龔頻,龍輝,王小娟,楊文娟,常相娜,陳福欣

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,陜西 西安,710021) 2(西安科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,陜西 西安,710054)

紅棗是鼠李科棗屬植物,是一種很好的藥食同源的食品,具有很高的的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。在目前的研究中表明紅棗中含有多糖、黃酮、環(huán)磷腺苷,生物堿等多種活性物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗炎、抗氧化等多種活性[3-6]。環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)作為第二信使,可以通過(guò)G蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)抑制或者激活酶的活性,正因?yàn)槿绱?環(huán)磷腺苷對(duì)于糖脂代謝有一定的調(diào)節(jié)作用[7-10]。此外,環(huán)磷腺苷還具有抑制血小板凝集[11]、抗過(guò)敏[12-13]的作用。且環(huán)磷腺苷及其衍生物已經(jīng)用于心絞痛、急性心肌梗死的輔助治療[14-15]。

環(huán)磷腺苷的提取多來(lái)自于動(dòng)物內(nèi)臟,成本偏高,并且采用化學(xué)合成方法得到環(huán)磷腺苷的副產(chǎn)物多,浪費(fèi)嚴(yán)重,對(duì)環(huán)境污染大,使成本居高不下[16-18]。紅棗中含有豐富的環(huán)磷腺苷[19-20],環(huán)磷腺苷作為第二信使,通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)酶、激素等物質(zhì),發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)、疾病調(diào)控的作用,具有潛在的抗過(guò)敏作用[21]。乳霜具有操作簡(jiǎn)單、膚感清爽、有較好的鋪展性等優(yōu)點(diǎn),為紅棗環(huán)磷腺苷的精深加工提供了思路。本研究以金絲小棗為原料,以環(huán)磷腺苷的含量為指標(biāo),選用響應(yīng)面法對(duì)環(huán)磷腺苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)提取物進(jìn)行應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金絲小棗,樂(lè)天食品有限公司;無(wú)水乙醇(分析純)、甲醇(色譜純)、磷酸二氫鉀(分析純),天津市天力化學(xué)試劑有限公司;cAMP標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純),上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀,配有(CSHTMC18 250 mm×4.6 mm,5 μm的XSelect色譜柱),Waters;立式真空冷凍干燥機(jī),上海爭(zhēng)巧科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 提取方式

分別考察水浴提取與超聲輔助提取對(duì)于環(huán)磷腺苷得率的影響。精密稱(chēng)取干燥紅棗粉末5 g,置入小燒杯中,加入50 mL蒸餾水,分別在數(shù)顯恒溫水浴鍋中80 ℃和超聲波輔助下提取30 min,提取液用臺(tái)式離心機(jī)在6 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min,分別取其上清液添加蒸餾水至50 mL,并取10 mL上清液定容100 mL。再取少量稀釋液過(guò)0.22 μm濾膜,于-20 ℃貯存,備用,用HPLC檢測(cè)提取液中環(huán)磷腺苷的含量。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 料液比對(duì)提取率的影響

精密稱(chēng)取干燥紅棗粉末5 g,分別置入5個(gè)小燒杯中,分別加入30、60、90、120、150 mL的蒸餾水配成料液(g∶mL)比分別為1∶6、1∶12、1∶18、1∶24、1∶30的溶液,保鮮膜封住燒杯口,用超聲提取60 min得到提取液,提取液用臺(tái)式離心機(jī)在6 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心10 min,分別取其上清液添加蒸餾水至原體積,并取10 mL上清液定容至分別100 mL。再取少量稀釋液過(guò)0.22 μm濾膜,于-20 ℃貯存,備用,用HPLC檢測(cè)提取液中環(huán)磷腺苷的含量。

1.3.2.2 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

精密稱(chēng)取干燥紅棗粉末5 g,分別置入5個(gè)小燒杯中,加入90 mL的蒸餾水,保鮮膜封住燒杯口,在30 ℃的溫度下,用超聲提取的方式分別提取30、45、60、75、90 min,提取液按照1.3.2.1節(jié)的方式處理。

