王海東,張紅印,曹珺,李光哲,2,嚴(yán)銘銘,2*,趙大慶*

1(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),吉林省人參科學(xué)研究院,吉林 長(zhǎng)春,130117) 2(吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心,吉林 長(zhǎng)春,130117)

北五味子作為中華傳統(tǒng)中藥,主要分布于東北三省,是木蘭科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的成熟果實(shí)。北五味子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,屬上品,用藥歷史悠久,具有斂肺滋腎、生津收汗等功效[1]。五味子含有多種活性成分,主要為木脂素、三萜、多糖、蛋白質(zhì)、脂肪油和有機(jī)酸等[2-3]。現(xiàn)代研究表明五味子及其活性成分具有多種藥理作用[4-5],廣泛應(yīng)用于藥品和保健食品中,具有重要的研究意義和開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的基礎(chǔ),提供了理想的營(yíng)養(yǎng)和功能屬性,在生物體的新陳代謝中起著重要調(diào)節(jié)作用[6],目前,一些新的植物來(lái)源的蛋白質(zhì)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,這些植物蛋白不但極大地豐富了蛋白質(zhì)資源的利用,同時(shí)其優(yōu)良的理化性質(zhì)和功能特性也引起了廣大研究者的關(guān)注,越來(lái)越多的應(yīng)運(yùn)而生的功能性蛋白新產(chǎn)品層出不窮。因此,研究植物蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及其功能特性也成為挖掘蛋白類產(chǎn)品加工特性的重要手段[7]。

北五味子中含有約39%的蛋白質(zhì),高于花生[8]、葵花子[9]、腰果[10]等堅(jiān)果種子類蛋白,研究發(fā)現(xiàn)北五味子蛋白含有7種人體必需氨基酸,是一種較為優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)[11]。項(xiàng)目組前期研究表明,五味子組分蛋白中谷蛋白具有優(yōu)良的抗氧化活性[12]。為提高北五味子資源的綜合利用,增加北五味子蛋白類產(chǎn)品的附加值,本研究針對(duì)采用0 sborne四步法從北五味子脫脂粉中提取得到的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白,采用電泳、UV、傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared absorption,FTIR)及掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)、差示量熱掃描(differential scanning calorimetry,DSC)等方法結(jié)合經(jīng)典化學(xué)檢測(cè)手段對(duì)各組分蛋白的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能特性進(jìn)行比較,為提高五味子組分蛋白在健康食品和保健食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子藥材由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供,經(jīng)姜大成教授鑒定為木蘭科五味子屬植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的果實(shí)。

考馬斯亮藍(lán)R-250、甘氨酸(Gly)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine,TEMED)(分析純),美國(guó)sigma公司;30%丙烯酰胺、β-巰基乙醇、蛋白Marker、過(guò)硫酸銨(AP)、三羥甲基胺基甲烷(Tris) (分析純),北京索萊寶生物科技有限公司;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒,北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ALB-224萬(wàn)分之一天平、AB265-S十萬(wàn)分之一天平、S220-K-CN標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì)、DSC-3差示掃描量熱儀,梅特勒-托利多儀器有限公司;SCIENTZ-50F真空冷凍干燥機(jī),寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司;Mini-PROTEAN Tetra Cell型Bio-rad蛋白電泳儀,美國(guó)Bio-rad公司;UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、IRAffinity-1s傅里葉變換紅外光譜儀,日本島津儀器有限公司;LYNX6000 Sorvall LYNX型高速離心機(jī)、Multiskan MK3全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Invitrogen iBright FL 1000凝膠成像儀,美國(guó)Thermo Fisher公司;MiniSpin Plus 5920R高速離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 五味子組分蛋白提取

組分蛋白提取參考0 sborne四步法[13-14],略加修改,具體工藝如圖1所示。所得上清液A、B、C和D于蒸餾水中4 ℃透析48 h,間隔1 h換水1次,低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后于真空冷凍干燥機(jī)中凍干即得清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

圖1 五味子4種組分蛋白提取工藝流程Fig.1 Extraction process of four fractional proteins of Schisandra chinensis

