鄧星成, 任志強,2, 曾 波, 衛(wèi)春會,2, 鄧 杰,2,謝 軍,2, 黃治國,2,*

(1.四川輕化工大學 釀酒生物技術(shù)及應用四川省重點實驗室, 四川 宜賓 644000;2.中國輕工業(yè)釀酒生物技術(shù)及智能制造重點實驗室, 四川 宜賓 644000)

高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]是被子植物門(Angiospermae)百合綱(Liliopsida)莎草目(Cyperales)禾本科(Poaceae)黍亞科(Sub Fam. Panicoideae)高粱族(Trib. Andropogonea)高粱屬(Sorghum)植物,一年生草本作物,籽粒為谷物類糧食。高粱是中國的古老作物之一?？脊艑W家發(fā)現(xiàn),遠在西周至西漢時期高粱已在中國廣泛分布,至今約有 4 000年的栽培歷史。中國的琥珀甜高粱于1853年傳入美國,曾對那里的糖高粱生產(chǎn)起過重要作用?，F(xiàn)在世界熱帶和溫帶的90多個國家栽培高粱,主要的生產(chǎn)國有中國、美國、印度、阿根廷、墨西哥、尼日利亞、蘇丹、澳大利亞等。高粱在中國的主產(chǎn)區(qū)集中在東北、華北和西北地區(qū)。高粱是我國重要的雜糧作物,其產(chǎn)量低于水稻、小麥、玉米、甘薯,居第五位。高粱是釀酒和制醋、飴糖、淀粉的主要原料之一。我國白酒生產(chǎn)多以高粱為主要原料,因此白酒也稱為“高粱白酒”,高粱酒在清朝已經(jīng)被公認為是最好的酒,流行于我國北方和部分南方地區(qū)。中國的茅臺酒、汾酒、山西陳醋等均以高粱為原料。高粱經(jīng)酸或酶水解后會產(chǎn)生大量的風味物質(zhì),這些風味物質(zhì)會在釀酒生產(chǎn)時帶入酒中[1]。

以高粱為釀酒原料的濃香型白酒中己酸不僅是重要的揮發(fā)性風味化合物,還是己酸乙酯合成的前體物質(zhì)。己酸作為6個碳的中鏈脂肪酸,廣泛用于食品添加劑、醫(yī)藥、香料等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[2-3],具有較高的經(jīng)濟價值。同時,以微生物發(fā)酵己酸的研究中,發(fā)酵原料大多含有豐富的糖類物質(zhì),如餐廚垃圾、果蔬廢棄物和纖維素等[4]。高粱具有抗旱、抗?jié)?、耐鹽堿、耐瘠薄、耐高溫、耐寒冷等抗逆性,即使是在貧瘠的土地上仍能穩(wěn)定生長,作為一種非口糧競爭性農(nóng)作物,不會搶占糧食土地,且淀粉含量高,價格便宜。但高粱作為己酸發(fā)酵原料的研究目前還未見報道,本研究團隊從優(yōu)質(zhì)窖泥中經(jīng)富集、篩選產(chǎn)己酸相關(guān)的微生物得到己酸復合菌液,該菌液能利用底鍋水、黃水等白酒釀造廢液發(fā)酵己酸。

化學法主要是以硝酸氧化仲辛醇制得己酸,但副產(chǎn)物多,對環(huán)境污染較大;而微生物發(fā)酵方面,當前研究多利用玉米、小麥、甜高粱等淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)短鏈羧酸[5-6],這類酸相對分子質(zhì)量較小,能量密度低,親水性強,難分離[7],因而進一步的資源化利用受到限制,于是近年來利用產(chǎn)己酸微生物將短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)化為中鏈脂肪酸的研究得到了較多的關(guān)注。

實際微生物合成己酸是一個碳鏈延伸的過程,通過β氧化逆循環(huán)實現(xiàn),在這個過程中發(fā)生了電子供體的氧化與電子受體的還原,常見電子供體有乙醇和乳酸,短鏈羧酸(丁酸、乙酸等)則作為電子受體[8]。因此,當前己酸的厭氧發(fā)酵也大多采用兩步發(fā)酵的方式[9]。首先,因產(chǎn)己酸微生物難以直接利用大分子有機物,第一步先利用酸化類微生物分解大分子有機物產(chǎn)生丁酸和乙酸等短鏈脂肪酸作為電子受體。第二步利用產(chǎn)己酸微生物在電子供體作用下,將第一步中的短鏈脂肪酸經(jīng)碳鏈延長轉(zhuǎn)化為己酸[7]。將己酸發(fā)酵過程分為兩步驟的同時,也將酸化類微生物和產(chǎn)己酸微生物進行空間隔離,這不僅可避免己酸和電子供體(乙醇)對酸化微生物的毒害,同時在不同發(fā)酵體系下,能更有效地控制兩類微生物處于最佳的發(fā)酵條件,從而提高己酸的產(chǎn)量。而電子供體的來源可分為三大類[10],第一類為發(fā)酵底物自身富含電子供體,如釀造廢水[11]、乳清液等;第二類為外源添加電子供體[12-13];第三類為利用有機底物通過微生物發(fā)酵自生電子供體,例如Contreras-Davila等[14]將食品垃圾經(jīng)過同型乳酸發(fā)酵生成乳酸并結(jié)合連續(xù)生物反應器進行碳鏈延長,最終實現(xiàn)在無外源電子供體的條件下生成正己酸。但目前大部分的己酸發(fā)酵仍然依賴外加電子供體的方式以提高己酸產(chǎn)量[15],這導致己酸生產(chǎn)成本過高,通過原料自生電子供體,以強化己酸生成的研究還相對較少,值得進一步探索。

