李心 武敬也 陳菲兒 樊璐 馬琳 王學(xué)敏

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.01.006

引用格式：

李? 心， 武敬也， 陳菲兒，等.MsWRKY33轉(zhuǎn)錄調(diào)控MsACS2影響紫花苜蓿耐鹽性的研究［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（1）：54-65

LI Xin， WU Jing-ye， CHEN Fei-er，et al.Effects of Transcriptional Regulation of MsACS2 by MsWRKY33 on Salt Tolerance of Alfalfa［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（1）：54-65

收稿日期：2023-05-29；修回日期：2023-10-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31872410）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）；科技部、財(cái)政部、國(guó)家科技資源共享服務(wù)平臺(tái)（NCGRC-2023-63）資助

作者簡(jiǎn)介：

李心（1998-），女，漢族，河南焦作人，碩士研究生，主要從事飼草遺傳育種方向研究，E-mail：18513988633@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：wangxuemin@caas.cn;malin@caas.cn

摘要：乙烯作為重要的植物激素之一，在植物逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。ACS基因是乙烯合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶（ACC合成酶）基因，本研究通過(guò)探究紫花苜蓿MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ACS基因的調(diào)控關(guān)系，為MsWRKY33參與紫花苜蓿耐鹽脅迫響應(yīng)的具體調(diào)控機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。利用同源克隆、載體構(gòu)建、酵母單雜交、酵母雙雜交、qRT-PCR等技術(shù)，驗(yàn)證MsWRKY33對(duì)AtACS2和MsACS2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并對(duì)鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因株系中MsACS2表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可以與W-box元件特異性結(jié)合，且對(duì)AtACS2和MsACS2具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用；MsWRKY33轉(zhuǎn)基因株系中MsWRKY33基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因株系中MsACS2的表達(dá)是在MsWRKY33基因大量表達(dá)后呈上升趨勢(shì)，進(jìn)一步說(shuō)明紫花苜蓿MsACS2基因的表達(dá)可能受MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的正向調(diào)控。因此，紫花苜蓿受到鹽脅迫時(shí)可誘導(dǎo)MsWRKY33的表達(dá)，MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)正向調(diào)控MsACS2表達(dá)，可能影響乙烯合成，從而影響紫花苜蓿的鹽脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；酵母單雜交；MsWRKY33；MsACS2；耐鹽性

中圖分類號(hào)：S541.9??? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????? 文章編號(hào)：1007-0435（2024）01-0054-12

Effects of Transcriptional Regulation of MsACS2 by

MsWRKY33 on Salt Tolerance of Alfalfa

LI Xin， WU Jing-ye， CHEN Fei-er， FAN Lu， MA Lin*， WANG Xue-min*

（Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China）

Abstract：Ethylene，as one of the important plant hormones，plays an important role in plant stress response. The ACS gene is a key rate limiting enzyme （ACC synthase） gene in the ethylene synthesis process. In this study，we laid a theoretical foundation for understanding the specific regulatory mechanism of MsWRKY33 participating in salt-tolerant response of alfalfa by exploring the regulatory relationship of MsWRKY33 transcription factor on ACS gene. We used homologous cloning，vector construction，Y1H，Y2H，qRT-PCR and other techniques to verify the transcriptional regulation of MsWRKY33 on AtACS2 and MsACS2，meanwhile，analyzed the expression pattern of MsACS2 in transgenic lines under salt stress. The results showed that the MsWRKY33 transcription factor could specifically bind to the W-box element and had transcriptional regulatory effects on AtACS2 and MsACS2;The expression level of MsWRKY33 gene in the transgenic lines was significantly higher than that in the control. The expression of MsACS2 in transgenic lines showed an increasing trend after the large amount of MsWRKY33 gene expression，further indicating that the expression of MsACS2 gene in alfalfa might be positively regulated by the MsWRKY33 transcription factor. The results indicated that the expression of MsWRKY33 could be induced when alfalfa was subjected to salt stress. The MsWRKY33 transcription factor might affect ethylene synthesis and salt stress response of alfalfa by positively regulating the expression of MsACS2.