1.3.2 組分蛋白提取率及營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

蛋白含量測(cè)定:參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》(凱氏定氮法),蛋白質(zhì)換算系數(shù)F為6.25,考馬斯亮藍(lán)比色法;水分含量測(cè)定:參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》(直接干燥法);灰分的測(cè)定:參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》(質(zhì)量法);脂肪的測(cè)定:參照GB/T 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》(索式抽提法)。按公式(1)計(jì)算各組分蛋白質(zhì)提取率:

(1)

式中:m2為凍干后組分蛋白質(zhì)量,g;m1為脫脂粉質(zhì)量,g。

1.3.3 結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

1.3.3.1 SDS-PAGE

SDS-PAGE參考BORCHANI等[14]和VINAYASHREE等[15]的方法稍加修改。制備質(zhì)量濃度為5 mg/mL組分蛋白樣品,8 000 r/min離心10 min,將上清液分別與還原型和非還原型蛋白上樣緩沖液按1∶1體積比混勻,沸水浴5 min后冷卻,分別使用濃度為5%和12%聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳,每個(gè)泳道上樣量為10 μL,濃縮膠和分離膠的電壓和時(shí)間分別設(shè)置為70 V,30 min和140 V,50 min?？捡R斯亮藍(lán)R-250室溫?fù)u床染色1 h,脫色液脫色數(shù)次至背景透明、條帶清晰后使用凝膠成像儀掃描成像。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率,計(jì)算出各組分蛋白的分子質(zhì)量。

1.3.3.2 Tris-Tricine-SDS-PAGE

超低分子質(zhì)量電泳根據(jù)Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒配制分離膠、夾層膠和濃縮膠,電泳槽置于冰水浴中,外槽加入陽(yáng)極緩沖液,內(nèi)槽加入陰極緩沖液,30 V預(yù)電泳10 min,上樣量10 μL,30 V電泳1 h,100 V電泳6～8 h至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部,考馬斯亮藍(lán)R-250室溫?fù)u床染色1 h,脫色數(shù)次至條帶清晰后使用凝膠成像儀掃描成像。

1.3.3.3 巰基和二硫鍵含量測(cè)定

參考文獻(xiàn)[16-17]的方法,將20 mg組分蛋白溶于10 mL 8 mol/L 脲0.1 mol/L Tris-Gly緩沖液中,8 000 r/min離心20 min,上清液備用。游離巰基的測(cè)定:5 mL上清液添加50 μL 4 mg/mL Ellman試劑(DNTB溶于0.1 mol/L Tris-Gly緩沖液中),渦旋均勻,上清液在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值?？値€基的測(cè)定:5 mL上清液添加50 μL β-巰基乙醇,25 ℃反應(yīng)1 h,加入10 mL 12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸25 ℃繼續(xù)反應(yīng)1 h,8 000 r/min離心20 min,沉淀用10 mL 12%三氯乙酸清洗3次,收集沉淀,溶于10 mL 8 mol/L脲0.1 mol/L Tris-Gly緩沖液中,移取5 mL,加入50 μL Ellman試劑,于412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。巰基和二硫鍵含量的計(jì)算分別如公式(2)、公式(3)所示:

(2)

(3)

式中:A412為樣品吸光值;D為上清液稀釋倍數(shù);C為組分蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.3.3.4 紫外吸收光譜

10 mL蒸餾水溶解5 mg五味子組分蛋白樣品,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,蒸餾水作空白對(duì)照,紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)200～800 nm內(nèi)全波長(zhǎng)掃描,觀察280 nm處組分蛋白吸收峰強(qiáng)弱。

1.3.3.5 紅外吸收光譜

瑪瑙研缽中放置五味子組分蛋白固體樣品2.0 mg、光譜醇KBr約200.0 mg,研磨成細(xì)膩粉末,取適量混勻后的樣品置于壓片模具中,置于壓片機(jī)上,壓制成薄片,掃描波數(shù)400～4 000 cm-1,分辨率4 cm-1,掃描20次。

1.3.3.6 DSC圖譜分析

參考文獻(xiàn)[18]方法,略作修改。精密稱量5 mg五味子組分蛋白樣品,置于鋁坩堝中,壓實(shí),密封。以不裝蛋白樣品的空白鋁坩堝作為空白對(duì)照,氮?dú)饬魉?0 mL/min,用差示掃描量熱儀在20～140 ℃下以10 ℃/min的加熱速率掃描密封的鋁坩堝。