本研究在無外源添加電子供體條件下,探究以高粱為原料,采用兩步法厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸的可行性。通過優(yōu)化發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度等條件,以提高第一步中丁酸、乳酸、乙醇發(fā)酵液的轉(zhuǎn)化率。然后以3種發(fā)酵液為底物進行發(fā)酵制備己酸,通過優(yōu)化不同底物組合,以及乙醇發(fā)酵液和乳酸發(fā)酵液添加比例,以獲得較優(yōu)的己酸發(fā)酵條件。并分析較優(yōu)條件下己酸發(fā)酵過程中的微生物與代謝物質(zhì)相關(guān)性,探究己酸發(fā)酵機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱原料為市售粳高粱(粉碎至200目)。己酸復合菌液,山東中惠生物科技股份有限公司;糖化酶(5×104U/g)、α-淀粉酶(5×104U/g),江蘇博立生物制品有限公司;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae),安琪酵母股份有限公司;嗜酸乳桿菌TYCA06(Lactobacillusacidophilus),安徽錦喬生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Auper Alcomat型高精度數(shù)顯酒精濃度計,優(yōu)萊博技術(shù)(北京)有限公司;1000A型多功能粉碎機,永康市紅太陽機電有限公司;UV-1200型紫外分光光度計,上海美普達儀器有限公司;悟空K2025型高效液相色譜儀,海能未來技術(shù)集團股份有限公司;GC2200型氣相色譜儀,云鉑儀器(成都)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1兩步法厭氧發(fā)酵己酸工藝流程

高粱經(jīng)兩步法厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸的工藝流程見圖1。第一步是以高粱為原料分別接種己酸復合菌液、接種嗜酸乳桿菌TYCA06、添加釀酒酵母制得丁酸發(fā)酵液、乳酸發(fā)酵液、乙醇發(fā)酵液;第二步是將丁酸發(fā)酵液、乳酸發(fā)酵液、乙醇發(fā)酵液等3種發(fā)酵液混合,接種己酸復合菌液,制得己酸。

圖1 高粱兩步法厭氧發(fā)酵產(chǎn)己酸工藝流程Fig.1 Process of two-step anaerobic fermentation to produce caproic acid by sorghum

1.3.2第一步丁酸發(fā)酵液的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

取10 g高粱粉,添加了所有發(fā)酵所需物(包括高粱粉、CaCO3、己酸復合菌液)后定容至100 mL;添加質(zhì)量分數(shù)為1%的CaCO3(即1 g)。采用單因素優(yōu)化法,分別考察發(fā)酵時間(1、3、5、7、9 d)、發(fā)酵溫度(25、30、34、37、40 ℃)、己酸復合菌液接種量(5%、10%、15%、20%)(接種量為5%即菌液體積占總發(fā)酵體系體積的體積分數(shù),下同)對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。厭氧瓶有效容積100 mL,每組3次平行,定期取樣檢測發(fā)酵液中丁酸和乙酸質(zhì)量濃度,并計算相應淀粉轉(zhuǎn)化率。

淀粉轉(zhuǎn)化率的計算方法見式(1)。

(1)

式(1)中,162為淀粉相對分子質(zhì)量;88為丁酸相對分子質(zhì)量;120為2 mol乙酸相對分子質(zhì)量;實際淀粉消耗量為發(fā)酵前后淀粉質(zhì)量分數(shù)的差值。

1.3.3第一步乳酸發(fā)酵液的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

取200 g高粱粉,加入1 800 mL沸水,95 ℃水浴并不斷攪拌,按400 U/g高粱粉干質(zhì)量加入α-淀粉酶,攪拌液化1 h。取出后晾冷至40 ℃左右,按500 U/g高粱粉干質(zhì)量加入糖化酶,放于65 ℃恒溫糖化2 h。糖化完成后用4層紗布過濾,得到濾液,高壓蒸汽滅菌15 min,冷卻至常溫,制得高粱糖化液。

