韓帥鵬,曾萬祥,伍丹惠,藍(lán)秀權(quán),華濤,程建華,*,周心慧,周辛

1(華南理工大學(xué) 環(huán)境與能源學(xué)院,廣東 廣州,510006) 2(湖南金昌生物技術(shù)有限公司,湖南 衡陽,421300)3(華南協(xié)同創(chuàng)新研究院,廣東 東莞,523808)

油茶(CamelliaoleiferaAble)為世界四大木本油料作物[1],我國油茶種植總規(guī)模已達(dá)446.67萬hm2[2]。油茶籽榨油后會產(chǎn)生大量的油茶粕,油茶粕中含有茶皂素、多糖、蛋白質(zhì)、多酚、黃酮等多種有效成分[3]。目前,大部分油茶粕被用做燃料進(jìn)行焚燒或者直接廢棄,這一優(yōu)質(zhì)資源并未得到充分利用[4]。油茶粕中的茶皂素含量為10%～15%[5],茶皂素是一類由有機(jī)酸、糖體和皂苷元組成的五環(huán)三萜類化合物[6],為優(yōu)良的天然非離子型表面活性劑[7],具有乳化、分散、去污、發(fā)泡、穩(wěn)泡等多種特性,在日化、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等多個(gè)領(lǐng)域有良好的應(yīng)用[8],因此,加強(qiáng)對油茶粕的綜合利用研究對提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。

目前,茶皂素的提取工藝以水提法和醇提法為主。水提法雖然成本較低,但提取率和純度不高,不易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)[9],醇提法在提取過程中消耗大量甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑,成本高、工藝復(fù)雜、設(shè)備要求較高[10]。王文杰等[11]采用二次發(fā)酵法(先在玉米粉加入復(fù)合酶進(jìn)行酶解,接入酵母菌發(fā)酵3～4 d得到玉米醪液,再添加油茶粕后第二次發(fā)酵2～3 d)提取茶皂素,茶皂素的提取率達(dá)80%左右,且粗提茶皂素純度為62.37%,此法工藝流程較為復(fù)雜繁瑣。利用微生物發(fā)酵提取植物中的有效成分,同時(shí)具有降低原料毒副作用,改善其功效性的作用,本研究采用2種乳桿菌協(xié)同發(fā)酵促進(jìn)油茶粕中茶皂素的浸出,建立了一種提取率較高、綠色環(huán)保的茶皂素生產(chǎn)新工藝,并將其與傳統(tǒng)水提、醇提工藝以及單菌發(fā)酵提取進(jìn)行對比分析,對油茶粕資源開發(fā)模式具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶粕(粉碎過60目篩),湖南金昌生物技術(shù)有限公司提供;植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum, LP)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei, LC),仙農(nóng)生物科技(上海)有限公司;MRS肉湯、大豆蛋白胨,環(huán)凱微生物科技有限公司;葡萄糖、K2HPO4,天津市大茂化學(xué)試劑廠;無水乙醇、正丁醇、三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)、98%H2SO4、H2O2,廣州化學(xué)試劑廠;抗壞血酸(維生素C)、考馬斯亮藍(lán)、牛血清蛋白,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;茶皂素標(biāo)準(zhǔn)品、鐵氰化鉀、三氯乙酸、DPPH、ABTS,上海麥克林生化科技有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A高效液相色譜儀,日本島津;U2910紫外可見分光光度計(jì),日本Hitachi公司;SQ510C高壓蒸汽滅菌鍋、DP43C真空干燥廂,雅馬拓科技貿(mào)易有限公司;3k15臺式高速冷凍離心機(jī),德國Sigma公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,德國IKA公司;T15表面張力儀,德國SITA公司;TENSOR27傅里葉紅外光譜儀,德國布魯克公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茶皂素的制備