Key words：Alfalfa; Yeast One-Hybridization technique; MsWRKY33; MsACS2; Salt tolerance

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）有“牧草之王”的美稱，是全國(guó)乃至世界上種植面積最大的牧草，其產(chǎn)量和品質(zhì)兼優(yōu)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高，具有改良土壤鹽漬化［1-2］、豐富土壤有機(jī)質(zhì)等功效。土壤鹽漬化是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要非生物脅迫因子之一［3］，目前，全世界超過(guò)1.0×109 hm2的土地受到鹽堿地的影響，而中國(guó)的鹽堿土面積也達(dá)到了1.0×108 hm2［4］。我國(guó)紫花苜蓿的產(chǎn)業(yè)發(fā)展深受土壤鹽漬化的制約［5］。

乙烯被稱為植物應(yīng)激激素，植物在受到鹽脅迫時(shí)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量乙烯［6-7］。植物激素乙烯（ethylene）是1種氣體小分子（C2H4），不僅參與植物的眾多發(fā)育過(guò)程，如種子萌發(fā)、細(xì)胞伸長(zhǎng)、組織分化、葉片和花的衰老脫落、果實(shí)成熟等［8-9］，還參與植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫等多種應(yīng)答反應(yīng)［10-12］。乙烯合成有兩個(gè)關(guān)鍵步驟：第1步是ACC合成酶（ACS）將s-腺苷-甲硫氨酸（SAM）轉(zhuǎn)化為1-氨基-環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC），第2步是ACC氧化酶（ACO）將ACC氧化裂解并生成乙烯［6，19-20］。ACS被認(rèn)為是乙烯生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，所以ACC合成酶的活性直接關(guān)系到乙烯的含量，ACS的調(diào)控對(duì)乙烯的生物合成至關(guān)重要。擬南芥ACS5和ACS7基因在鹽脅迫下均能受到顯著誘導(dǎo)［5］，煙草（Nicotiana tabacum L.）NtACS1基因在鹽脅迫下也能被誘導(dǎo)表達(dá)［15］，乙烯和乙烯前體物ACC能顯著增加擬南芥的耐鹽性［16］。乙烯可通過(guò)促進(jìn)ROS的清除來(lái)調(diào)節(jié)植物對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答，如乙烯通過(guò)影響RBOHF介導(dǎo)的ROS和Na+/K+平衡來(lái)提高擬南芥的耐鹽性［17］。乙烯處理或EIN3的活化可以通過(guò)直接調(diào)控POD的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)過(guò)氧化物酶的活性，從而阻止過(guò)量ROS的積累，提高了植物對(duì)鹽脅迫的耐受性［18］?；蜣D(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物應(yīng)答各種信號(hào)刺激的重要過(guò)程，當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的信號(hào)激活特定轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合從而啟動(dòng)基因的表達(dá)使植物對(duì)逆境做出反應(yīng)［21］。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物體內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程［22］；WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族所有成員都含有WRKY結(jié)構(gòu)域，包括N端“WRKYGQK”序列和C端鋅指型結(jié)構(gòu)序列［23，24］，根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)的類型將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3類［25］。在幾乎所有受到WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)域中都能發(fā)現(xiàn)（T）（T）TGAC（C/T）這一保守結(jié)構(gòu)，即為W-box。W-box是WRKY轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)基因特異性結(jié)合的區(qū)域，高度保守［24］。ACS2基因受到WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，如Li等［26］通過(guò)ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)證明在擬南芥中WRKY33轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與ACS2和ACS6的啟動(dòng)子中的W-box結(jié)合從而調(diào)控ACS基因的表達(dá)；Chen等［27］通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)證明在擬南芥中WRKY8轉(zhuǎn)錄因子可以與ACS6啟動(dòng)子中的W-box結(jié)合。

