王左鈺，周 陽，楊俊偉

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 腎臟病中心，南京 210003

礦物質(zhì)和骨異常(mineral and bone disorder,MBD)是影響慢性腎臟病患者生存的重要并發(fā)癥之一[1-2]。骨骼不僅是支撐人體的結(jié)構(gòu)組織,還具備調(diào)控機體鈣磷代謝的作用,骨異常在慢性腎臟病鈣磷平衡中的影響日益?zhèn)涫苤匾?。成骨細胞是骨骼的主要成分之?參與骨吸收與重建的同時,受到諸如力量負荷、炎性反應(yīng)、激素和電解質(zhì)等因素的影響,還可經(jīng)旁分泌途徑影響肌肉、心血管和腎臟等器官的結(jié)構(gòu)與功能[3-6]。因此,研究成骨細胞生物學(xué)特性及影響因素將有助于闡明慢性腎臟病礦物質(zhì)和骨異常(chronic kidney disease-mineral and bone disorder,CKD-MBD)的機理。

原代成骨細胞的分離與培養(yǎng)是研究成骨細胞的基礎(chǔ),本研究通過分離、純化的小鼠成骨細胞,優(yōu)化其誘導(dǎo)培養(yǎng)條件,借助成骨細胞成熟標(biāo)志物的表達和鈣化活性的改變,改良體外培養(yǎng)原代成骨細胞的方案,為研究其在CKD-MBD中的作用構(gòu)建實驗體系。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級新生1 d～3 d CD1小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司);0.25%胰蛋白酶、兔或鼠二抗、β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate,β-GP)、L-抗壞血酸(L-ascorbic acid,AA)和地塞米松(dexamethasone,Dex)(Sigma公司);膠原酶A(Roche公司);α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素+鏈霉素(penicillin-streptomycin,PS)(Gibco公司);兔抗鼠成骨細胞特異轉(zhuǎn)錄因子SP7/Osterix(Osterix,Osx)抗體和兔抗鼠骨鈣素(Osteocalcin,OC)抗體(Abcam公司);兔抗鼠Runt相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子-2(RUNX2)抗體(MBL公司);BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒和茜素紅試劑(碧云天公司);4%多聚甲醛組織固定液(Biosharp公司);增強化學(xué)發(fā)光檢測底物(Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng): 取CD1乳鼠10～15只,處死后置75%乙醇容器內(nèi)滅菌5 min,0.9%氯化鈉溶液沖洗后,無菌下取頂骨于盛有0.9%氯化鈉溶液培養(yǎng)皿中,去除骨膜及附著結(jié)締組織后剪成0.5 cm×0.5 cm骨片,PBS沖洗2次。將骨片放入0.25%胰蛋白酶消化液中,37 ℃消化10 min后,800 r/min離心棄上清液,PBS清洗2次。加入2 mg/mL膠原酶A消化液,37 ℃消化30 min,吹打骨片后,800 r/min離心棄消化液,再加入新配上述消化液,37 ℃消化60 min。輕柔吹打骨片,1 000 r/min離心吸取上清液于另支50 mL離心管,2 000×g離心5 min。棄上清,以10 mL培養(yǎng)液(α-MEM+10% FBS+1% PS)重懸細胞,經(jīng)200目篩網(wǎng)濾過,將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿內(nèi),5% CO2,37 ℃條件下培養(yǎng),2 d～3 d換液1次。

1.2.2 實驗的分組: 將培養(yǎng)好的原代成骨細胞分為3組。血清梯度組:10%、8%和2% FBS +1% PS+50 μg/mL AA+10 mmol/L β-GP+5 nmol/L Dex;培養(yǎng)時間梯度組:10% FBS+1% PS+50 μg/mL AA+10 mmol/L β-GP+5 nmol/L Dex分別培養(yǎng)7、10、14、17和21d;β-GP濃度梯度組:10% FBS+1% PS+50 μg/mL AA+5、10或20 mmol/L β-GP+5 nmol/L Dex;Dex濃度梯度組:10% FBS+1% PS+50 μg/mL AA+10 mmol/L β-GP+5、10或20 nmol/L Dex。

1.2.3 電鏡觀察細胞形態(tài): 取誘導(dǎo)培養(yǎng)(10% FBS+1% PS+50 μg/mL AA+10 mmol/L β-GP+5 nmol/L Dex)的成骨細胞爬片(1 cm×1 cm),經(jīng)4%多聚甲醛等處理后電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)。

1.2.4 成骨細胞堿性磷酸酯酶及鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色: 取各組細胞,PBS洗滌的細胞爬片,經(jīng)4%多聚甲醛固定。BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色工作液,室溫孵育30 min;或新鮮制備的茜素紅(2%,pH 4.2)室溫避光染色30 min;DAPI染核后進行觀察,使用Image-Pro軟件統(tǒng)計分析。