1.3.1.1 發(fā)酵法

稱取10 g油茶粕,以料液比(1∶10,g∶mL)加入到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中121 ℃滅菌15 min,冷卻至室溫后分別接入體積分?jǐn)?shù)為2%的LP、LC、混菌(LP+LC,1∶1)種子液,在37 ℃條件下發(fā)酵48 h, 以6 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min后過0.45 μm濾膜得到LP發(fā)酵液、LC發(fā)酵液、混菌發(fā)酵液。將混菌發(fā)酵液與水飽和正丁醇混合靜置過夜,將萃取劑60 ℃下減壓旋蒸濃縮,真空干燥8 h得到混菌發(fā)酵茶皂素。

1.3.1.2 水提法

稱取10 g油茶粕和水以料液比1∶10(g∶mL)混合后80 ℃水浴浸提6 h,冷卻后以6 000 r/min,離心10 min,上清液過0.45 μm濾膜得到水提液。將水提液與水飽和正丁醇混合靜置過夜,將萃取劑60 ℃下減壓旋蒸濃縮,回收正丁醇,濃縮液真空干燥8 h得到水提茶皂素。

1.3.1.3 醇提法

稱取10 g油茶粕和體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液以料液比1∶10(g∶mL)混合后70 ℃水浴浸提2 h,冷卻后6 000 r/min,離心10 min,上清液過0.45 μm濾膜過濾得到醇提液。將醇提液減壓旋蒸后,真空干燥8 h得到醇提茶皂素。

1.3.2 提取液成分分析

1.3.2.1 茶皂素的測定

參考江勛等[12]的方法并有所改進(jìn),采用高效液相色譜儀測定提取液中茶皂素含量。色譜條件為:COSMOSIL Packed Column C18柱(4.6 mm×150 mm);柱溫為30 ℃;紫外檢測波長:267 nm;流動(dòng)相:體積分?jǐn)?shù)為0.1%TFA水溶液和甲醇,V(0.1%TFA)∶V(甲醇)=60∶40;總流速:0.5 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=1 656x-35 428,R2=0.999 7,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣液中的茶皂素含量。茶皂素的浸出率計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:c為提取液中茶皂素的質(zhì)量濃度,mg/mL;V為提取液的體積,mL;m1為油茶粕添加量,mg。

1.3.2.2 茶皂素純度、提取率和表面活性指標(biāo)的計(jì)算

茶皂素純度、提取率的計(jì)算如公式(2)～公式(3)所示:

(2)

(3)

式中:X為茶皂素純度,%;Y為茶皂素提取率,%;m1為油茶粕添加量,mg;m2為提取所得茶皂素粗品質(zhì)量,mg;m3為HPLC測樣所用茶皂素樣品的質(zhì)量,mg;c為HPLC測得茶皂素樣品質(zhì)量濃度,mg/mL;V為測樣所用溶液體積,mL。

將茶皂素樣品配制成2 mg/mL的溶液,在25 ℃下采用鉑金環(huán)法測定表面張力。分別將茶皂素樣品配制為2 mg/mL的磷酸緩沖液(pH=6.2),取25 mL用均質(zhì)機(jī)12 000 r/min高速分散1 min。記錄分散結(jié)束后的體積為V0,靜置30 min后的體積為V1,起泡性和泡沫穩(wěn)定性的計(jì)算如公式(4)～公式(5)[13]所示:

(4)

(5)

1.3.2.3 多糖的測定

取2 mL樣液,置于具塞試管中,以2 mL的蒸餾水作為空白對照,加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%苯酚溶液,搖勻,緩慢滴加5 mL濃硫酸搖勻,置于沸水浴中煮沸20 min,取出冷卻至室溫,在488 nm處測定吸光值[14]。

1.3.2.4 多酚的測定

運(yùn)用Folin-Ciocalteau法[15]測定提取液中的多酚含量,取樣液1 mL加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為10%福林酚溶液,反應(yīng)10 min后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%Na2CO3溶液,避光反應(yīng)1 h后在765 nm處測得吸光值。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣液中的多酚含量。