本課題在前期的研究中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)包含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的紫花苜蓿WRKY33轉(zhuǎn)錄因子，該基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)并過(guò)量累積，研究顯示其可以通過(guò)與目標(biāo)基因啟動(dòng)子區(qū)的W-box特異性結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)［28］；本研究前期通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pCAMBIAI1300-MsWRKY33，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過(guò)表達(dá)MsWRKY33紫花苜蓿株系，為了深入解析MsWRKY33參與紫花苜蓿耐鹽脅迫的分子機(jī)制，我們利用RNA-seq技術(shù)對(duì)正常條件和鹽脅迫條件下的非轉(zhuǎn)基因（對(duì)照）和轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。其中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)ACS2類基因被顯著上調(diào)。因此我們推測(cè)MsWRKY33可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活A(yù)CS2基因的表達(dá)，從而影響植物體內(nèi)乙烯的合成，進(jìn)而可能參與紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。在植物受到鹽脅迫時(shí)會(huì)誘導(dǎo)ACS基因表達(dá)以產(chǎn)生大量的乙烯，目前已有研究證明在擬南芥中WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以通過(guò)與ACS基因啟動(dòng)子中W-box結(jié)合以誘導(dǎo)ACS的表達(dá)，如AtWRKY33可調(diào)控ACS2和ACS6基因的表達(dá)［26］，AtWRKY8可調(diào)控ACS6的表達(dá)［27］，AtWRKY29可調(diào)控ACS基因的表達(dá)［29］，但在紫花苜蓿中卻鮮有報(bào)道。我國(guó)紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)深受土壤鹽漬化制約，因此了解MsWRKY33對(duì)ACS基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控途徑對(duì)于解析MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子參與紫花苜蓿耐鹽脅迫的具體調(diào)控機(jī)制具有重要意義，也為紫花苜蓿耐鹽性分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。本研究利用酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證MsWRKY33對(duì)ACS2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，旨在探究紫花苜蓿MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控MsACS2的機(jī)制，為紫花苜蓿耐鹽性調(diào)控的分子機(jī)制解析奠定理論基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料及試劑

紫花苜?！熊?號(hào)（Medicago sativa L.‘Zhongmu No.1）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所楊青川研究員惠贈(zèng)；轉(zhuǎn)基因MsWRKY33紫花苜蓿L3和L4是由本課題前期通過(guò)構(gòu)建pCAMBIA1300-MsWRKY33過(guò)表達(dá)載體并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化‘中苜1號(hào)所獲得的MsWRKY33紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因株系，保存于本實(shí)驗(yàn)室。KOD-Plus，TaKaRa LA Taq酶、總RNA提取試劑盒、FastKing1步法除基因組cDNA第1鏈合成預(yù)混試劑盒均購(gòu)自北京天根生化科技公司，零背景pTOPO-Blunt Simple平末端克隆試劑盒、Axyprep DNA凝膠回收試劑盒、EZ-HiFi無(wú)縫克隆試劑盒、Dh5α感受態(tài)和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司。

酵母單雜交所用誘餌載體pHiSi、獵物載體pGADT7和酵母YM4271保存于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，各種酵母培養(yǎng)基均購(gòu)自成都遠(yuǎn)諾天成科技有限公司，Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

試驗(yàn)中所用引物的合成和測(cè)序工作由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2? AtACS2和MsACS2基因啟動(dòng)子的克隆及順式作用元件分析

在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中（https：//www.arabidopsis.org/）查詢AtACS2基因序列，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物AtACS2-PRO-F和AtACS2-PRO-R（表1），使用LA Taq酶以擬南芥DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；根據(jù)AtACS2基因序列在紫花苜蓿數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.alfalfatoolbox.org/）中查找紫花苜蓿的同源基因MsACS2，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)基因啟動(dòng)子克隆引物MsACS2-PRO-F和MsACS2-PRO-R（表1），使用LA Taq酶以紫花苜?！熊?號(hào)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增出的基因片段進(jìn)行純化回收并構(gòu)建T載體，送至北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

將獲得的AtACS2，MsACS2基因啟動(dòng)子序列利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/）在線網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件分析。

1.3? 誘餌載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)含有EcoRI和SacI酶切位點(diǎn)的引物W-box-F/R，該引物包含3個(gè)串聯(lián)重復(fù)的W-box（TTGACT）；根據(jù)AtACS2基因啟動(dòng)子序列利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)含有EcoRⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)的引物pHiSi-AtACS2-F/R，根據(jù)MsACS2基因啟動(dòng)子序列利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)含有XmaI和XhoI酶切位點(diǎn)的引物pAbAi-MsACS2-F/R（表1）。使用KOD-Plus酶以pTOPO-AtACS2和pTOPO-MsACS2載體為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將pHiSi載體用EcoRⅠ和SacⅠ酶進(jìn)行雙酶切，pAbAi載體用XmaI和XhoI酶進(jìn)行雙酶切，將得到的片段和線性化載體進(jìn)行純化回收，使用EZ-HiFi無(wú)縫克隆試劑盒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Dh5α，涂布于LB（Amp）抗性平板，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證出陽(yáng)性克隆并送擎科北京公司生物科技有限測(cè)序。

