR流程的RNAseq數(shù)據(jù),其中Ⅱ期肝癌患者120例,Ⅲ期肝癌患者189例,提取臨床數(shù)據(jù)。用R語(yǔ)言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,從而比較不同組織表達(dá)的差異水平。使用ggplot2包的視化呈現(xiàn)結(jié)果。再使用R語(yǔ)言進(jìn)行比例風(fēng)險(xiǎn)假設(shè)檢驗(yàn),并進(jìn)行擬合生存回歸,分析不同蛋白表達(dá)患者的生存預(yù)后情況。最后,使用Logrank檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估差異的統(tǒng)計(jì)顯著性。

A.TGGA whole survival analysis; B.TCGA Grade Ⅱ survival analysis; C.TCGA Grade Ⅲ survival analysis.

A.comparison of FTO relative expression between HepG2 cells and HL7702 cells; B.comparison of FTO relative expression of each group in HepG2 cells;*P<0.05 compared with HL7702 or control;# P<0.05 compared with si-FTO.

1.2.2 細(xì)胞的分組及處理:取對(duì)數(shù)的HepG2細(xì)胞,根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū),分別采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,將轉(zhuǎn)染FTO Overexpression質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為FTO組,將轉(zhuǎn)染si-FTO的細(xì)胞設(shè)為si-FTO組,將同時(shí)轉(zhuǎn)染si-FTO+si-FoxO1的細(xì)胞設(shè)為si-FTO+si-FoxO1組,將轉(zhuǎn)染空載體或質(zhì)粒的細(xì)胞設(shè)為對(duì)照組。每組6個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞中FTO表達(dá):用TRIzol裂解液裂解HepG2細(xì)胞,提取細(xì)胞中總RNA,并測(cè)定濃度,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),反轉(zhuǎn)錄總RNA為cDNA,后進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列表見(jiàn)表1。分別取0.5 μL上游引物和0.5 μL下游引物,6 μL SYBR Green Mix,2 μL cDNA,后加入6 μL ddH2O,保證總反應(yīng)體系為15 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性60 s,95 ℃預(yù)變性15 s,65 ℃退火10 s,72 ℃延伸15 s,共40個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法分析相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequencee

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖:每組HepG2細(xì)胞以1.5×104個(gè)/mL濃度接種于96孔板中,培養(yǎng)孔板于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中,24 h后在每孔中分別加入100 μL的CCK-8溶液培養(yǎng)24、48、72 h,后培養(yǎng)細(xì)胞于37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱3.5 h,后將孔板置于酶標(biāo)儀上,于450 nm處測(cè)定OD值。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞侵襲:每組HepG2細(xì)胞以1.5×104個(gè)/mL密度接種于96孔板中,在Transwell上室中平鋪Matrigel膠,在下室加入每組HepG2細(xì)胞懸液200 μL,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,24 h擦掉上室中殘留的基質(zhì)膠,將小室固定于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛溶液中,10 min后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的結(jié)晶紫染色10 min,顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲數(shù)目。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡:取處于對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞,按照1.5×104個(gè)/mL接種細(xì)胞于96孔板中培養(yǎng)24 h;分別將1× binding buffer,10 μL annexin V和20 μL PI加入到96孔板中;棄掉原有的培養(yǎng)基,加入配制好的annexin V/PI染色工作液,于常規(guī)培養(yǎng)箱孵育孔板。將胰蛋白酶裂解液分別加入到孔板的每孔中,裂解細(xì)胞呈懸液后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 Dot blot檢測(cè)m6A甲基化水平:在細(xì)胞中加入Trizol裂解液,提取細(xì)胞中總RNA,用mRNA純化試劑盒分離mRNA。Nano Drop定量mRNA,于95 ℃變性5 min,后置于冰上。取200 ng的mRNA上樣固定在Biodot微孔過(guò)濾儀的尼龍膜上,自然風(fēng)干后取下尼龍膜置于平皿中,用紫外線交聯(lián),從而使mRNA和尼龍膜能較好的結(jié)合,亞甲藍(lán)染液染色細(xì)胞后將浮色用雙氧水洗去,拍照后將其作為內(nèi)參。用5%脫脂奶粉封閉膜2 h,后將其與m6A抗體(1∶1 000)一起在4 ℃孵育過(guò)夜。清洗尼龍膜后加入山羊抗兔IgG二抗,在常溫環(huán)境下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)得到m6A點(diǎn)印跡圖像。