1.3.3.7 微觀結(jié)構(gòu)觀察

使用導(dǎo)電雙面膠將少量?jī)龈珊蟮奈逦蹲咏M分蛋白樣品均勻平鋪在金屬樣品臺(tái)上,放入真空鍍金器中真空鍍金后,在20 kV電壓、15 Pa低真空模式下,放入掃描電鏡后調(diào)節(jié)不同放大倍數(shù)進(jìn)行拍照觀察各組分蛋白表面形態(tài)特征。

1.3.4 功能特性

1.3.4.1 溶解性(protein solubility,Ps)

分別制備1%清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白溶液,并用1.0 mol/L HCl或1.0 mol/L NaOH將pH調(diào)節(jié)至2.0～10.0,渦旋振蕩20 min,5 000 r/min離心10 min,考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定上清液中可溶性蛋白含量。

1.3.4.2 持水性(water holding capacity,WHC)

參考文獻(xiàn)[19]的方法,準(zhǔn)確稱取五味子組分蛋白樣品0.5 g,蛋白樣品放入離心管中,加pH值為2～10去離子水溶液5.0 mL,渦旋混勻,靜置30 min后離心(8 000 r/min,10 min),棄上清液,稱重。根據(jù)公式(4)計(jì)算蛋白的持水性:

(4)

式中:m為組分蛋白樣品質(zhì)量,g;m1為空離心管質(zhì)量,g;m2為離心后離心管和樣品總質(zhì)量,g。

1.3.4.3 持油性(oil absorbing capacity,OAC)

參考文獻(xiàn)[20]的方法,準(zhǔn)確稱取0.5 g五味子組分蛋白樣品置于離心管中,加入5.0 mL大豆油,渦旋混勻,分別于5、25、45、65、85 ℃靜置30 min后離心(8 000 r/min,10 min),棄大豆油,稱重。按公式(5)計(jì)算蛋白的持油性:

(5)

式中:m為組分蛋白樣品質(zhì)量,g;m1為空離心管質(zhì)量,g;m2為離心后離心管和樣品總質(zhì)量,g。

1.3.4.4 乳化性(emulsifying activity,EAI)和乳化穩(wěn)定性(emulsion stability,ESI)

參考LI等[21]方法,去離子水配制0.01 g/mL組分蛋白溶液,調(diào)節(jié)pH值為2～10,將大豆油和上述組分蛋白溶液按1∶3體積比混合均勻,均質(zhì)機(jī)均質(zhì)(10 000 r/min,2 min),吸取均質(zhì)后的乳液80 μL,用0.001 g/mL SDS稀釋100倍后于500 nm處測(cè)定吸光度。按公式(6)、公式(7)分別計(jì)算EAI和ESI:

(6)

(7)

式中:D為乳液稀釋倍數(shù),本實(shí)驗(yàn)中D=100;C為蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;?為光程,?=0.01 m;V為油相體積分?jǐn)?shù),V=0.25;A0、A10分別為均質(zhì)后0 min和10 min 時(shí)的吸光度。

1.3.4.5 起泡性(foaming characteristics,FC)和泡沫穩(wěn)定性(froth stability,FS)

參考YOU等[22]方法,去離子水配制0.01 g/mL組分蛋白溶液,將pH值調(diào)節(jié)為2～10,移取15 mL蛋白溶液,均質(zhì)機(jī)均質(zhì)(10 000 r/min,2 min),測(cè)量溶液體積,靜置10 min,再次測(cè)量溶液體積,起泡性和泡沫穩(wěn)定性分別利用公式(8)、公式(9)進(jìn)行計(jì)算:

(8)

(9)

式中:V0為攪拌均質(zhì)前溶液體積;V1為攪拌勻質(zhì)2 min時(shí)測(cè)得的體積;V2為攪拌均質(zhì)后靜置10 min測(cè)得的體積。

1.3.4.6 最小凝膠濃度(least gelation concentration,LGC)

參考文獻(xiàn)[23]的方法,去離子水配制0.15 g/mL五味子組分蛋白分散液,渦旋混勻,100 ℃水浴60 min,冷卻至室溫,4 ℃保存2 h,倒置離心管,蛋白質(zhì)樣品沒(méi)有從離心管中脫落或滑落時(shí)的濃度,即為五味子組分蛋白最小凝膠濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用Excel 2019和Origin 2019b軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 組分蛋白提取率及營(yíng)養(yǎng)成分