1.3.2.5 黃酮的測定

取待測樣液 6 mL于25 mL容量瓶中,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%亞硝酸鈉溶液1 mL,混勻靜置5 min后,加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%硝酸鋁溶液,混勻靜置5 min后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4% NaOH溶液10 mL,加水定容,搖勻后放置15 min后在500 nm波長處測定吸光值[16]。

1.3.2.6 蛋白質(zhì)的測定

采取考馬斯亮藍(lán)法[17],取待測溶液1 mL加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G250溶液搖勻,在室溫下反應(yīng)5 min,分光光度計(jì)595 nm波長處測定樣品組的吸光值,以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣液中蛋白質(zhì)濃度。

1.3.3 抗氧化能力的測定

將水提、醇提和混菌發(fā)酵3種工藝提取得到的茶皂素樣品用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇溶液配制成0.25～4 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的溶液,以維生素C為陽性對照,分別測定3種茶皂素對DPPH自由基、ABTS自由基陽離子、羥自由基的清除能力和還原力。

1.3.3.1 DPPH自由基清除率

參考馮燕茹等[18]的方法,取2 mL不同質(zhì)量濃度茶皂素溶液,加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH 乙醇溶液,混勻靜置30 min,517 nm測吸光值,按公式(6)計(jì)算不同濃度樣品的DPPH自由基清除率:

(6)

式中:A0,蒸餾水+DPPH的吸光值;A1,樣品溶液+DPPH的吸光值;A2,樣品溶液+無水乙醇的吸光值。

1.3.3.2 ABTS陽離子自由基清除率

參考肖亨[19]的方法,略作修改,將7 mmol/L的ABTS溶液和2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液等體積混合,黑暗中反應(yīng)12 h,用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇將溶液稀釋至734 nm處的吸光值為0.7。取0.4 mL不同質(zhì)量濃度茶皂素溶液,加入到3 mL稀釋后的ABTS混合液中,混勻后室溫避光沉淀6 min,然后測量波長為734 nm的反應(yīng)溶液的吸光值。ABTS陽離子自由基清除率計(jì)算如公式(7)所示:

(7)

式中:A0,以95%乙醇代替樣液的吸光值;A1,樣品反應(yīng)溶液的吸光值。

1.3.3.3 羥自由基(·OH)清除率

參考楊琦等[20]的方法并稍作修改,取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的茶皂素溶液,依次加入0.5 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液和0.5 mL 6 mmol/L的H2O2溶液,充分混勻后于室溫下反應(yīng)10 min,再分別加入0.5 mL 6 mmol/L水楊酸混勻,室溫反應(yīng)30 min,在510 nm處測得吸光值為A1。在上述反應(yīng)體系中,以無水乙醇代替水楊酸,測定吸光值為A2;以蒸餾水代替樣品溶液,測定吸光值為A0。羥自由基清除率計(jì)算如公式(8)所示:

(8)

1.3.3.4 還原力

參考SAVI等[21]的方法,略作修改,分別吸取不同質(zhì)量濃度的茶皂素溶液0.5 mL,加入0.5 mL(0.2 mol/L,pH=6.6)磷酸緩沖液、0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%鐵氰化鉀,在50 ℃的水浴鍋中加熱30 min,冷卻后,加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%三氯乙酸,3 000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,加入1 mL蒸餾水和0.4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% FeCl3溶液,靜置10 min,靜置10 min,以蒸餾水為參比,700 nm下測定吸光值A(chǔ)0,用蒸餾水代替各樣品測得吸光值A(chǔ)1,還原力計(jì)算如公式(9)所示:

總還原力=A0-A1

(9)

1.3.4 傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)分析

在干燥條件下,將茶皂素樣品與KBr混合后壓片,傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描,得到紅外光譜圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液成分分析

