郭艷芳，耿 超，解相宏，陳恩惠，郭澤宇，張明龍，劉曉軍

中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 重大疾病共性機制研究全國重點實驗室，北京 100005

糖尿病作為一類嚴重威脅人類身體健康的慢性代謝性疾病,一直受到人們的廣泛關(guān)注。近年來,糖尿病患者不斷增加,深入研究糖尿病的發(fā)病機制和治療藥物迫在眉睫。糖尿病的主要特征為血糖升高,主要由胰島素分泌缺乏和/或胰島素抵抗引起[1]。身體的主要糖異生部位就是肝臟,它是代謝過程的核心部分。沉默信息調(diào)節(jié)蛋白1(Sirtuin 1, SIRT1)是一種去乙?；敢约敖湍窼IR2蛋白的一種直系同源物,可直接將細胞代謝狀態(tài)(通過NAD+)與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與基因的表達調(diào)控密切連接起來[2]。肝葡萄糖的產(chǎn)生主要是由肝糖異生和糖原分解所決定的,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxy-lase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase)的激活影響著糖異生的發(fā)生,抑制G6Pase和PEPCK的表達,可以有效的減少體內(nèi)肝葡萄糖的產(chǎn)生[3]。有研究發(fā)現(xiàn),過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptors gamma co-activator 1α, PGC-1α)有效調(diào)控了肝糖異生的關(guān)鍵酶的功能及表達。應激誘導蛋白(Sestrin,SESN)家族包括SESN1、SESN2和SESN3,它們是一類進化高度保守的蛋白質(zhì),在體外,SESN表現(xiàn)出氧化還原酶的活性。有研究發(fā)現(xiàn)SESN2的缺失能加重葡萄糖耐受不良、肝脂肪變性和胰島素抵抗,表明應激誘導的SESN蛋白家族,可能在調(diào)控以及維持葡萄糖和脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)方面具有不可或缺的作用[4]。但SESN1在小鼠肝臟糖異生中的作用及調(diào)節(jié)機制還有待研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:SPF級8周齡的雄性C57BL/6J(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所實驗動物中心)。

1.1.2 細胞:人肝癌細胞系HepG2(本實驗室保存)。

1.1.3 質(zhì)粒和腺病毒:SESN1-Flag表達質(zhì)粒、PGC-1α-Flag表達質(zhì)粒、pcDNA3.1質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒、報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic-PGC-1α啟動子, 帶GFP標簽的腺病毒(Ad-GFP),對照干擾腺病毒(Ad-shCON),SIRT1干擾腺病毒(Ad-shSIRT1)(本實驗室保存)。

1.1.4 主要試劑:SDS,Tris,甘氨酸(AMRESCO 公司);蛋白酶抑制劑,Trizol(Invitrogen公司);DMEM基礎培養(yǎng)基,常規(guī)RPMI-1640細胞培養(yǎng)基以及胎牛血清(Gibco公司);PierceTMBCA Protein Assay Kit(Thermo Fisher Scientific公司);PEI;佛司可林(forskolin,Fsk)與地塞米松(dexamethasone,Dex);Dual-Luciferase? Reporter Assay System和SYBR Green Ⅰ Q-PCR kit(Promega公司);抗SIRT1抗體(Cell Signal Technologies);抗FLAG抗體(Sigma公司);抗乙酰賴氨酸抗體(MilliPore公司),抗GAPDH抗體(Abmart公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠原代肝細胞的分離和培養(yǎng):于6孔板接種C57BL/6J小鼠的原代肝細胞,培養(yǎng)至貼壁后分別感染對照干擾腺病毒(Ad-shCON),SIRT1干擾腺病毒(Ad-shSIRT1),感染24～48 h后收集細胞。具體實驗方法見參考文獻[5]。在6孔板中以(2～4)×104個/孔的數(shù)量接種HepG2細胞,培養(yǎng)至細胞匯合度為60%～70%后進行轉(zhuǎn)染,對照組轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒,實驗組同時轉(zhuǎn)染SESN1-FLAG和PGC-1α-FLAG質(zhì)粒,每組各設3個復孔,轉(zhuǎn)染方式參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。針對Sirt1的shRNA(ShSIRT1)序列是GATGAAGTTGACCTCCTCA,對照shRNA(ShCON)序列是CTTACGCTGAGTACTTCGA。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測啟動子活性:用熒光素酶報告質(zhì)粒(200 ng)和pRL-TK(10～20 ng)將一定數(shù)量的表達載體共轉(zhuǎn)染入HepG2細胞。培養(yǎng)24～48 h后,用Dual-Luciferase? Reporter Assay System商品化試劑盒檢測熒光素酶的活性,根據(jù)對照組進行均一化處理。

1.2.3 RT-qPCR檢測mRNA相對表達量:采用Trizol法從人肝癌細胞株或原代肝細胞中提取總RNA。用Super ScriptTM反轉(zhuǎn)錄酶將約2 μg的總RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。在Bio-Rad CFX系統(tǒng)上使用SYBR Green Ⅰ Q-PCR試劑盒進行實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應。所有基因表達數(shù)據(jù)均歸一化為β-actin表達水平,最終得到mRNA的相對表達量。具體的引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of RT-qPCR