五味子組分蛋白的提取率及基本成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所含有的營(yíng)養(yǎng)成分差異顯著,其中谷蛋白的蛋白質(zhì)含量最高而脂肪含量最低。五味子脫脂粉中蛋白含量豐富,清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的提取率分別為7.47%、9.95%、6.35%、12.2%,五味子組分蛋白中主要蛋白為谷蛋白,且蛋白含量最高,這與黃志連等[25]研究結(jié)果略有不同,可能是原料差異所致。

表1 五味子組分蛋白提取率及基本成分 單位:%

2.2 結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)

2.2.1 SDS-PAGE

五味子脫脂粉中各組分蛋白在還原性和非還原性條件下測(cè)定的SDS-PAGE結(jié)果如圖2-A和圖2-B所示,用以觀察五味子4種組分蛋白分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)。結(jié)果表明,與總蛋白相比,五味子各組分蛋白的組成差異較大。在還原性電泳圖2-A圖譜中,清蛋白和球蛋白具有相似分子質(zhì)量的條帶分布,電泳圖譜中均包含3條主要的清晰可見(jiàn)條帶,相對(duì)分子質(zhì)量大致為19、36 kDa和43～47 kDa,但清蛋白和球蛋白3條主要條帶含量不同,可能由于提取方法不同導(dǎo)致。醇溶蛋白在此分子質(zhì)量范圍內(nèi)未檢測(cè)出條帶,谷蛋白2條主要的清晰可見(jiàn)條帶相對(duì)分子質(zhì)量集中在18 kDa和36 kDa。

非還原性電泳圖2-B圖譜中,與還原性電泳圖譜相比,清蛋白和球蛋白條帶明顯降低,且清蛋白條帶分布和含量差異顯著,特別是56 kDa處條帶基本均被β-巰基乙醇還原,二硫鍵斷裂,遷移率增大,使清蛋白在還原性電泳圖譜中分子質(zhì)量為17 kDa的條帶明顯增多,表明清蛋白及其聚集體和小分子亞基等的相互交聯(lián)可能以—S—S—為主[24,26]。清蛋白和球蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為10～25 kDa的條帶強(qiáng)度變淺,推測(cè)其含有二硫鍵。組分蛋白分子質(zhì)量小于<25 kDa的亞基一方面可能來(lái)自于由五味子脫脂粉提取組分蛋白時(shí)產(chǎn)生,或在提取和加入β-巰基乙醇過(guò)程中由各種組分蛋白質(zhì)破壞、分解產(chǎn)生的其他亞結(jié)構(gòu)。谷蛋白條帶沒(méi)有明顯差異,說(shuō)明二硫鍵含量較低,可能由于谷蛋白是由強(qiáng)堿性溶劑提取導(dǎo)致其亞基組成比較穩(wěn)定,不易被β-巰基乙醇還原。

2.2.2 Tris-Tricine-SDS-PAGE

為了更加直觀地觀察五味子4種組分蛋白分子內(nèi)和分子間在超低分子質(zhì)量范圍內(nèi)的交聯(lián)情況,如圖3-A和圖3-B分別為五味子4種組分蛋白在還原性和非還原性條件下測(cè)定的Tris-Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜。與非還原條件電泳圖相比,清蛋白和球蛋白在4～17 kDa條帶數(shù)目和強(qiáng)度明顯增多,和SDS-PAGE結(jié)果相似,說(shuō)明在此分子質(zhì)量范圍內(nèi)二硫鍵數(shù)目較多,加入β-巰基乙醇后,二硫鍵發(fā)生斷裂,使處于高分子質(zhì)量范圍內(nèi)的亞基遷移率增大,導(dǎo)致在4～17 kDa條帶數(shù)目和強(qiáng)度明顯增多。醇溶蛋白在5 kDa處出現(xiàn)一條淺色亞基條帶,可能采用醇溶液提取導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量和含量較低。谷蛋白在低分子質(zhì)量范圍內(nèi)變化依舊不明顯,在5～8 kDa范圍內(nèi)出現(xiàn)新條帶,可能由于少量的二硫鍵發(fā)生斷裂形成的。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(10～180 kDa);1～5-五味子總蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白 A-還原型 SDS-PAGE;B-非還原型SDS-PAGE圖2 五味子4種組分蛋白SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE in four protein fractions of Schisandra chinensis