1.3.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

精密稱(chēng)取干燥紅棗粉末5 g,分別置入5個(gè)小燒杯中,分別加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為0、25%、50%、75%、100%的溶液90 mL,保鮮膜封住燒杯口,在30 ℃的溫度下,用超聲提取的方式提取60 min,提取液按照1.3.2.1節(jié)的方式處理。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

1.3.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

本試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,利用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)組,以環(huán)磷腺苷的含量為響應(yīng)值,試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素及水平Table 1 Response surface optimization test factors and levels

1.3.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)得到的最佳提取工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行4次重復(fù)性驗(yàn)證試驗(yàn),判斷模型的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。

1.3.4 總環(huán)磷腺苷得率的計(jì)算

采用HPLC法[22]測(cè)定環(huán)磷腺苷的含量。

1.3.4.1 色譜條件

色譜條件為:色譜柱為pH 2-11,XSelect色譜柱 CSHTMC18 250 mm×4.6 mm,5 μm,流動(dòng)相是V(甲醇)∶V(0.05 mol/L磷酸二氫鉀)=20∶80,流速1.0 mL/min,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4.2 標(biāo)曲的制作

精密稱(chēng)取環(huán)磷腺苷標(biāo)準(zhǔn)品50 mg,用超純水定容于1 000 mL的容量瓶中,配制成50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液,并稀釋母液分別得到25、12.5、6.25、3.125、0.125 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。使用1.3.4.1節(jié)的色譜條件檢測(cè),每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣3次,取平均值作為峰面積,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),得到環(huán)磷腺苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.3 總環(huán)磷腺苷的測(cè)定及得率的計(jì)算

環(huán)磷腺苷的得率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:W表示環(huán)磷腺苷得率,%;c表示根據(jù)HPLC峰面積計(jì)算出的環(huán)磷腺苷的質(zhì)量濃度,mg/mL;D表示溶液稀釋倍數(shù);V表示供試品溶液體積,mL;m表示紅棗取樣量,mg。

1.3.5 乳霜的制備

1.3.5.1 乳霜配方設(shè)計(jì)

按照紅棗環(huán)磷腺苷的最佳提取工藝得到提取液,利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮除去提取液中的乙醇,并濃縮,凍干成粉末。利用凍干粉設(shè)計(jì)一款具有抗過(guò)敏效果的乳霜,具體的原料及功能如表2所示。

表2 乳霜試劑Table 2 Cream reagents

1.3.5.2 制備工藝

將油相與水相分別加入2個(gè)燒杯中,按照配方配比添加試劑。再把油相和水相分別加熱至80 ℃,直到所有試劑全部融化,把水相倒入油相中,攪拌使其充分乳化,室溫冷卻到40 ℃時(shí)加入苯氧乙醇和玫瑰純露。

1.3.6 乳霜穩(wěn)定性檢測(cè)

1.3.6.1 感官評(píng)價(jià)

設(shè)計(jì)出乳霜的感官評(píng)價(jià)表,通過(guò)涂展性、清爽度、黏稠度、細(xì)膩性等4個(gè)指標(biāo)進(jìn)行判斷。涂展性:檢測(cè)產(chǎn)品使用過(guò)程中是否會(huì)泛白。清爽度:檢測(cè)產(chǎn)品使用過(guò)程中是否有油膩感。黏稠度:檢測(cè)產(chǎn)品的流動(dòng)性是否合適。細(xì)膩性:檢測(cè)產(chǎn)品使用過(guò)程中是否細(xì)膩,是否有顆粒物。

1.3.6.2 耐熱耐寒測(cè)試

取適量的樣品,分成3組,分別置入50 ℃烘箱,4 ℃的冰箱和-20 ℃冰箱中,在3種不同的條件下分別放置24 h,觀察是否有油水分離的現(xiàn)象。

1.3.6.3 離心穩(wěn)定性測(cè)試

在離心管中加入適量的樣品,放入到37 ℃的恒溫箱中1 h,然后使用臺(tái)式離心機(jī)在2 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心30 min,觀察是否有油水分離。

1.3.6.4 刺激性測(cè)試

將該乳霜涂敷手臂內(nèi)側(cè),每天2次,連續(xù)3 d涂抹,并在24 h后觀察涂敷部位,未出現(xiàn)疼痛、紅腫、起疹、水皰等不良反應(yīng)?？勺C明本制劑對(duì)皮膚無(wú)刺激性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,采用GraphPad Prism 8.0.2和Design Expert 8.0.6 進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理和繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化