MRS培養(yǎng)基:無水葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母提取物5 g、無水乙酸鈉5 g、檸檬酸銨2 g、K2HPO4·3H2O 2 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、MnSO4·H2O 0.25 g、吐溫80 1 mL,蒸餾水1 L,pH值6.2±0.1,121 ℃滅菌20 min。

從嗜酸乳桿菌干粉中獲得的乳酸菌菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600為1.3左右),接種于100 mL高粱糖化液。采用單因素優(yōu)化法,分別考察發(fā)酵時間(1、2、3、4、6、8、10 d),發(fā)酵溫度(25、30、34、37、40 ℃),接種量(5%、10%、15%、20%)對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響,厭氧瓶有效容積100 mL,每組3次平行,定期取樣檢測發(fā)酵液中乳酸質(zhì)量濃度,并計算乳酸轉(zhuǎn)化率。

乳酸轉(zhuǎn)化率的計算方法見式(2)。

(2)

式(2)中,乳酸產(chǎn)量為發(fā)酵結(jié)束后乳酸發(fā)酵液中乳酸的質(zhì)量分數(shù),總糖消耗量為發(fā)酵前后乳酸發(fā)酵液中總糖質(zhì)量分數(shù)的差值。

1.3.4第一步乙醇發(fā)酵液的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

取250 g高粱粉加水定容至1 L,添加釀酒活性干酵母2 g,按100 U/g高粱粉干質(zhì)量加入α-淀粉酶干粉,通過稱重法每12 h測定發(fā)酵質(zhì)量損失,并考察發(fā)酵溫度(20、25、30、34、37 ℃)、料水比[m(高粱粉)∶V(水)=1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL]對高粱發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,厭氧瓶有效容積為1 L,每組3次平行,發(fā)酵結(jié)束時取樣100 mL,測定發(fā)酵液酒精度,計算乙醇轉(zhuǎn)化率。

乙醇轉(zhuǎn)化率的計算方法見式(3)。

(3)

式(3)中,乙醇產(chǎn)量為發(fā)酵結(jié)束后乙醇發(fā)酵液中乙醇的質(zhì)量分數(shù),總消耗淀粉理論乙醇產(chǎn)量為發(fā)酵前后乙醇發(fā)酵液中淀粉質(zhì)量差值理論生成乙醇的質(zhì)量分數(shù)。

1.3.5第二步己酸發(fā)酵底物組合的優(yōu)化

3種發(fā)酵液在12 000 r/min條件下離心8 min,分別收集上清液,加去離子水稀釋調(diào)整后,得到丁酸、乙酸質(zhì)量濃度分別為20 g/L和8 g/L的丁酸發(fā)酵液,乳酸質(zhì)量濃度為10 g/L的乳酸發(fā)酵液,乙醇質(zhì)量濃度為20 g/L的乙醇發(fā)酵液。

不同發(fā)酵底物組合的己酸發(fā)酵實驗設計見表1。采用批次發(fā)酵方式,于100 mL厭氧發(fā)酵瓶中,控制產(chǎn)己酸發(fā)酵體系中總物質(zhì)的質(zhì)量濃度為10 g/L,以上述3種發(fā)酵液為發(fā)酵底物組合發(fā)酵;設置1種發(fā)酵液發(fā)酵組(M1、M2、M3),2種發(fā)酵液組合發(fā)酵組(M4、M5、M6)和3種發(fā)酵液組合發(fā)酵組(M7),M7中乙醇和乳酸質(zhì)量濃度比值為1∶1;均接種體積分數(shù)為10%的己酸復合菌液,調(diào)節(jié)pH值為5.6±0.1,每組3次平行,35 ℃條件下厭氧發(fā)酵,每3 d取樣測定己酸質(zhì)量濃度,并計算最終己酸產(chǎn)率。

表1 不同底物組合的己酸發(fā)酵實驗設計

己酸產(chǎn)率的計算見式(4)。

(4)

式(4)中,高粱消耗量為己酸發(fā)酵液中初始底物換算為高粱消耗的量,見表1。

1.3.6第二步乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比的優(yōu)化

乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比的優(yōu)化實驗設計見表2。以最優(yōu)底物組合,添加丁酸發(fā)酵液12.5 mL,控制己酸發(fā)酵體系物質(zhì)總質(zhì)量濃度為13.5 g/L,通過添加不同比例的乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液,得到不同的乙醇與乳酸添加質(zhì)量濃度比例(1∶1、2∶1、3∶1、1∶2、1∶3),并對己酸的合成性能進行研究?？刂瓢l(fā)酵條件,每7 d取樣測定丁酸、乙酸、乙醇、乳酸、己酸的質(zhì)量濃度。