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(3.3～31.0 kDa);1～5-五味子總蛋白、清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白 A-還原型 Tris-Tricine-SDS-PAGE;B-非還原型Tris-Tricine-SDS-PAGE圖3 五味子4種組分蛋白Tris-Tricine-SDS-PAGE圖Fig.3 Tris-Tricine-SDS-PAGE in four protein fractions of Schisandra chinensis

2.2.3 巰基和二硫鍵含量測(cè)定

巰基和二硫鍵是維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和賦予其一定功能特性的重要化學(xué)鍵,測(cè)定兩者含量,可以評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。如圖4所示,清蛋白和球蛋白二硫鍵含量較高,這也是導(dǎo)致這2種還原性電泳和非還原性電泳條帶變化較大的重要原因。此外,二硫鍵含量高會(huì)使蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生折疊,降低熵值,是提升熱穩(wěn)定性的因素之一。與清蛋白和球蛋白相比,谷蛋白巰基暴露在蛋白質(zhì)表面的最少,為4.72 μmol/g。醇溶蛋白因蛋白含量低而呈現(xiàn)出巰基和二硫鍵含量較少。有研究表明[27],隨著共價(jià)二硫鍵的形成,游離巰基含量較高的蛋白質(zhì)更有可能相互結(jié)合或聚集,這也可能是導(dǎo)致掃描電鏡中谷蛋白結(jié)構(gòu)疏松的原因,還可以表明谷蛋白中游離巰基和二硫鍵含量較低是其溶解性和持水性優(yōu)于清蛋白和球蛋白的原因之一。

圖4 五味子4種組分蛋白巰基和二硫鍵含量Fig.4 Contents of sulfhydryl group and disulfide bond of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.2.4 紫外吸收光譜

蛋白質(zhì)紫外吸收光譜中的變化與其微環(huán)境的改變密切相關(guān),所以常用紫外吸收光譜260～300 nm內(nèi)變化來(lái)表征蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化。引起組分蛋白紫外吸收強(qiáng)度不同的原因可能是提取溶劑不同,導(dǎo)致蛋白的含量和螺旋結(jié)構(gòu)在提取過(guò)程中發(fā)生變化。由圖5五味子4種組分蛋白的紫外吸收光譜可得,谷蛋白在280 nm附近的紫外吸收強(qiáng)度最大,屬于蛋白質(zhì)表面酪氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)等芳香族氨基酸的吸收特征(200～400 nm)[28],球蛋白吸收強(qiáng)度最弱,可能由于堿性環(huán)境下色氨酸、酪氨酸等發(fā)色基團(tuán)從內(nèi)部疏水區(qū)域轉(zhuǎn)移至極性的溶劑環(huán)境中,進(jìn)而增大谷蛋白的紫外吸收強(qiáng)度。

圖5 五味子4種組分蛋白紫外吸收光譜Fig.5 Ultraviolet absorption spectra of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.2.5 紅外吸收光譜

A-五味子各組分蛋白的FTIR圖;B-五味子各組分 蛋白酰胺帶區(qū)域FTIR的細(xì)節(jié)放大圖圖6 五味子4種組分蛋白紅外吸收光譜Fig.6 Infrared absorption spectra of four protein fractions of Schisandra chinensis

五味子4種組分蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)定量分析結(jié)果如圖7所示,數(shù)據(jù)顯示,各組分蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中均以β-折疊為主,這與李楊等[33]研究不同熱處理?xiàng)l件下大豆分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果相似。與其他3種組分蛋白相比,谷蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化顯著,β-折疊在二級(jí)結(jié)構(gòu)中占51.92%,可能是提取過(guò)程中部分α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊而導(dǎo)致其含量明顯高于其他3種組分蛋白,這也是造成其溶解性和熱穩(wěn)定性較高的原因之一。

圖7 五味子4種組分蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量Fig.7 Protein secondary structure content of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.2.6 熱穩(wěn)定性測(cè)定