2.1.1 提取方式的確定

如圖1所示,可以明顯看見(jiàn)超聲提取的環(huán)磷腺苷得率大于水浴提取,因此提取的方式選擇超聲輔助提取。這可能是超聲引起的空化現(xiàn)象所造成的。超聲空化中形成的微小氣泡爆裂時(shí)會(huì)產(chǎn)生極大的壓力,使植物細(xì)胞壁快速破裂,同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放,從而顯著提高提取效率。

圖1 提取方式對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響Fig.1 Effect of extraction methods on the yield of cAMP

2.1.2 料液比對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響

如圖2所示,隨著提取液的增加,環(huán)磷腺苷的得率在逐漸增加,但是料液比達(dá)到一定程度時(shí),環(huán)磷腺苷的得率變化不大,說(shuō)明環(huán)磷腺苷的提取量接近飽和,再增大料液比會(huì)造成資源的浪費(fèi)。因此選擇料液比為1∶24(g∶mL)較合適。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響

如圖3所示,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),剛開(kāi)始環(huán)磷腺苷的得率在逐漸升高,但是到達(dá)一定時(shí)間后,環(huán)磷腺苷的得率反而有所下降,可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的超聲使得環(huán)磷腺苷結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致得率降低。因此選擇提取時(shí)間為60 min較合適。

圖2 料液比對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on the yield of cAMP

圖3 提取時(shí)間對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of cAMP

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響

如圖4所示,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,環(huán)磷腺苷的得率也在逐漸增加,但在75%以后環(huán)磷腺苷的得率變化不大,且從經(jīng)濟(jì)方面考慮,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)較合適。

圖4 乙醇含量對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響Fig.4 Effect of ethanol content on the yield of cAMP

2.1.5 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

按照表1的方式設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)組,共得到17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),其中分析的試驗(yàn)點(diǎn)有12個(gè),中心點(diǎn)有5個(gè)。采用響應(yīng)面法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以環(huán)磷腺苷的得率為響應(yīng)值,最終得到的回歸方程為環(huán)磷腺苷得率=711.358 75+1.247 20A+38.339 04B+11.863 95C+0.102 33AB+0.054 40AC-0.102 64BC-0.059 246A2-0.749 99B2-0.099 243C2。

從表3中可以看出整個(gè)響應(yīng)面模型的P=0.020 5<0.05,所以響應(yīng)面模型是顯著的,同時(shí)失擬項(xiàng)的P=0.924 7>0.1,這說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果和模型擬合良好,可以使用模型推測(cè)環(huán)磷腺苷得率最大時(shí)的最優(yōu)提取條件。且由表3可以看出,各個(gè)因素對(duì)于環(huán)磷腺苷得率的影響由大到小分別是提取時(shí)間>料液比>乙醇體積分?jǐn)?shù)。其中每?jī)蓛梢蛩叵嗷プ饔玫捻憫?yīng)面圖如圖5所示。

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 ANOVA of response surface model

在圖5中,X、Y軸為影響因素,Z軸為環(huán)磷腺苷的含量,從圖中可以明顯看出乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比的相互作用,乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間的相互作用以及料液比與提取時(shí)間的相互作用。且每2個(gè)因素相互作用,都明顯存在最高點(diǎn)。根據(jù)響應(yīng)面法建立的模型,最終得到了最佳工藝,最佳的提取條件是料液比為1∶25.42(g∶mL)、提取時(shí)間63.51 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)61.63%,理論得率為191.15 μg/g。

2.1.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

在理論條件下,提取的環(huán)磷腺苷的得率為191.15 μg/g。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行4次重復(fù)性實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表4所示,可見(jiàn)預(yù)測(cè)值與實(shí)際提取值吻合度較好,模型具有良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性。

2.2 乳霜制備

2.2.1 乳霜配方

經(jīng)過(guò)配方研究后,最終得到的各成分的占比如表5所示:

a-乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對(duì)cAMP得率影響的響應(yīng)面和等高線;b-乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)cAMP得率影響的響應(yīng)面和等高線; c-料液比和提取時(shí)間對(duì)cAMP得率影響的響應(yīng)面和等高線圖5 兩個(gè)因素相互作用的等高線與響應(yīng)面Fig.5 Contours and response surface of interaction between two factors注:左為等高線,右為響應(yīng)面。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability test results