表2 不同乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比的己酸發(fā)酵實驗設計

1.3.7發(fā)酵液中目標產(chǎn)物質(zhì)量濃度的測定

1)發(fā)酵液預處理。取1 mL發(fā)酵液于15 mL離心管中,加入1 mL5 g/L 2-乙基丁酸,再加入100 μL甲酸,用乙醇定容至5 mL,以12 000 r/min 離心5 min,取上清液于樣品瓶中,用于氣相檢測發(fā)酵液中丁酸、乙酸、己酸的質(zhì)量濃度。

取1 mL發(fā)酵液于2 mL離心管中,以12 000 r/min離心5 min,過0.22 μm微孔濾膜,取100 μL上清液加900 μL超純水(稀釋10倍),轉(zhuǎn)移至進樣品瓶中,用于液相檢測發(fā)酵液中乙醇、乳酸的質(zhì)量濃度。

2)氣相色譜條件。毛細管色譜柱為LZP-930(30 m×0.32 mm×1.0 μm),不分流,進樣量1 μL,進樣口溫度為230 ℃;程序升溫:50 ℃保持6 min,從5 ℃/min升溫至170 ℃,保持5 min;載氣為高純度氮氣,載氣壓力0.05 MPa。

3)液相色譜條件。色譜柱為Hi-Plex H (300 mm×7.7 mm×8 μm),流動相為5 mmol/L H2SO4水溶液,流速為0.6 mL/min,上樣量為20 μL,柱溫為55 ℃。

1.3.8發(fā)酵液其他理化指標的測定

淀粉含量測定參照GB 5009.9—2016《食品安全國家標準 食品中淀粉的測定》中酸水解法;總糖含量測定參照GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》中直接滴定法;酒精度測定參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中蒸餾法。

1.3.9己酸發(fā)酵過程中微生物群落分析

通過無菌操作收集1.3.6節(jié)中最優(yōu)己酸發(fā)酵組的0、8、14 d的己酸發(fā)酵液樣品,置于-80 ℃冰箱保存待用,對樣品細菌16S rRNA的V3～V6區(qū)設計引物(338F:5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′和806R:5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT′3′),通過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司高通量測序平臺(Illumina MiSeq PE300)進行高通量測序,所得數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控、過濾和拼接并對相似度大于等于97%的操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)進行聚類,比對Silva數(shù)據(jù)庫(SSU123)進行分物種注釋。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行處理,使用SPSS 23.0對數(shù)據(jù)結(jié)果進行統(tǒng)計分析,采用Origin 2021繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸發(fā)酵液的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化結(jié)果

為探究丁酸發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件,本研究通過單因素實驗考察了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和菌液接種量對丁酸發(fā)酵液發(fā)酵情況的影響,見圖2。由圖2(a)可知,從發(fā)酵時間上看,在1～9 d內(nèi),隨著發(fā)酵時間的延長,丁酸和乙酸質(zhì)量濃度呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢,在第7天后丁酸和乙酸質(zhì)量濃度變化不顯著(P>0.05),這可能是發(fā)酵至第7 d酸類物質(zhì)的積累導致發(fā)酵液pH降低抑制微生物的生長代謝。因此選擇發(fā)酵時間7 d為宜。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸過程中,溫度通過影響微生物生命活動及相應酶的活性,從而影響最終代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[16],由圖2(b)可知,隨著溫度的升高丁酸、乙酸質(zhì)量濃度和淀粉轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢,在37 ℃達到最高值,丁酸、乙酸產(chǎn)量分別為20.16 g/L和8.47 g/L,淀粉轉(zhuǎn)化率達76.02%,并且顯著高于其他組(P<0.05)。因此選擇發(fā)酵溫度37 ℃為宜。

接種量直接影響著發(fā)酵過程中的微生物的生長速率,從而影響發(fā)酵周期[17],由圖2(c)可知,隨著菌液接種量增加,丁酸產(chǎn)量和淀粉轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,在菌液接種量為10%時丁酸和乙酸質(zhì)量濃度達到最高值,但當接種量大于10%后,丁酸質(zhì)量濃度差異不顯著(P>0.05)但淀粉轉(zhuǎn)化率卻急劇下降。因此選擇最佳菌液接種量為10%。

在己酸兩步法厭氧發(fā)酵中,提高第一步中高粱的轉(zhuǎn)化率是后續(xù)產(chǎn)己酸高轉(zhuǎn)化率的前提,最終確定在發(fā)酵溫度為37 ℃條件下,接種10%的己酸復合菌液,發(fā)酵7天為高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁酸和乙酸的最佳條件,此時丁酸發(fā)酵液淀粉轉(zhuǎn)化率達到76.02%,丁酸、乙酸產(chǎn)量分別為20.16 g/L和8.47 g/L。

2.2 乳酸發(fā)酵液的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化結(jié)果

乳酸的發(fā)酵過程中乳酸菌可通過生成乳酸形成酸性環(huán)境和分泌細菌素等方式抑制雜菌的生長,從而實現(xiàn)乳酸的定向轉(zhuǎn)化[18],為得到乳酸發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件,本研究通過單因素實驗考察了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和乳酸菌接種量對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響,見圖3。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