1.4? 獵物載體pGADT7-MsWRKY33的構(gòu)建

提取紫花苜?！熊?號(hào)的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)紫花苜蓿MsWRKY33（GenBank登錄號(hào)KP642130.1）的cDNA序列利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)含有BamHⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)的引物AD-MsWRKY33-F/R（表1），以紫花苜蓿總cDNA序列為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pGADT7載體用BamHⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切，將得到的片段和線性化載體進(jìn)行純化回收后使用EZ-HiFi無(wú)縫克隆試劑盒進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化Dh5α，涂布于LB（Amp）抗性板，經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆并送北京擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.5? 酵母單雜交驗(yàn)證MsWRKY33和W-box的結(jié)合關(guān)系

將pHiSi和pHiSi-W-box用XhoI線性化后轉(zhuǎn)入YM4271酵母菌株并涂布于SD/-His缺性培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～7天后，挑取平板上陽(yáng)性酵母單克隆接入至液體培養(yǎng)基SD/-His中，30℃ 200 rpm培養(yǎng)至OD600＝0.8，然后將菌液依次稀釋10-1，10-2分別點(diǎn)至不同濃度的3-AT的SD/-His平板上，篩選可以抑制其自激活性的3-AT濃度。

按照表2將獵物載體和誘餌載體的不同組合轉(zhuǎn)入酵母YM4271中，涂布于SD/-Leu/-Ura選擇培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3～7天后，挑取酵母單克隆接入液體培養(yǎng)基SD/-Leu/-Ura中，30℃ 200 rpm培養(yǎng)至OD600＝0.8，將菌液依次稀釋10-1，10-2點(diǎn)至SD/-Leu/-Ura/-His平板（含可以抑制其自激活性的合適濃度的3-AT），觀察酵母生長(zhǎng)狀況并拍照。

1.6? 酵母單雜交驗(yàn)證MsWRKY33和AtACS2啟動(dòng)子的結(jié)合關(guān)系

將pHiSi-AtACS2（1 ng，使用前用XhoI線性化）用醋酸鋰-PEG法轉(zhuǎn)入酵母菌株YM4271，具體方法同1.5，然后將成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的酵母菌液依次稀釋10-1，10-2并點(diǎn)至不同濃度3-AT的SD/-His平板上，篩選其可以抑制其自激活的3-AT濃度。

將pGADT7，pGADT7-MsWRKY33和pHiSi，pHiSi-AtACS2以兩兩組合的方式共轉(zhuǎn)酵母YM4271，將成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的酵母酵母菌液依次稀釋10-1，10-2點(diǎn)至SD/-Leu-His-Ura（加入能夠抑制其相應(yīng)載體本底表達(dá)的合適濃度的3-AT），30℃倒置培養(yǎng)3～7天，觀察其酵母生長(zhǎng)狀況。

1.7? 酵母單雜交驗(yàn)證MsWRKY33和MsACS2啟動(dòng)子的結(jié)合關(guān)系

將pAbAi-MsACS2質(zhì)粒5 μg用BstBI酶切4～6 h，用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，利用醋酸鋰-PEG法轉(zhuǎn)化至Y1HGold感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自北京莊盟生物科技有限公司）。然后將成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的酵母菌液依次稀釋10-1，10-2并點(diǎn)至不同濃度AbA SD/-Ura平板上，篩選可以抑制其自激活的AbA濃度。

將含有pAbAi-MsACS2的Y1HGold酵母菌株制成感受態(tài)細(xì)胞，然后將pGADT7和pGADT7-MsWRKY33利用醋酸鋰-PEG法轉(zhuǎn)入酵母感受態(tài)中，待缺性平板上長(zhǎng)出3 mm酵母單克隆即為含pAbAi-MsACS2，pGADT7和pAbAi-MsACS2，pGADT7-MsWRKY33質(zhì)粒的酵母菌株，然后將菌液依次稀釋10-1，10-2并點(diǎn)至含有可以抑制其本底表達(dá)的合適濃度的AbA SD/-Ura-Leu平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～7天，觀察酵母生長(zhǎng)狀況并拍照。