五味子4種組分蛋白的DSC圖譜如圖8所示,清蛋白、球蛋白和谷蛋白都有一個(gè)平滑的吸熱峰,無(wú)雜質(zhì)峰,而醇溶蛋白吸收峰不明顯,可能由于蛋白含量低導(dǎo)致。谷蛋白比其他組分蛋白熱變性溫度高,為91 ℃,說(shuō)明谷蛋白相對(duì)更穩(wěn)定,對(duì)熱不夠敏感,雖然其二硫鍵含量低于清蛋白和球蛋白,但是在紅外吸收光譜中,β-折疊結(jié)構(gòu)明顯強(qiáng)于清蛋白和球蛋白,有研究表明[29,34],二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量高可以增加蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。因此,谷蛋白熱穩(wěn)定性優(yōu)于其他組分蛋白可能是其主要受到β-折疊結(jié)構(gòu)的影響,而二硫鍵含量對(duì)其影響較小。

圖8 五味子4種組分蛋白DSC譜圖Fig.8 DSC spectra of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.2.7 組分蛋白微觀結(jié)構(gòu)觀察

五味子4種組分蛋白中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的顆粒表面形態(tài)存在較大差異。由圖9可知,清蛋白呈無(wú)規(guī)則樹(shù)枝狀,局部有棱狀突起和孔,突起表面以外較為光滑,孔徑較大,可能會(huì)影響其吸附性,進(jìn)而可能影響其持水性和持油性;球蛋白表面凸起,由結(jié)構(gòu)緊密的多層不規(guī)則片狀構(gòu)成,結(jié)構(gòu)相對(duì)致密但存在較多孔隙,蛋白質(zhì)的表面形態(tài)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的物理截留作用對(duì)于其持油性影響較大;醇溶蛋白分子連接緊密,表面不夠平整,呈球狀或聚集體形式連接成較大的分子基團(tuán),基團(tuán)之間孔徑較大,這與張明珠等[35]報(bào)道的玉米醇溶蛋白表面結(jié)構(gòu)結(jié)果相似,可能是由于醇提導(dǎo)致其分子粒徑較小,相互聚集成大分子基團(tuán),進(jìn)而導(dǎo)致各基團(tuán)間孔徑較大;谷蛋白和球蛋白相比表現(xiàn)出疏松的多層片狀和樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu),可能是堿提取導(dǎo)致其電荷之間相互排斥,部分結(jié)構(gòu)發(fā)生折疊,進(jìn)而引起結(jié)構(gòu)的改變。綜上可得,五味子4種組分蛋白的表面形態(tài)均不同,故其表現(xiàn)的性質(zhì)也不同,如溶解性差異,由于蛋白的溶解性與其他多種蛋白功能特性,如持水性、乳化性、起泡性和凝膠性等存在密切關(guān)聯(lián),因此,五味子4種組分蛋白微觀結(jié)構(gòu)的不同是影響其理化性質(zhì)和功能特性的重要因素。

A-清蛋白;B-球蛋白;C-醇溶蛋白;D-谷蛋白圖9 五味子4種組分蛋白微觀結(jié)構(gòu)圖Fig.9 Microstructures of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.3 功能特性結(jié)果

2.3.1 溶解性

溶解度是測(cè)定蛋白聚集程度和變性水平最實(shí)用的方法,是衡量蛋白質(zhì)乳化性和起泡性的重要指標(biāo)[26]。由圖10可知,pH=4時(shí),靠近清蛋白、球蛋白和谷蛋白等電點(diǎn),分子間電荷排斥力最小,蛋白溶解性最低,當(dāng)?shù)鞍滋幱谄x等電點(diǎn)的酸性或堿性環(huán)境時(shí),其溶解度都呈增加趨勢(shì),并且在堿性環(huán)境下的溶解度高于酸性環(huán)境下的溶解度。球蛋白溶解度隨pH值變化明顯,當(dāng)pH值為6～10,分子間電荷排斥能力增強(qiáng),溶解度持續(xù)升高。由于醇溶蛋白掃描電鏡中呈現(xiàn)出分子連接緊密,以聚集體形式連接成較大的分子基團(tuán),降低了蛋白質(zhì)與水之間的作用,因此溶解度最低且隨pH值變化不明顯。谷蛋白溶解性最高,在pH=8時(shí)溶解度達(dá)到最大值,為26.5%,谷蛋白在此條件下獲得更多凈負(fù)電荷和正電荷,有利于分子間的排斥,分散能力增強(qiáng),從而增加蛋白質(zhì)的溶解度。