1.2.8 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中FoxO1蛋白表達(dá):用BCA法測(cè)定各組細(xì)胞中總蛋白質(zhì)濃度。將終濃度為2 μg/mL的蛋白質(zhì)樣品煮沸,10 min后冷凍于-20 ℃冰箱。取蛋白上樣50 μg,將上樣緩沖液加入到蛋白質(zhì)樣品中煮沸,將變性的蛋白質(zhì)樣品用SDS-PAGE分離,后轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)樣品于PVDF膜上,加入脫脂牛奶(5%)封閉PVDF膜,1 h后用TBST溶液清洗PVDF膜,將CKS1B的一抗(1∶1 000)添加到反應(yīng)液中,并在4 ℃的環(huán)境中,避光條件下過(guò)夜孵育。隨后,將二抗(1∶5 000)加入反應(yīng)液中并繼續(xù)孵育2 h。使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影和曝光,并使用Image Lab軟件對(duì)各蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FTO低表達(dá)提示肝癌不良預(yù)后

肝細(xì)胞癌中FTO高表達(dá)患者的生存期較短(HR=1.476,P<0.05)。同時(shí)通過(guò)篩選出120例Ⅱ期肝癌患者和189例Ⅲ期肝癌患者的生存分析,結(jié)果同樣顯示FTO高表達(dá)患者生存期更短(Ⅱ期HR=1.58;Ⅲ期HR=1.71,P<0.05)(圖1)。

2.2 各組細(xì)胞中FTO相對(duì)表達(dá)量比較

與HL7702細(xì)胞相比,HepG2細(xì)胞中FTO表達(dá)明顯升高(P<0.05)(圖2A)。和對(duì)照組相比,si-FTO組細(xì)胞中FTO相對(duì)表達(dá)量明顯降低,FTO組細(xì)胞中FTO相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05);和si-FTO組相比,si-FTO+si-FoxO1組細(xì)胞中FTO相對(duì)表達(dá)量明顯升高(P<0.05)(圖2B)。

2.3 各組細(xì)胞增殖能力比較

si-FTO組細(xì)胞活性低于對(duì)照組,FTO組細(xì)胞活性高于對(duì)照組(P<0.05);和si-FTO組相比,si-FTO+si-FoxO1組細(xì)胞活性明顯升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control;# P<0.05 compared with si-FTO.

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較

和對(duì)照組相比,si-FTO組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯降低,FTO組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加(P<0.05);si-FTO+si-FoxO1組細(xì)胞侵襲數(shù)目較si-FTO組明顯升高(P<0.05)(圖4)。

A.cell crystal violet staining; B.compare the number of cell invasions;*P<0.05 compared with control;# P<0.05 compared with si-FTO.

A.flow cytometry was used to detect cell apoptosis; B.comparison of cell apoptosis rates;*P<0.05 compared with control;# P<0.05 compared with si-FTO.

A.comparison of relative levels of m6A in cells; B.Western blot assay of FoxO1 protein in cells; C.comparison of FoxO1 protein expression in cells;*P<0.05 compared with control;# P<0.05 compared with si-FTO.