1.8? NaCl處理下的下游基因表達(dá)量分析

該課題前期通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1300-MsWRKY33，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過(guò)表達(dá)MsWRKY33紫花苜蓿株系L3和L4。取CK（非轉(zhuǎn)基因株系），L3和L4（轉(zhuǎn)基因株系）植株生長(zhǎng)頂端葉片數(shù)片放于液氮冷凍并提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將得到的cDNA用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋，使cDNA的終濃度至10 μg·μL-1，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物qMsWRKY33-F/R和Msactin-F/R（表1）。通過(guò)qRT-PCR對(duì)該課題前期保存的轉(zhuǎn)基因MsWRKY33紫花苜蓿株系L3和L4進(jìn)行基因表達(dá)量鑒定。

將MsWRKY33轉(zhuǎn)基因株系（L3，L4）和非轉(zhuǎn)基因株系（‘中苜1號(hào)）扦插擴(kuò)繁，用塑料蓋子覆蓋3天后揭蓋，等待生長(zhǎng)3～4周后單株分苗，放置人工氣候培養(yǎng)室中培養(yǎng)，刈割3～4次后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的株系，統(tǒng)一澆200 mM NaCl溶液，在鹽處理后的0，3，6，9，12，24和36 h對(duì)植株地上生長(zhǎng)部分的葉片進(jìn)行取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3次重復(fù)，液氮速凍，放于-80℃保存。

根據(jù)MsACS2和MsWRY33序列信息，設(shè)計(jì)qMsWRKY33-F/R，qMsACS2-F/R特異引物（表1）。按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣本RNA，利用FastKing1步法除基因組cDNA第1鏈合成預(yù)混試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。RT-PCR以cDNA（10 μg·μL-1）為模板，用GenStar公司的熒光定量試劑進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。以紫花苜蓿MsActin為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR法檢測(cè)MsACS2和MsWRKY33在轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系中的表達(dá)模式。擴(kuò)增體系為：2×SYBR qPCR Mix 10 μL，F(xiàn)引物0.4 μL，R引物0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，分別設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，基因表達(dá)量的計(jì)算使用2-ΔΔCt法。

2? 結(jié)果與分析

2.1? AtACS2和MsACS2基因啟動(dòng)子的克隆及其啟動(dòng)子中的順式作用元件分析

在擬南芥網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org/）上查詢基因AtACS2的啟動(dòng)子序列，在紫花苜蓿數(shù)據(jù)庫(kù)中（https：//www.alfalfatoolbox.org/）查找AtACS2的同源基因MsACS2序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因啟動(dòng)子區(qū)域片段擴(kuò)增引物（表1），經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后有清晰的條帶（圖1），且條帶位置符合片段大?。ˋtACS2：2 013 bp；MsACS2：1 283 bp）。將擴(kuò)增的條帶進(jìn)行切膠回收，膠回收后與pTOPO—Blunt-Simple載體連接，轉(zhuǎn)化Dh5α感受態(tài)，挑選陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序均連接成功。

為了確定AtACS2和MsACS2潛在的生物學(xué)功能，將AtACS2和MsACS2基因啟動(dòng)子序列使用PlantCARE在線網(wǎng)站對(duì)基因啟動(dòng)子中的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)（表3，表4）。兩個(gè)基因的啟動(dòng)子中除了含有CAAT-box和TATA-box啟動(dòng)子必備核心元件、脫落酸響應(yīng)元件ABRE和MYB識(shí)別元件外，還包括許多與植物抗逆有關(guān)的重要元件如GT1-motif防御應(yīng)激元件TC-rich repeats，SA誘導(dǎo)元件As1/ocs，最重要的，包含能與MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合的W-box元件，這說(shuō)明AtACS2和MsACS2基因可能參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，且這種響應(yīng)可能受到WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

2.2? 同源基因AtACS2，MsACS2蛋白序列比對(duì)