表5 乳霜配方Table 5 Cream formula

2.2.2 乳霜質(zhì)量檢測(cè)

2.2.2.1 感官評(píng)價(jià)

選取皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)的5名受試者的使用反饋,并對(duì)其主觀評(píng)價(jià)。由乳霜的感官評(píng)價(jià)(圖6)可知,乳霜在涂展性、細(xì)膩性、清爽度、黏稠性方面均有良好的性能。

圖6 乳霜感官評(píng)價(jià)Fig.6 Sensory evaluation of cream注:優(yōu)良:9～10分;良好:7～8分;一般5～6分; 較差:3～4分;很差:1～2分。

2.2.2.2 耐熱耐寒試驗(yàn)

如圖7所示,乳霜在50 ℃烘箱、4 ℃的冰箱和-20 ℃冰箱中,在3種不同的環(huán)境中進(jìn)行測(cè)試,未發(fā)現(xiàn)有油水分離現(xiàn)象,說(shuō)明乳霜的乳化體系穩(wěn)定,且紅棗水溶液對(duì)于乳霜并無(wú)不良影響。

a-耐寒試驗(yàn)前;b-耐寒試驗(yàn)后圖7 乳霜耐熱耐寒試驗(yàn)前后對(duì)比Fig.7 Cream before and after heat and cold tolerance test

2.2.2.3 離心穩(wěn)定性試驗(yàn)

如圖8所示,乳霜在2 000 r/min的條件下離心30 min并未發(fā)現(xiàn)油水分離現(xiàn)象,可見(jiàn)乳霜的離心穩(wěn)定性良好。

a-離心穩(wěn)定性試驗(yàn)前;b-離心穩(wěn)定性試驗(yàn)后圖8 乳霜離心穩(wěn)定性試驗(yàn)前后對(duì)比Fig.8 Cream before and after the centrifuge stability test

2.2.2.4 皮膚刺激性試驗(yàn)

在進(jìn)行感官評(píng)價(jià)時(shí)尋找了5位志愿者,在皮膚上涂抹后并未發(fā)現(xiàn)紅腫瘙癢等過(guò)敏現(xiàn)象,可見(jiàn)乳霜對(duì)機(jī)體無(wú)刺激性。

3 結(jié)論與討論

本研究考查了提取方式對(duì)環(huán)磷腺苷得率的影響,發(fā)現(xiàn)超聲提取比水提取的得率更高,同時(shí)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)陳愷等[23]的水浴提取最高得率為157.3 μg/g,明顯小于在超聲輔助下提取的cAMP得率,可見(jiàn)在超聲波輔助下提取能顯著提高cAMP的得率。乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間3個(gè)單因素對(duì)于環(huán)磷腺苷得率的影響,然后采用了Design-Expert V 8.0.6軟件進(jìn)行中心組合設(shè)計(jì)法設(shè)計(jì)響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)組,并建立了模型,得到了預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝,在預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝基礎(chǔ)上,進(jìn)行4次試驗(yàn)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)理論得率與實(shí)際得率吻合度達(dá)到98.9%,最終確定了最佳提取工藝為:料液比1∶25.42(g∶mL)、提取時(shí)間63.51 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)61.63%。在此條件下提取的環(huán)磷腺苷理論得率為191.15 μg/g,實(shí)際得率為189.07 μg/g。

過(guò)敏性疾病大多是細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷濃度下降所致[24]。由于紅棗產(chǎn)量過(guò)剩,本研究對(duì)其進(jìn)行精深加工,促進(jìn)紅棗資源的合理利用。除了環(huán)磷腺苷具有良好的抗過(guò)敏活性外,其提取物中還存在大量的多糖、黃酮、酚類(lèi)等物質(zhì),具有良好的抗氧化特性,能有效增加乳霜的功能[25]。本研究利用紅棗提取物制備的乳霜,經(jīng)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)本乳霜穩(wěn)定性良好,并有望開(kāi)發(fā)成為一款抗過(guò)敏乳霜。