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

和對(duì)照組相比,si-FTO組細(xì)胞凋亡率明顯增加,FTO組細(xì)胞凋亡率明降低(P<0.05);si-FTO+si-FoxO1組細(xì)胞凋亡率較si-FTO組明顯降低(P<0.05)(圖5)。

2.6 各組細(xì)胞m6A甲基化水平和FoxO1蛋白表達(dá)比較

和對(duì)照組相比,FTO組細(xì)胞中m6A相對(duì)表達(dá)量明顯升高,FoxO1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);si-FTO組細(xì)胞中m6A相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,FoxO1蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05);和FTO組相比,FTO+si-FoxO1組細(xì)胞中m6A相對(duì)表達(dá)量明顯升高,FoxO1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)(圖6)。

3 討論

N6-甲基腺嘌呤(m6A)修飾酶在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中具有關(guān)鍵的作用,但m6A相關(guān)修飾酶是否可以作為腫瘤的診斷標(biāo)志物還需深入探究[6]。FTO是一種常見(jiàn)的去甲基化酶,在m6A修飾中起著重要作用,其主要功能是將帶有m6A修飾的堿基進(jìn)行去甲基化修飾。FTO基因敲除可增強(qiáng)m6A甲基化水平,反之上調(diào)FTO可抑制其甲基化水平。研究發(fā)現(xiàn)[7],FTO可參與多種病理生理過(guò)程,如RNA的修飾、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯等。胃癌組織中FTO呈高表達(dá),其對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移可發(fā)揮促進(jìn)作用,進(jìn)而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[8];m6A去甲基化酶FTO的蛋白在胃癌患者中低表達(dá),與患者生存期縮短密切相關(guān),其可介導(dǎo)胃癌發(fā)生發(fā)展[9];敲減FTO表達(dá)可抑制肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲,反之,過(guò)表達(dá)FTO可對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌的惡性程度發(fā)揮促進(jìn)作用[10]。基于以上研究猜測(cè),FTO在腫瘤中可能發(fā)揮促癌作用。本研究結(jié)果顯示,肝細(xì)胞癌中FTO表達(dá)明顯升高,FTO可能是肝癌進(jìn)展中的促進(jìn)因素,但關(guān)于FTO如何調(diào)節(jié)肝癌進(jìn)展還需進(jìn)一步探究。

FoxO1作為一種轉(zhuǎn)錄因子,在多種組織器官中均廣泛表達(dá),可介導(dǎo)多種生物學(xué)過(guò)程,如細(xì)胞凋亡、DNA損傷修復(fù)等。FoxO1在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯降低,如肝癌、乳腺癌等,可發(fā)揮抑制作用[11];FoxO1在肝癌中表達(dá)明顯降低,低表達(dá)FoxO1可增加肝癌的風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)[12]。三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)可通過(guò)增加細(xì)胞中FoxO1表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移發(fā)揮抑制作用,對(duì)細(xì)胞周期停滯于G0/G1期和細(xì)胞凋亡發(fā)揮促進(jìn)作用[13]。本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)FTO可抑制肝癌細(xì)胞中FoxO1蛋白表達(dá),抑制FTO可增加肝癌細(xì)胞中FoxO1表達(dá), 因此推測(cè)抑制FTO可能通過(guò)增加肝癌細(xì)胞中FoxO1表達(dá)而對(duì)肝癌細(xì)胞活性發(fā)揮調(diào)控作用。為驗(yàn)證這一猜想,本研究采用si-FTO和si-FoxO1共同轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中, 結(jié)果顯示,敲減FoxO1可減弱低表達(dá)FTO對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用,并促進(jìn)對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述,高表達(dá)FTO與臨床預(yù)后較差相關(guān),FTO基因敲除可抑制肝細(xì)胞癌的增殖和侵襲,誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌的凋亡,其作用機(jī)制可能和調(diào)控FoxO1表達(dá)有關(guān)。另外,本研究設(shè)置陰性對(duì)照尚不充分,可能使實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的局限性,在今后的研究中會(huì)增加相關(guān)陰性對(duì)照,為臨床治療肝癌提供更可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。