根據(jù)AtACS2基因序列在紫花苜蓿數(shù)據(jù)庫(kù)中查找紫花苜蓿的同源基因MsACS2，使用DNAMAN軟件對(duì)AtACS2和MsACS2基因的蛋白序列進(jìn)行對(duì)比，AtACS2和MsACS2基因的蛋白序列相似度較高，AtACS2和MsACS2在氨基酸水平上相似度高達(dá)53.9％，說(shuō)明AtACS2和MsACS2可能具有相似的生物學(xué)功能（圖2）。

2.3? 誘餌載體和獵物載體的構(gòu)建

分別挑取pHiSi-AtACS2，pABAi-MsACS2和pGADT7-MsWRKY33單克隆菌斑進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增出的DNA片段大小與AtACS2，MsACS2和MsWRKY33基因片段大小相吻合（圖3），經(jīng)測(cè)序與序列對(duì)比分析后證明重組載體構(gòu)建成功。

2.4? MsWRKY33與W-box結(jié)合活性分析

WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的W-box特異性結(jié)合，調(diào)控下游基因的表達(dá)，為證明MsWRKY33這一功能，本研究利用酵母單雜交技術(shù)開(kāi)展了兩者的結(jié)合活性分析。首先將W-box序列TTGACT設(shè)計(jì)合成3個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列，連接至pHiSi載體，并將構(gòu)建成功的pHiSi-W-box載體轉(zhuǎn)化至YM4271酵母感受態(tài)，將轉(zhuǎn)化成功后的菌液點(diǎn)至不同濃度的3-AT SD/-His平板上，篩選可以抑制其本底表達(dá)的3-AT濃度，如圖所示（圖4a），菌液在3-AT濃度≤100 mM時(shí)可以正常生長(zhǎng)，但在濃度達(dá)到150 mM后不能生長(zhǎng)，因此確定可以抑制本底表達(dá)的3-AT濃度為150 mM。

進(jìn)而，將pHiSi-W-box和pGADT7-MsWRKY33共轉(zhuǎn)化至酵母YM4271，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組合：pHiSi+pGADT7，pHiSi+pGADT7-MsWRKY33，pHiSi-W-box+pGADT7，待轉(zhuǎn)化成功后將酵母菌液點(diǎn)至含150 mM 3-AT濃度的SD/-His-Leu-Ura平板上。pGADT7-MsWRKY33與pHiSi-w-box共轉(zhuǎn)化的酵母可以生長(zhǎng)，而陰性對(duì)照組pHiSi+pGADT7，pHiSi-W-box+pGADT7，pHiSi+pGADT7-MsWRKY33酵母均無(wú)法生長(zhǎng)。說(shuō)明MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子能夠與W-box順式作用元件特異性結(jié)合（圖4b）。

2.5? MsWRKY33與下游基因AtACS2啟動(dòng)子的結(jié)合活性分析

將pHiSi和pHiSi-ACS2轉(zhuǎn)入酵母YM4271，將轉(zhuǎn)化成功的酵母菌液點(diǎn)至不同濃度的3-AT SD/-His板上，篩選可以抑制其本底表達(dá)的3-AT濃度。結(jié)果顯示，能夠抑制pHiSi，pHiSi-ACS2本底表達(dá)的3-AT濃度分別為160 mM和80 mM（圖5a）。再將pHiSi-ACS2與pGADT7-MsWRKY33共轉(zhuǎn)至酵母YM4271，并同時(shí)將陰性對(duì)照組合：pHiSi+pGADT7，pHiSi+pGADT7-MsWRKY33，pHiSi-ACS2+pGADT7共轉(zhuǎn)至酵母YM4271，將轉(zhuǎn)化成功的酵母菌液點(diǎn)至加入其對(duì)應(yīng)能夠抑制其本底表達(dá)的合適濃度3-AT的SD-/His-Leu-Ura缺性培養(yǎng)基上，觀察酵母生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化組合pHiSi-ACS2+ pGADT7-MsWRKY33的酵母可以正常生長(zhǎng)，而其余對(duì)照均無(wú)法生長(zhǎng)（圖5b），說(shuō)明MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可以與AtACS2的啟動(dòng)子特異性結(jié)合，MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子對(duì)AtACS2具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