圖10 五味子4種組分蛋白溶解性Fig.10 Solubility of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.3.2 持水性

持水性是蛋白質(zhì)在食品工業(yè)應(yīng)用中重要特性。蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、提取方法和環(huán)境參數(shù)(pH、離子強(qiáng)度、溫度)被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)持水性的因素。如圖11所示,在pH值為2～10時(shí),4種組分蛋白中谷蛋白的持水性最高,與在掃描電鏡下谷蛋白微觀結(jié)構(gòu)中疏松的多層片狀和樹(shù)枝狀結(jié)構(gòu)和相對(duì)較低的堆積密度有關(guān),當(dāng)pH=8時(shí)持水性最大為3.72 g/g,說(shuō)明在此條件下,谷蛋白中氫鍵作用和親水基團(tuán)暴露最多;球蛋白在pH=6時(shí)持水性最低,這是由于球蛋白為鹽溶液提取,在此條件下整個(gè)蛋白質(zhì)分子呈現(xiàn)電中性,使蛋白質(zhì)分子間相互作用達(dá)到最高,而締合和收縮的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)最低水化和膨脹,表現(xiàn)出最弱的吸水能力;醇溶蛋白的吸水性最低,與空間結(jié)構(gòu)和提取方法有關(guān)。相關(guān)研究表明[36],黏性蛋白持水性為1.49～4.72 g/g,因此谷蛋白可能適合作為黏性蛋白類食品應(yīng)用于食品加工中。

圖11 五味子4種組分蛋白持水性Fig.11 Water holding capacity of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.3.3 持油性

蛋白質(zhì)的持油性不僅影響著蛋白質(zhì)產(chǎn)品的感官品質(zhì),還會(huì)影響其在食品加工和貯藏過(guò)程中的物理特性對(duì)蛋白具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。五味子4種組分蛋白在不同溫度下的持油性結(jié)果如圖12所示,谷蛋白在室溫(25 ℃)持持油性最好,為14.9 g/g,明顯高于南瓜籽分離蛋白[15],其次是清蛋白和球蛋白,醇溶蛋白持油性最差,且受溫度的影響較小。在低溫(5 ℃)下,清蛋白和谷蛋白持油性隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì),在較高溫度下開(kāi)始變性,空間結(jié)構(gòu)也隨之改變,親水基團(tuán)增多、疏水基團(tuán)減少,進(jìn)而導(dǎo)致持油性降低,這與崔巖巖等[37]報(bào)道結(jié)果相似。高持油性的蛋白質(zhì)可用于食品工業(yè)中的肉類配方、肉類替代品和填充劑,因此谷蛋白在食品加工中具有巨大開(kāi)發(fā)價(jià)值。

2.3.4 乳化性和乳化穩(wěn)定性

乳化性指蛋白質(zhì)在油-水界面上吸附形成乳狀液的能力,而乳化穩(wěn)定性是衡量乳液在一定時(shí)間內(nèi)保持其結(jié)構(gòu)和狀態(tài)的能力。五味子不同組分蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性與pH值關(guān)系如圖13-A、圖13-B所示,隨著pH值偏離等電點(diǎn)附近,乳化性和乳化穩(wěn)定增加,pH=10時(shí),4種組分蛋白乳化性達(dá)到最大,分別為101.2、99.5、88.6、113.6 m2/g,谷蛋白在整體上乳化性最高,醇溶蛋白乳化性最低,這與鄧欣倫等[38]報(bào)道的核桃組分蛋白結(jié)果不同,可能與原料差異和蛋白含量有關(guān)。谷蛋白和球蛋白乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先降低后升高趨勢(shì),而清蛋白和醇溶蛋白相反,谷蛋白結(jié)構(gòu)疏松,溶解性和持水性強(qiáng)于其他組分蛋白,當(dāng)pH值偏離等電點(diǎn)時(shí),蛋白質(zhì)溶解性增大,分散性好,蛋白質(zhì)與極性水分子的作用加強(qiáng),在油—水界面的表面張力增大,油—水界面在一定時(shí)間內(nèi)得到穩(wěn)定,使乳化性和乳化穩(wěn)定性持續(xù)升高。谷蛋白作為一種乳化性和乳化穩(wěn)定好的蛋白質(zhì)可以在改善食品加工特性中存在潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖12 五味子4種組分蛋白持油性Fig.12 Oil holding capacity of four protein fractions of Schisandra chinensis