1.2.5 成骨細胞標(biāo)志蛋白免疫熒光染色: 4%多聚甲醛固定成骨細胞爬片,0.3% Triton X-100滲透。PBS洗滌、封閉處理后,兔抗鼠Osx或OC抗體孵育4 ℃過夜;PBS洗滌后,室溫下二抗避光孵育。DAPI染核后進行觀察,熒光成像儀采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測: 用PBS洗滌細胞,用裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,0.5% SDS,250 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA)提取蛋白質(zhì),離心,取上清,用BCA法蛋白定量。用10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對等量的蛋白質(zhì)進行分離。SDS-PAGE后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,進行免疫印跡。用4%牛血清白蛋白封閉PVDF膜,予兔抗鼠Osx、OC和RUNX2抗體(1 ∶1 000),在4 ℃孵育過夜。然后與兔二抗(Sigma)(1 ∶5 000),在室溫下孵育1 h。用增強化學(xué)發(fā)光檢測底物顯示免疫反應(yīng)蛋白,通過ImageJ軟件進行定量分析。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)對照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 原代成骨細胞的形態(tài)

原代成骨細胞在倒置顯微鏡下可見其增殖狀態(tài)良好,形成不規(guī)則細胞突起,可呈三角形、梭形、紡錘形多種形態(tài),細胞核明顯,核仁清晰可見。培養(yǎng)5 d～7 d細胞可完全匯合,呈鵝卵石樣鋪滿培養(yǎng)皿(圖 1A)。

2.2 成骨細胞的染色鑒定與超微結(jié)構(gòu)觀察

原代成骨細胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d,其堿性磷酸酶及成熟標(biāo)志蛋白表達,基質(zhì)鈣結(jié)節(jié)沉積(圖1B～D)。電鏡下可見部分細胞表面存在密集的膠原纖維網(wǎng)絡(luò),呈不規(guī)則覆蓋,表面光滑。高倍率下可見裸露部位的成骨細胞胞體多軸突,彼此呈網(wǎng)狀交織,表面分泌囊泡狀物質(zhì)融合形成鈣結(jié)節(jié)(圖 1E)。

A.light microscopic morphology of primary osteoblasts; B.alizarin red staining of osteoblasts; C.alkaline phosphatase staining of osteoblasts; D.immunofluorescence staining for Osterix at 14 days of cell culture; E.electron microscopic morphology.

2.3 成骨細胞培養(yǎng)時間條件的優(yōu)化

成骨細胞體外成熟度隨誘導(dǎo)時間延長而增加,表現(xiàn)為體外鈣結(jié)節(jié)沉積面積增大(圖2A～B)、表達堿性磷酸酶的細胞數(shù)增多(圖2C～D),在10% FBS條件下培養(yǎng)至14～21 d Osx及OC表達較前明顯增加(圖 2E)?？梢娬T導(dǎo)培養(yǎng)14 d后,多數(shù)細胞可分化為成骨細胞,并有形成骨基質(zhì)功能。

A.distribution of alizarin red-positive calcium nodules; B.nodule area ratio at different serum concentrations and culture times, *P<0.001 compared with Ctrl; C.staining of alkaline phosphatase; D.percentage of alkaline phosphatase positive cells at different serum concentrations and culture times, *P<0.05, **P<0.001 compared with Ctrl; E.expression of osteoblast marker proteins at different culture times, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with Ctrl.

A.expression of osteoblast marker proteins at different serum concentrations, # P<0.05, # # P<0.01 compared with precursor osteoblasts cultured with 10% FBS; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 2% FBS; △ P<0.05 compared with 8% FBS.

2.4 影響成骨細胞分化的條件

2.4.1 血清濃度對成骨細胞成熟度的影響: 在不同濃度血清連續(xù)培養(yǎng)21d,可見原代成骨細胞分化成熟均隨血清濃度升高而增加,表現(xiàn)為體外鈣結(jié)節(jié)沉積增多(圖2B),成骨標(biāo)志蛋白較前增加(圖2E),細胞分化為成熟成骨細胞。但當(dāng)成骨細胞僅予2% FBS培養(yǎng)時,于14 d 觀察到鈣沉積較少(圖3A)。此外,當(dāng)細胞誘導(dǎo)至14 d 時,8%與10% FBS培養(yǎng)相比,使用10% FBS培養(yǎng)成骨細胞OC表達明顯(圖3D)。