發(fā)酵時間對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響結(jié)果見圖3(a),由圖3(a)可知,乳酸質(zhì)量濃度隨發(fā)酵時間增加呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢,在前2 d乳酸質(zhì)量濃度增長較快,在第4 天時進入穩(wěn)定期,在8 d后乳酸質(zhì)量濃度不再呈現(xiàn)顯著變化(P>0.05),因此選擇發(fā)酵時間8 d為宜。

發(fā)酵溫度對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響結(jié)果見圖3(b),由圖3(b)可知,隨著發(fā)酵溫度升高乳酸質(zhì)量濃度和乳酸轉(zhuǎn)化率均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢,在發(fā)酵溫度34 ℃時乳酸質(zhì)量濃度和轉(zhuǎn)化率均達到最高,為11.41 g/L和42.48%,與其他發(fā)酵溫度呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。趙微等[19]從清香型白酒酒醅中篩選的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)SL32-2,在高粱糖化液中產(chǎn)乳酸的最佳發(fā)酵溫度為35 ℃,與本研究最適溫度接近。因此選擇發(fā)酵溫度34 ℃為宜。

乳酸菌接種量對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響結(jié)果見圖3(c),由圖3(c)可知,隨著乳酸菌接種量的增加乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率整體呈現(xiàn)先降低再增加的變化趨勢,在較少的接種量(體積分數(shù)為5%)時,乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率均達到最高值。因此選擇最佳接種量為5%。

因此選擇發(fā)酵溫度34 ℃,乳酸菌接種量為5%,發(fā)酵8 d,為乳酸發(fā)酵液最優(yōu)發(fā)酵條件,此時乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率達到11.41 g/L和42.48%。

2.3 乙醇發(fā)酵液的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化結(jié)果

為得到乙醇發(fā)酵液最佳發(fā)酵條件,本研究通過單因素實驗考察了發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和接種量對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,見圖4。酵母的乙醇發(fā)酵常伴隨著CO2的生成,因此以釀酒酵母發(fā)酵的累計失重來表征其發(fā)酵情況,由圖4(a)可知,在發(fā)酵前72 h,發(fā)酵累計失重變化較快,釀酒酵母生長代謝較旺盛,在72 h到144 h發(fā)酵累計失重變化曲線逐漸變平緩,在168 h后累計失重量變化不再明顯,表明此時發(fā)酵結(jié)束,因此選擇發(fā)酵時間168 h為宜。

不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。

發(fā)酵溫度對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響結(jié)果見圖4(b),由圖4(b)可知,發(fā)酵液酒精度和乙醇轉(zhuǎn)化率隨著發(fā)酵溫度的增加均呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢,在溫度為25 ℃時發(fā)酵液酒精度和乙醇轉(zhuǎn)化率均達到最高,顯著高于其他發(fā)酵溫度(P<0.05)。溫度過低會使發(fā)酵速度緩慢,延長產(chǎn)酒周期;溫度過高會抑制酵母菌生長代謝。因此選擇25 ℃作為高粱乙醇發(fā)酵的合適溫度。

相同發(fā)酵質(zhì)量,料水比反映了發(fā)酵液中淀粉的含量,淀粉含量過高容易造成原料的浪費,淀粉含量過低又不能滿足釀酒酵母發(fā)酵所需碳源,以至于出酒酒度不高[20]。不同料水比對高粱厭氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響結(jié)果見圖4(c)。由圖4(c)可知,隨著料水比的降低,發(fā)酵液酒精度呈現(xiàn)逐漸降低變化趨勢,但乙醇轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢,在料水比為1∶3時達到最高,顯著高于其他料水比(P<0.05)。雖然料水比在1∶2條件下的發(fā)酵液酒精度較高,但乙醇轉(zhuǎn)化率相較于料水比1∶3更低,說明在料水比為1∶2時釀酒酵母對淀粉質(zhì)原料的利用率不高,為節(jié)約原料成本,選用1∶3作為最佳的高粱乙醇發(fā)酵的料水比。

因此,選擇發(fā)酵溫度25 ℃,料水比為1∶3時,發(fā)酵7 d為乙醇發(fā)酵液最佳發(fā)酵條件,發(fā)酵液酒精度高,乙醇轉(zhuǎn)化率可達95.06%。

2.4 己酸發(fā)酵底物組合的優(yōu)化結(jié)果

碳鏈的延長往往需要電子供體等還原性物質(zhì)提供ATP和還原力(NADH)[4],己酸發(fā)酵過程中電子供體的多樣性,反映了電子供體轉(zhuǎn)移電子的難易程度,從而影響己酸的產(chǎn)量[21]。因此本研究探究了以不同電子供體為底物己酸發(fā)酵情況的差異,結(jié)果見圖5。由圖5可知, M1、M2、M3、M6的產(chǎn)己酸效果明顯弱于其他組,說明當發(fā)酵底物缺乏電子供體(M3)或者電子受體(M1、M2、M6)時,不利于己酸發(fā)酵。