2.3.5 起泡性和泡沫穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)的起泡性質(zhì)與蛋白類型、pH值、濃度和水合能力等相關(guān),蛋白質(zhì)起泡特性可賦予食品良好的口感和松軟的結(jié)構(gòu)[16]。由圖14可知,其他因素固定的前提下,谷蛋白起泡性最好,且在堿性環(huán)境中最優(yōu),和南瓜籽分離蛋白[15]隨pH值變化趨勢(shì)相似。谷蛋白在pH=4時(shí),起泡性最低為40.1%,等電點(diǎn)附近,蛋白質(zhì)凈電荷較少,降低了分子間作用力和表面張力,蛋白質(zhì)易發(fā)生聚集,在水-空氣界面界面相互作用形成一個(gè)彈性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),降低起泡能力;在pH=10時(shí)起泡性最強(qiáng)為80.3%,隨著pH值升高,谷蛋白溶解性增大,增加水-空氣界面相互作用,起泡性升高。谷蛋白泡沫穩(wěn)定性在pH=6或8時(shí)為佳,過(guò)酸性或過(guò)堿性溶劑可能引起谷蛋白的變性導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀,因此不利于泡沫穩(wěn)定。蛋白質(zhì)展現(xiàn)出不同的起泡性和泡沫穩(wěn)定性,在蛋糕、面包等不同食品的發(fā)泡成分產(chǎn)生不同的應(yīng)用價(jià)值。

2.3.6 最小凝膠濃度

蛋白質(zhì)形成凝膠,可以作為結(jié)構(gòu)基質(zhì)來(lái)保存水、糖、香料和食品添加劑,在食品工業(yè)中非常重要。最小凝膠濃度低表明蛋白質(zhì)具有良好的膠凝能力,因?yàn)樾纬赏瑯拥哪z水平所需蛋白量較少。如圖15所示,谷蛋白最小凝膠濃度最低,為4.3%,與其他3種組分蛋白相比具有優(yōu)良的凝膠形成能力。蛋白質(zhì)的凝膠水平可能與分子間二硫鍵和氫鍵水平有關(guān)。谷蛋白在較低的蛋白質(zhì)濃度下可能成為食品成分中一種經(jīng)濟(jì)、牢固的結(jié)構(gòu)基質(zhì)。

圖15 五味子4種組分最小凝膠濃度Fig.15 Minimum gel concentration of four protein fractions of Schisandra chinensis

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)五味子4種組分蛋白結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和功能特性進(jìn)行比較,研究發(fā)現(xiàn)空間結(jié)構(gòu)的變化會(huì)對(duì)理化性質(zhì)和功能特性產(chǎn)生影響,還原性電泳和非還原性電泳證實(shí)二硫鍵的存在,使組分蛋白在還原前和還原后亞基條帶分布不同;掃描電鏡呈現(xiàn)出不同組分蛋白的松散程度和形狀;Tris-Tricine-SDS-PAGE呈現(xiàn)了組分蛋白在超低分子質(zhì)量范圍內(nèi)條帶分布,并且醇溶蛋白在5 kDa處出現(xiàn)一條微弱亞基條帶;FTIR譜圖表征不同組分蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。谷蛋白提取率最高,蛋白質(zhì)含量最高而脂肪含量最低,具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性、溶解性、持水性、持油性、乳化性及乳化穩(wěn)定性和發(fā)泡性及泡沫穩(wěn)定性,在食品工業(yè)和食品加工中作為持水劑、持油劑、乳化劑和發(fā)泡劑使用,可成為新的具有潛在價(jià)值的植物蛋白資源。綜上所述,五味子組分蛋白結(jié)構(gòu)、理化和功能特性的系統(tǒng)分析研究可為提高五味子的綜合利用率,增加五味子蛋白產(chǎn)品附加值提供新思路,同時(shí)指出五味子谷蛋白,在功能性健康食品和保健食品領(lǐng)域具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。