1.2.4 蛋白質(zhì)乙?；臏y定:用真核轉(zhuǎn)染試劑將所構(gòu)建的表達載體導入HepG2細胞。細胞用含有蛋白酶抑制的RIPA裂解液(強)進行裂解,通過離心收集上清。Protein G瓊脂糖珠用RIPA裂解液(強)預清洗,然后用抗FLAG一抗將蛋白旋轉(zhuǎn)孵育2 h(4 ℃)。接著將細胞裂解液加入Protein G瓊脂糖珠旋轉(zhuǎn)孵育過夜(4 ℃)。第二天早上將瓊脂糖珠洗滌6次,在緩沖液A(1% NP-40和0.1 mmol/L Na3VO4)中洗滌3次,在緩沖液B(0.01 mol/L Tris、pH 7.5、1 mmol/L EDTA、0.1 mol/L氯化鈉和0.1 mmol/L Na3VO4)中洗滌3次。用1×SDS緩沖液洗脫磁珠中的抗原,100 ℃金屬浴10 min后用常規(guī)的Western blot測定蛋白質(zhì)表達量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 肝組織中SESN1的表達受營養(yǎng)狀態(tài)的控制。

禁食24 h和48 h都誘導了小鼠肝臟SESN1的mRNA表達水平增加(P<0.001),而重新喂養(yǎng)12 h則逆轉(zhuǎn)了這一誘導效果(P<0.001) (圖1A)。用Fsk和Dex共同處理模擬細胞中胰高血糖素和其他糖皮質(zhì)激素的禁食作用可以誘導SESN1 mRNA表達水平的上調(diào)(P<0.001) (圖1B)。

*P<0.001 compared with fed group;# P<0.001 compared with fasted-24 h.

2.2 SESN1提高原代肝細胞糖異生基因PGC-1α、PEPCK和G6Pase的表達水平

在小鼠原代肝細胞中,SESN1的過表達增加了PGC-1α及其靶基因,糖異生基因PEPCK和G6Pase的基因表達水平(P<0.001) (圖2A)。過表達SESN1增強了PGC-1α的啟動子活性(P<0.001),PGC-1α對其自身的啟動子活性有作用(P<0.01) (圖2B)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with CON group.

2.3 SESN1依賴SIRT1促進PGC-1α去乙?；?/h3>

SESN1的過表達降低了原代肝細胞中PGC-1α的乙?；?圖3A)。分別利用SIRT1家族抑制劑NAM和shRNA腺病毒干擾SIRT1表達,結(jié)果顯示均拮抗了SESN1對PGC-1α的去乙酰化作用(圖3B)。綜上,SESN1促進PGC-1α的去乙?；蕾囉赟IRT1。

2.4 SESN1能誘導PGC-1α及依賴SIRT1的糖異生相關(guān)基因的表達

當利用shRNA腺病毒下調(diào)SIRT1的表達時,SIRT1誘導的PGC-1α(P<0.05)、PEPCK(P<0.000 1)和G6Pase(P<0.000 1)表達也明顯降低(圖4)。

3 討論

糖異生是生物體將多種非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)變成葡萄糖或糖原的過程,對維持空腹狀態(tài)下血糖正常水平具有重要意義[6]。在哺乳動物中,肝臟是機體糖脂代謝重要器官,是通過糖原分解或糖異生途徑產(chǎn)生內(nèi)源性葡萄糖主要場所。在某些應激情況下,肝臟糖異生過度激活可導致多種代謝性疾病的發(fā)生。

SESN 被認為是一種氧化應激中的關(guān)鍵抑制因子,越來越多的證據(jù)表明 SESN 與許多肝臟疾病有關(guān)。過往的研究表明,營養(yǎng)過剩造成哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合體(mammalian target of rapamycin complex,mTORC)和p70S6激酶(p70S6 kinase,p70S6K)的慢性激活,導致肥胖相關(guān)的代謝疾病,SESN作為一種應激誘導蛋白,能激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)并抑制mTORC1-S6K的活性,SESN2下調(diào)可加重肥胖誘導的mTORC1-S6K激活、糖耐量異常、胰島素抵抗和肝骨病,所有這些都可被AMPK激活逆轉(zhuǎn)[7]。此外,即使在沒有營養(yǎng)過剩和肥胖的情況下,同時去除SESN2和SESN3也會引起肝臟mTORC1-S6K的激活和胰島素抵抗,這些結(jié)果表明,應激誘導的SESN蛋白家族在控制哺乳動物的脂肪和葡萄糖代謝方面具有重要的動態(tài)平衡功能[8]。在本研究中,禁食不同時間的小鼠的肝臟和用FSK和Dex處理6 h的肝原代細胞中SESN1的mRNA表達水平均升高,說明SESN1在肝臟中的表達與糖異生潛能之間存在相關(guān)性。此外,有研究表明,PGC-1α在正常的肝細胞中能激活cAMP-PKA-CREB信號通路,可與肝細胞核因子-4α(HNF-4α)和叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子 O1(FOXO1)相互作用,從而誘導G6Pase和PEPCK1的表達,小鼠禁食和再喂養(yǎng)也誘導肝臟PGC-1α基因表達水平變化[9]。本研究中,過表達SESN1促進PGC-1α、PEPCK和G6Pase的基因表達水平并增強了PGC-1α的啟動子活性,表明SESN1可能通過調(diào)控PGC-1α、PEPCK和G6Pase的表達影響肝臟糖異生。也有研究證實,在去乙?；せ?SIRT1后,其可以通過上調(diào)PGC-1α的表達水平來保護肝組織[10]。在本研究中,SESN1的過表達降低了原代肝細胞中PGC-1α的乙酰化。分別利用Sirt家族抑制劑NAM和shRNA腺病毒干擾Sirt1表達,均拮抗了SESN1對PGC-1α的去乙?；饔?說明SESN1依賴于Sirt1促進PGC-1α的去乙酰化。

綜上所述, SESN1能通過誘導PGC-1α及糖異生相關(guān)基因PEPCK和G6Pase的表達來調(diào)控小鼠肝臟糖異生,可能與Sirt1的去乙?；饔糜嘘P(guān)。本研究表明SESN1可能是糖代謝異常的重要新靶點,為未來糖尿病預防和臨床診療提供新的思路。