不同工藝提取液的茶皂素濃度及浸出率如圖1所示,其中水提液的質(zhì)量濃度最低,僅為18.11 mg/mL?；炀l(fā)酵液的質(zhì)量濃度最高,達(dá)到21.86 mg/mL,超過醇提液濃度,比水提液濃度高20.77%。LP發(fā)酵液與醇提液質(zhì)量濃度無顯著差異,顯著高于LC發(fā)酵液,而混菌發(fā)酵液質(zhì)量濃度顯著優(yōu)于2種單菌發(fā)酵液(P<0.05)。在2種微生物的共同作用下,高效促進(jìn)茶皂素從植物細(xì)胞中釋放,提高了浸出率。5種提取液的茶皂素浸出率大小關(guān)系為醇提液>混菌發(fā)酵液>LP發(fā)酵液>LC發(fā)酵液>水提液。其中,醇提法浸出率更高的原因是由于醇提工藝更易實(shí)現(xiàn)固液分離,所得到的提取液體積多于其他幾種工藝。混菌發(fā)酵提取液的浸出率相較于水提和單菌種發(fā)酵均有明顯提升。

不同工藝提取液的其他有效成分含量如表1所示。5種提取液的多糖含量具有顯著性差異(P<0.05),其中水提液中多糖含量最高,為(14.66±0.26) mg/mL,醇提液次之,3種發(fā)酵液多糖含量相對較低,這是由于微生物發(fā)酵過程中消耗一部分多糖作為生長因子。提取液中多酚質(zhì)量濃度在0.93～1.14 mg/mL,其中醇提液的質(zhì)量濃度最高,為(1.14±0.02) mg/mL;混菌發(fā)酵液濃度高于2種單菌發(fā)酵液,與水提液濃度無顯著差異。各提取液的黃酮質(zhì)量濃度為0.85～1.06 mg/mL,其大小關(guān)系為醇提液>混菌發(fā)酵液>LP發(fā)酵液>水提液>LC發(fā)酵液;混菌發(fā)酵液濃度與醇提液無顯著差異,顯著高于水提液(P<0.05)。蛋白質(zhì)濃度受提取工藝的影響較大,水提液蛋白質(zhì)濃度最高,顯著高于其他工藝提取液(P<0.05),醇提液濃度較低是由于蛋白質(zhì)在乙醇溶液中比較難溶。LC發(fā)酵液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度最低,僅為(1.59±0.08) mg/mL。這是由于微生物生長代謝過程中會將一部分植物蛋白作為氮源進(jìn)行利用。

圖1 油茶粕提取液中茶皂素濃度和浸出率Fig.1 Concentration and leaching rate of tea saponin in extraction solution of Camellia oleifera meal注:小寫字母不同表示茶皂素濃度具有顯著差異(P<0.05)。

表1 不同提取液中的有效成分含量Table 1 Contents of active components in different extraction solutions

2.2 茶皂素的純度、提取率和表面活性指標(biāo)

水提、醇提和混菌發(fā)酵法所提取茶皂素的純度和提取率及表面活性指標(biāo)如表2所示。水提法工藝雖然簡單、易于操作,但產(chǎn)品純度不高,為53.2%,且提取率僅有9.60%,不能很好地滿足工業(yè)使用要求。醇提法的純度和提取率分別為69.6%、13.44%?；炀l(fā)酵茶皂素的純度和提取率最高,分別為75.2%和14.12%,該方法明顯優(yōu)于水提法。發(fā)酵茶皂素具有更強(qiáng)降低溶液表面張力的能力,溶液表面張力為39.2 mN/m。在25 ℃、pH=6.2、質(zhì)量濃度為2 mg/mL條件下,混菌發(fā)酵茶皂素的起泡性和泡沫穩(wěn)定性最高,分別為128%、96.9%,優(yōu)于水提茶皂素和醇提茶皂素,具有更好的泡沫性能,說明混菌發(fā)酵法所得的茶皂素產(chǎn)品具有更好的表面活性,在日化領(lǐng)域有較好的適用性。

表2 不同茶皂素的純度、提取率和表面活性指標(biāo)Table 2 Purity, extraction rate, and surface activity index of different tea saponin