圖5 發(fā)酵底物對己酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of fermentation substrate on caproic acid fermentation

當以乙醇(M4)或乳酸(M5)發(fā)酵液提供電子供體時,產(chǎn)己酸效果顯著,其中M4組在前6 d己酸增長較快,在第9天進入穩(wěn)定期,在12 d后己酸質(zhì)量濃度變化不大,最終己酸質(zhì)量濃度達到2.20 g/L。此時乙醇為電子供體,乙醇首先被乙醇脫氫酶氧化生成乙醛,并在乙醛脫氫酶作用下產(chǎn)生乙酰輔酶A,產(chǎn)生能量,然后進入循環(huán)[22]。第二步是乙酸和丁酸的還原,2個乙酰輔酶A縮合成乙酰乙酰輔酶A,經(jīng)脫氫、脫水、還原生成丁酰輔酶A。同時,在乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移酶的作用下,乙酸與丁酰輔酶A反應生成新的乙酰輔酶A和丁酸。丁酰輔酶A和乙酰輔酶A被轉(zhuǎn)化為己酰輔酶A,己酰輔酶A在?；o酶A轉(zhuǎn)移酶的作用下,與丁酸反應生成己酸[8,10]。M5在發(fā)酵前6 d己酸產(chǎn)量較低,之后己酸增長迅速,在12 d 時進入穩(wěn)定期,15 d后趨于穩(wěn)定,己酸產(chǎn)量達2.89 g/L。此時乳酸為電子供體,但己酸發(fā)酵啟動較M4組緩慢,可能原因是從代謝途徑來看,乳酸首先被乳酸脫氫酶氧化生成丙酮酸,丙酮酸再經(jīng)過丙酮酸脫羧酶生成乙酰,結(jié)合輔酶A生成乙酰輔酶A,需經(jīng)過兩步氧化,然后再參加逆β氧化實現(xiàn)碳鏈延伸[15]。從微生物角度來看,對于混菌發(fā)酵體系下,發(fā)酵前期產(chǎn)己酸微生物需要適應環(huán)境,在多菌合作協(xié)同之下實現(xiàn)不斷富集。史陽[23]也發(fā)現(xiàn)以乳酸為電子供體進行己酸發(fā)酵時,前期乳酸消耗仿佛僅為己酸的生成提供相應的短鏈碳骨架,需要后續(xù)補充乳酸來驅(qū)動己酸的合成。

當以乙醇和乳酸發(fā)酵液同時提供電子供體時,觀察M7發(fā)現(xiàn),發(fā)酵前6 d己酸質(zhì)量濃度增長速度較快,隨著發(fā)酵的進行,己酸質(zhì)量濃度逐漸增加,第12天進入穩(wěn)定期,第15天己酸質(zhì)量濃度濃度達到4.15 g/L,表明乙醇和乳酸同時作為電子供體時,己酸發(fā)酵周期縮短,己酸產(chǎn)量顯著提高。這可能是乙醇和乳酸在己酸發(fā)酵過程中產(chǎn)生過剩的H2和CO2可以經(jīng)過同乙酰化和將乙酸還原再生成乙酸和乙醇,隨后進一步參加碳鏈的延長,因此促進了己酸的生成[22,24]。

本研究以高粱為原料經(jīng)兩步發(fā)酵的方式生產(chǎn)己酸,因此己酸的原料轉(zhuǎn)化率值得被關(guān)注,計算不同發(fā)酵底物組的己酸產(chǎn)率見表3。由表3可知,當以乙醇發(fā)酵液提供電子供體時(M4),己酸產(chǎn)量雖然僅有2.2 g/L,但己酸的高粱轉(zhuǎn)化率達到67.05 mg/g,相比于乳酸發(fā)酵液提供電子供體(M5),己酸產(chǎn)量雖然有2.89 g/L,但己酸產(chǎn)率只有37.29 mg/g。當乙醇和乳酸發(fā)酵液同時提供電子供體時,己酸產(chǎn)量和產(chǎn)率都得到了顯著提升,分別達到4.15 g/L和75.20 mg/g。因此也同樣證明了乙醇和乳酸同時作為電子供體能有效提高己酸的原料轉(zhuǎn)化率。

表3 發(fā)酵底物組合對己酸產(chǎn)量和產(chǎn)率的影響

2.5 乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比的優(yōu)化結(jié)果

Zhu等[25]以窖泥為接種物合成中鏈脂肪酸時,發(fā)現(xiàn)窖泥菌群更偏好于消耗乳酸合成中鏈脂肪酸,而乙醇幾乎不消耗。2.4節(jié)發(fā)現(xiàn)同時以乙醇和乳酸為電子供體時己酸發(fā)酵效果較好,本研究所用接種物為己酸復合菌液,在此混菌發(fā)酵體系中,產(chǎn)己酸微生物對乙醇和乳酸的利用或許也存在偏好,乙醇和乳酸的添加比例可能也會引起己酸發(fā)酵體系中微生物的改變,從而影響最終的己酸形成。

乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比對己酸發(fā)酵的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知,不同比例的乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比對己酸的生成有著一定的影響,在發(fā)酵14 d后己酸產(chǎn)量分別為5.19 g/L (添加比為1∶3)、5.15 g/L (添加比為1∶2)、5.34 g/L (添加比為1∶1)、6.65 g/L (添加比為2∶1)、4.82 g/L(添加比為3∶1)。隨著乙醇比例的增加,發(fā)酵結(jié)束時己酸質(zhì)量濃度整體呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢,丁酸的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢,發(fā)酵過程中乙酸的變化,呈現(xiàn)了先增加后降低的變化趨勢,這可能與發(fā)酵前期產(chǎn)酸微生物占優(yōu)勢有一定的關(guān)系,隨著發(fā)酵進行,優(yōu)勢微生物菌群發(fā)生變化,或者同種微生物代謝途徑也會有所改變,從而乙酸質(zhì)量濃度降低[23]。

圖6 乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比對己酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of addition ratio of ethanol fermentation broth to lactic acid fermentation broth on caproic acid yield

乙醇比例較低的組別(添加比為1∶3和1∶2),主要以乳酸消耗為主,乙醇消耗較少,并且仍然有剩余乳酸未被利用,可能乳酸為電子供體形成乙酰輔酶A時會釋放CO2,有一定的碳流失,導致部分微生物的生長代謝受到一定的限制,因而微生物對乙醇的利用也不夠充分[26]。當乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液比例提升至2∶1時,發(fā)酵結(jié)束時乳酸幾乎消耗完全,此時己酸質(zhì)量濃度也達到最高,但當乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比值達到3∶1時,己酸質(zhì)量濃度反而降低。說明過高或偏低的乙醇和乳酸添加比都不利于己酸的形成。

不同乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比對己酸產(chǎn)量和產(chǎn)率的影響見表4。由表4可知,隨著乙醇比例的增加,己酸產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢,在乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比為2∶1時,己酸產(chǎn)率達到最高,達99.78 mg/g,此時發(fā)酵液中底物的轉(zhuǎn)化效率更高,對原料高粱的利用更充分。因此適當提高乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比,能有效地促進己酸的生成,當乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比為2∶1時,為己酸發(fā)酵的優(yōu)化條件。

表4 不同乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比對己酸產(chǎn)量和產(chǎn)率的影響

2.6 己酸發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性分析

不同己酸發(fā)酵時期門和屬水平上的細菌群落組成情況見圖7,從3個發(fā)酵液樣本中檢測到5個門,82個屬的細菌。由圖7(a)可知,其中有5個細菌門,包括厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacter-iota)、擬桿菌門(Bacteroidetas)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi) ,其中占優(yōu)勢的菌群是厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidetas)。隨著發(fā)酵進行,厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)在發(fā)酵液中的相對含量呈現(xiàn)先減小再增加的變化趨勢,然而擬桿菌門(Bacteroidetas)呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢。由圖7(b)可知,己酸菌屬(Caproiciproducens)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium_sensu_stricto_1)、普氏菌屬(Prevotella)是發(fā)酵過程中的4個優(yōu)勢菌群。

圖7 己酸發(fā)酵過程中細菌門水平和屬水平群落組成Fig.7 Community composition of bacteria at phylum level and genus level during caproic acid fermentation

在發(fā)酵0 d時Caproiciproducens豐度僅8.58%,

隨著發(fā)酵進行己酸菌屬不斷富集,到發(fā)酵后期相對豐度達到37.81%。有研究表明Caproiciproducens能代謝半乳糖醇產(chǎn)生氫氣、乙醇、乙酸、丁酸和己酸[27],是濃香型白酒中的特征香味物質(zhì)己酸乙酯的主要合成菌[28]。Lactobacillus能利用碳源代謝產(chǎn)乳酸,為己酸的生成補充相應的電子供體。在發(fā)酵0 d時Lactobacillus豐度占比19.88%,在發(fā)酵8 d時豐度達到最高28.58%,但在發(fā)酵后期豐度僅有0.45%?？赡芤驗榘l(fā)酵后期,底物中的碳源消耗完全,乳酸菌開始衰亡[29],Caproiciproducens也因此逐漸占據(jù)優(yōu)勢。Prevotella在發(fā)酵過程中豐度呈現(xiàn)先增加后減小的變化趨勢,在第8 天時豐度達到最高26.94%,14天時豐度下降至6.59%,有研究表明普氏菌屬能降解淀粉、蛋白質(zhì)等大分子有機物質(zhì),代謝產(chǎn)生乙酸和丙酸等有機物[30],推測這些代謝物質(zhì)給其他微生物也提供了相應的碳源和氮源。