2.4.2 β-甘油磷酸鈉濃度對成骨細胞成熟度的影響: 隨磷酸鹽濃度增高,成骨細胞堿性磷酸酶含量及胞外鈣結(jié)節(jié)沉積增加,Osx表達增加,RUNX2降低(圖4A～C),表明磷酸鹽有促進前體成骨細胞分化成熟的作用,成骨活性增強。但當(dāng)磷酸鹽濃度高達20 mmol/L時,可見成骨細胞形態(tài)異常,軸突消失,呈多邊型小細胞狀(圖 4D),骨鈣素表達及鈣結(jié)節(jié)形成較前下降,成骨細胞骨形成作用受抑制。因此使用10 mmol/L β-GP更適宜。

A.Alizarin red staining; B.alkaline phosphatase staining; C.Western blot assay of osteoblast marker protein expression; D.immunofluorescence staining for osteoblast marker protein; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mmol/L β-GP.

A.Alizarin red staining; B.alkaline phosphatase staining; C.Western blot assay of osteoblast marker protein expression; D.immunofluorescence staining for osteoblast marker protein; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with 0 mmol/L Dex.

2.4.3 地塞米松濃度對成骨細胞成熟度的影響: 使用優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)(10% FBS+1% PS+50 μg/mL AA+10 mmol/L β-GP+ Dex),可見成骨細胞在5 nmol/L Dex作用條件下成骨細胞標(biāo)志蛋白Osx、OC、RUNX2表達明顯,但高濃度Dex可抑制成骨細胞分化(圖 5A-D)。值得一提的是,細胞外基質(zhì)中鈣沉積總面積與地塞米松濃度呈正比,在20 nmol/L作用下出現(xiàn)廣泛散在鈣結(jié)節(jié),但鏡下未見單個鈣結(jié)節(jié)面積擴大;成骨細胞堿性磷酸酶在10 nmol/L地塞米松時,表達輕度增加,但與5 nmol/L及20 nmol/L相比無統(tǒng)計學(xué)差異(圖 5B)。

3 討論

原代成骨細胞是研究疾病模型及信號通路等體外實驗的基礎(chǔ)。目前,成骨細胞的分離方法主要有酶消化法和組織塊法。組織塊法雖然操作簡易,不易污染且細胞損傷較低,但細胞游出較緩慢且數(shù)量少,限制其使用。因此,本實驗采取間斷酶消化法。在貫序消化3～5次后,可獲得大量原代細胞,經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)即獲得成熟成骨細胞,出現(xiàn)彌漫細胞外基質(zhì)鈣鹽沉積,RUNX2、Osx和OC表達明顯升高,標(biāo)志著大量前體成骨細胞分化,成骨細胞成熟比例增高。

對于成骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)中磷酸鹽及糖皮質(zhì)激素配比,目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方案及相應(yīng)濃度梯度測定。有研究指出[7-8],成骨細胞在β-GP作用下可增強其體外形成骨骼的能力,該過程類似于體內(nèi)骨形成,但高濃度磷酸鹽可降低成骨細胞標(biāo)志基因的表達,表現(xiàn)出細胞凋亡特征?；诖嗽O(shè)定梯度實驗,發(fā)現(xiàn)10、20 mmol/L β-GP濃度作用下磷酸鹽均可促進成骨細胞分化,但20 mmol/L β-GP明顯抑制成骨細胞的礦化形成,免疫熒光染色見細胞收縮,結(jié)合既往文獻,可能因高磷通過NOX誘導(dǎo)活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,改變細胞穩(wěn)態(tài),抑制成骨能力[9]。

數(shù)篇研究指出Dex在10-8～10-6mmol/L可增加成骨細胞堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成,促進成骨細胞自噬,增加細胞活性。然而,大劑量Dex通過ROS-PI3K/AKT/GSK3β信號通路顯著抑制成骨細胞和MC3T3-E1細胞的分化并誘導(dǎo)細胞凋亡[10-14]。本實驗中茜素紅染色示,20 nmol/L Dex可促進細胞外基質(zhì)鈣結(jié)節(jié)生成,但抑制成骨細胞標(biāo)志蛋白及堿性磷酸酶表達,對此推測Dex可刺激未成熟成骨細胞分泌細胞外囊泡沉積于基質(zhì),起到骨礦化作用,其對于鈣鹽沉積作用需未來進一步探索。

綜上所述,本研究最終采用α-MEM培養(yǎng)基,10% FBS,1% PS,50 μg/mL抗壞血酸,10 mmol/L β-GP加5 nmol/L Dex作為誘導(dǎo)成骨細胞成熟的培養(yǎng)方案,在14 d可獲得形態(tài)正常且有成骨活性的成熟成骨細胞。此培養(yǎng)方案有望規(guī)范目前體外成骨細胞實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建,為進一步探究成骨細胞代謝及藥物作用等提供良好的實驗基礎(chǔ)。