2.6? MsWRKY33與下游基因MsACS2啟動(dòng)子的結(jié)合活性分析

將pABAi-MsACS2轉(zhuǎn)入Y1HGold酵母菌株，將轉(zhuǎn)化成功的酵母菌液點(diǎn)至含不同濃度AbA的SD/-Ura平板上，篩選其可以抑制其本底表達(dá)的AbA濃度為600 ng·mL-1；再將pGADT7，pGADT7-MsWRKY33和pABAi，pABAi-MsACS2質(zhì)粒以兩兩組合的方式共轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母菌株，將轉(zhuǎn)化成功的酵母菌液點(diǎn)至含600 ng·mL-1 AbA的SD/-Ura-Leu平板上。其中，含AD/pABAi，AD-MsWRKY33/pABAi，AD/pABAi-pMsACS2重組質(zhì)粒的酵母菌液在SD/-Leu-Ura上可以正常生長(zhǎng)，在SD/-Leu-Ura（600 ng·mL-1 AbA）上無(wú)法生長(zhǎng)，而含AD-MsWRKY33/pABAi-pMsACS2重組質(zhì)粒的酵母菌液可以在SD/-Leu-Ura（600 ng·mL-1 AbA）上生長(zhǎng)，說(shuō)明MsWRKY33同樣可以和MsACS2基因啟動(dòng)子結(jié)合從而調(diào)控其基因表達(dá)，也進(jìn)一步說(shuō)明MsACS2可能具有與AtACS2相近的生物學(xué)功能（圖6）。

2.7? NaCl處理下的下游基因表達(dá)量分析

對(duì)該課題前期獲得的轉(zhuǎn)基因MsWRKY33紫花苜蓿株系進(jìn)行表達(dá)量鑒定，qRT-PCR顯示過(guò)表達(dá)株系L3和L4基因表達(dá)水平均顯著高于紫花苜?！熊?號(hào)對(duì)照株系（圖7）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MsWRKY33與MsACS2基因的調(diào)控關(guān)系，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析了200 mM NaCl處理下，MsWRKY33和MsACS2在CK（‘中苜1號(hào)）和MsWRKY33轉(zhuǎn)基因株系L3和L4中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)MsWRKY33在CK，L3和L4株系中均能被誘導(dǎo)表達(dá)，但在鹽處理的3～24 h內(nèi)兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的MsWRKY33表達(dá)水平均顯著高于CK（圖8）。CK株系中MsWRKY33表達(dá)水平呈逐漸上升趨勢(shì)，而在轉(zhuǎn)基因株系中呈先上升后下降的趨勢(shì)，且在6 h時(shí)達(dá)到峰值。3個(gè)株系中MsACS2的表達(dá)水平在0～36 h內(nèi)均呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，在36 h時(shí)轉(zhuǎn)基因株系L3和L4的MsACS2基因表達(dá)水平達(dá)到最高且顯著高于CK。在轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系受到鹽脅迫后的36 h內(nèi)，MsWRKY33的表達(dá)量一直處于高位，說(shuō)明鹽脅迫可以誘導(dǎo)MsWRKY33基因的表達(dá)，且轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照株系；轉(zhuǎn)基因株系在受到鹽脅迫24 h后，ACS2基因表達(dá)量才逐漸上升，與此相比CK株系的ACS2基因表達(dá)水平一直處于低位，這說(shuō)明了MsACS2基因可能受到MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。

3? 討論

3.1? MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子特異性結(jié)合W-box順式作用元件