2.3 抗氧化性分析

水提法、醇提法和混菌發(fā)酵法所提取的茶皂素的抗氧化測試結(jié)果如圖2-a～圖2-c所示,在0.25～4 mg/mL內(nèi),茶皂素對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基和羥自由基的清除率隨著樣品質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢。在同一質(zhì)量濃度下醇提茶皂素的DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率均高于水提茶皂素和發(fā)酵茶皂素,低于維生素C。DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)常被用作植物提取物的抗氧化活性評價(jià),由圖2-a可知,當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),三者對DPPH自由基的清除率分別達(dá)到了(79.14±0.78)%、(93.42±1.12)%、(88.82±1.68)%,當(dāng)質(zhì)量濃度大于1 mg/mL時(shí),三者的清除率逐步趨于穩(wěn)定,略低于陽性對照維生素C,顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力。IC50代表達(dá)到50%抗氧化效果時(shí)的抗氧化劑濃度,其值越低代表抗氧化能力越強(qiáng)。由表3可知,水提、醇提、混菌發(fā)酵茶皂素清除DPPH自由基的IC50分別為0.522、0.303、0.373 mg/mL。由圖2-b可知,當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí),3種茶皂素清除ABTS陽離子自由基的清除率為(92.99±1.38)%、(99.51±0.25)%、(97.88±0.81)%,該質(zhì)量濃度下,醇提和混菌發(fā)酵茶皂素接近維生素C的抗氧化能力,水提、醇提、混菌發(fā)酵茶皂素清除ABTS陽離子自由基的IC50分別為0.620、0.434、0.533 mg/mL。

3種茶皂素對羥自由基具有較強(qiáng)的清除能力,當(dāng)質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),水提、醇提、混菌發(fā)酵茶皂素的清除率分別為(57.06±2.14)%、(45.81±2.75)%、(79.5±0.86)%,清除羥自由基的IC50分別為0.373、0.592、0.153 mg/mL。質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí),清除率分別達(dá)到了(97.75±0.77)%、(87.11±1.25)%、(99.52±0.23)%,該質(zhì)量濃度下混菌發(fā)酵茶皂素的清除率高于另外兩者,與維生素C相近。3種茶皂素的還原力測定結(jié)果如圖2-d所示,在700 nm處,反應(yīng)體系的吸光值越大代表還原力越強(qiáng),在0.25～4 mg/mL內(nèi),隨著質(zhì)量濃度的提高其還原力也隨之增高。在同一質(zhì)量濃度下,水提茶皂素的還原力最低,混菌發(fā)酵茶皂素表現(xiàn)出較強(qiáng)的還原能力,強(qiáng)于醇提茶皂素,低于陽性對照維生素C。

a-DPPH自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基清除率;c-羥自由基清除率;d-還原力圖2 不同工藝提取茶皂素的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of tea saponin extracted by different methods

表3 不同茶皂素抗氧化活性的IC50值 單位:mg/mL

2.4 紅外光譜分析

圖3 茶皂素的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 FT-IR spectra of tea saponin

3 結(jié)論

本文采用混菌發(fā)酵法提取油茶粕中的茶皂素,與水提、醇提、單菌發(fā)酵提取液中主要成分進(jìn)行對比分析。其中,混菌發(fā)酵液中茶皂素質(zhì)量濃度為(21.86±0.39) mg/mL,比水提法高20.77%,優(yōu)于醇提液和單菌發(fā)酵液?；炀l(fā)酵提取的茶皂素樣品純度為75.2%,提取率為14.12%;其表面張力值為39.2 mN/m,起泡性為128%,泡沫穩(wěn)定性為96.9%,優(yōu)于水提和醇提茶皂素?；炀l(fā)酵茶皂素對于DPPH自由基和ABTS陽離子自由基的清除能力優(yōu)于水提茶皂素,弱于醇提茶皂素;對羥自由基清除能力和還原力強(qiáng)于另外兩者,在4 mg/mL時(shí)與維生素C相近。該工藝在雙菌種協(xié)同作用下促進(jìn)茶皂素的浸出,提取物具有優(yōu)異的表面活性和抗氧化活性,提取過程更加高效環(huán)保,為茶皂素的工業(yè)化提取提供了新的思路。