Clostridium_sensu_stricto_1、Clostridium_sensu_stricto_12在發(fā)酵后期的豐度分別占11.27%、13.65%。這類梭菌屬微生物擁有較廣泛可利用的底物,促進了厭氧發(fā)酵體系中的碳、氮和硫元素的循環(huán),Clostridium_sensu_stricto_1在白酒窖泥中也是重要的微生物,不僅為己酸乙酯的形成提供了前體物質(zhì),而且對厭氧發(fā)酵體系的微生物結(jié)構(gòu)起到了穩(wěn)定的作用。有些梭菌利用乳酸代謝生成轉(zhuǎn)化丁酸,丁酸進一步作為電子受體促進己酸的形成[31]。也有研究發(fā)現(xiàn)通過乙醇對瘤胃微生物富集后Clostridium_sensu_stricto_12成了優(yōu)勢菌屬,并與己酸產(chǎn)量呈正相關(guān)關(guān)系[32]。推測該梭菌類微生物能利用乙醇和乳酸,通過代謝為Caproiciproducens提供了更多的營養(yǎng)物質(zhì),這也間接證明之前乙醇和乳酸組合發(fā)酵時己酸生成效果更佳的結(jié)論。

2.7 己酸發(fā)酵過程中微生物與代謝物質(zhì)相關(guān)性分析

在己酸發(fā)酵過程中,代謝物質(zhì)含量與微生物相關(guān)性分析結(jié)果見圖8。由圖8可知,Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter的相對豐度和己酸、丁酸含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05),與乙醇和乳酸含量呈現(xiàn)顯著負相關(guān)(P<0.05);Pseudoclavibacter是放線菌門微生物,郭威等[33]將放線菌和己酸菌共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)放線菌不產(chǎn)生己酸,但可以耐受一定量的乙醇,并促進己酸菌利用乙酸和乙醇產(chǎn)己酸,結(jié)合之前最優(yōu)己酸發(fā)酵條件,推測在乙醇發(fā)酵液與乳酸發(fā)酵液添加比較高時(2∶1),可能更有利于該類微生物富集。Clostridium_sensu_stricto_1、Atopobium、Weissella相對豐度與乙酸含量呈顯著負相關(guān)(P<0.05);Prevotella、norank_f_Eggerthellaceae相對豐度與乙酸含量呈顯著正相關(guān),Fraga等[34]研究也表明在瘤胃中乙酸和丁酸比例的提高和普雷沃氏菌(Prevotellabryantii3C5) 具有較強的關(guān)聯(lián)性。

***表示兩指標之間差異顯著(P<0.05)。

研究表明己酸發(fā)酵過程中,Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter可能利用乙醇和乳酸等有機物,代謝生成了己酸或生成了促進己酸合成的前體物質(zhì)。其余大多微生物主要與短鏈脂肪酸(乙酸、丁酸)有較強的關(guān)聯(lián)。

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明,合理控制發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵溫度等條件,可提高第一步發(fā)酵中相應發(fā)酵液的轉(zhuǎn)化率,最終丁酸發(fā)酵液中的丁酸、乙酸產(chǎn)量達到20.16 g/L和8.47 g/L,淀粉轉(zhuǎn)化率達到76.02%;乳酸發(fā)酵液中的乳酸產(chǎn)量和乳酸產(chǎn)率分別達到11.41 g/L 和42.48%;乙醇發(fā)酵液中的乙醇產(chǎn)率可達95.06%。繼續(xù)優(yōu)化己酸發(fā)酵工藝,發(fā)現(xiàn)當乙醇發(fā)酵液和乳酸發(fā)酵液同時作為電子供體時,己酸產(chǎn)量和產(chǎn)率均顯著提升,分別達到4.15 g/L和75.20 mg/g, 且當乙醇發(fā)酵液和乳酸發(fā)酵液中乙醇與乳酸添加的質(zhì)量濃度比為2∶1時,己酸產(chǎn)量和產(chǎn)率均達到最高,分別為6.65 g/L和99.78 mg/g。對己酸發(fā)酵過程中微生物與己酸的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),發(fā)酵過程中和己酸含量呈正相關(guān)的微生物有Caproiciproducens、Clostridium_sensu_stricto_12、Pseudoclavibacter。其中Caproiciproducens隨著發(fā)酵進行不斷富集,到發(fā)酵后期相對豐度達到37.81%,是己酸形成的主要貢獻者。希望研究可為在無外源電子供體添加條件下,實現(xiàn)高粱兩步法厭氧發(fā)酵生產(chǎn)己酸提供理論基礎(chǔ),為拓展高粱的資源化利用提供新思路。