土壤鹽漬化已經(jīng)成為人們農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要阻礙因素，全球已有超過(guò)8億的土地受到鹽漬化的影響［4］，中國(guó)的鹽堿土面積也達(dá)到了1.0×108hm2［4］。紫花苜蓿是全國(guó)乃至世界范圍內(nèi)種植最多的牧草品種，主要分布在我國(guó)的西北、華北和東北等地，其分布區(qū)域和生長(zhǎng)環(huán)境大都在土壤鹽漬化嚴(yán)重的地區(qū)，因此，了解紫花苜蓿耐鹽性的分子機(jī)制對(duì)于苜蓿品種的選育和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育中扮演重要角色，WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子之一參與植物體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及生物及非生物逆境響應(yīng)［30］，且研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子與紫花苜蓿耐鹽堿性相關(guān)［31］。在幾乎所有受到WRKY蛋白調(diào)控的基因啟動(dòng)子區(qū)域中都能發(fā)現(xiàn)（T）TGAC（C/T）這一高度保守的W-box元件；W-box多存在于許多與植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的啟動(dòng)子中［24］。ZmWRKY104通過(guò)與下游基因ZmSOD4啟動(dòng)子區(qū)W-box結(jié)合從而啟動(dòng)ZmSOD4基因的表達(dá)增強(qiáng)玉米（Zea mays L.）SOD活性，以更好地清除植物體內(nèi)由于鹽脅迫所產(chǎn)生的活性氧，從而增強(qiáng)了玉米的耐鹽性［32］。PsnWRKY70與PsnNAM，PsnMYB和PsnGT1基因的啟動(dòng)子中W-box結(jié)合從而啟動(dòng)下游基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)鹽脅迫［33］。以上研究均揭示了WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制，即WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域的W-box結(jié)合從而調(diào)控其表達(dá)。本研究結(jié)果也表明紫花苜蓿MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可以特異性的結(jié)合W-box順式作用元件。

3.2? MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可能正向調(diào)控MsACS2基因的表達(dá)

本課題前期對(duì)正常條件和鹽脅迫條件下的對(duì)照株系和轉(zhuǎn)基因株系的紫花苜蓿進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，其中發(fā)現(xiàn)有1個(gè)編碼ACC合成酶（乙烯合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶）ACS2基因顯著上調(diào)。ACS（ACC合成酶）是乙烯合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，其活性直接影響到乙烯的生成量［34］。乙烯合成過(guò)程中的重要酶類ACS，ACO及乙烯在植物耐鹽脅迫中起著重要作用。鹽脅迫可以促進(jìn)植物體內(nèi)乙烯的合成，如在煙草中，鹽處理能誘導(dǎo)NtACS1，NtACO1，NtACO2和NtACO3基因的表達(dá)［15-16］，同時(shí)乙烯及乙烯前體ACC也能顯著增加植物的耐鹽性［16］。乙烯的動(dòng)態(tài)平衡在鹽脅迫應(yīng)答中起著復(fù)雜的作用。因此，我們推測(cè)MsWRKY33通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控ACS2基因的表達(dá)從而影響乙烯的合成，進(jìn)而可能影響紫花苜蓿的耐鹽性。

MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可以與下游基因AtACS2啟動(dòng)子特異性結(jié)合，同源性分析結(jié)果顯示，紫花苜蓿中的ACS2基因與AtACS2同源性高達(dá)53.9%，因此我們有理由相信MsACS2基因與AtACS2具有相類似的生物學(xué)功能。為了進(jìn)一步確定MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子是否對(duì)紫花苜蓿ACS2同源基因也有調(diào)控作用，我們克隆了ACS2在紫花苜蓿中的同源基因MsACS2，并通過(guò)酵母單雜交驗(yàn)證了MsWRKY33對(duì)MsACS2也具有調(diào)控作用。本研究也證明了MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可以特異性結(jié)合W-box順式作用元件，而AtACS2和MsACS2基因啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)兩者都含有W-box元件，說(shuō)明MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子可能是通過(guò)與AtACS2和MsACS2基因啟動(dòng)子中的W-box元件結(jié)合從而調(diào)控其基因表達(dá)。近年來(lái)，植物的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)成為研究植物基因組學(xué)的強(qiáng)有力工具［35］，基因的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)比傳統(tǒng)的雜交、回交等育種技術(shù)效率更高［36］。通過(guò)利用基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究苜?；虻墓δ?，揭示基因的作用機(jī)制已成為研究前沿。TaACS2，TaACS7和TaACS8在TaWRKY51-RNAi株系中表達(dá)上調(diào)，而在TaWRKY51-OE株系中表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明TaWRKY51對(duì)TaACS2，TaACS7和TaACS8基因的調(diào)控是負(fù)向的［37］。在本研究中，轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照株系受到鹽脅迫后MsWRKY33基因表達(dá)量總體處于高位，而轉(zhuǎn)基因株系在受到鹽脅迫24 h后，ACS2基因表達(dá)量才逐漸上升，與此相比對(duì)照株系的ACS2基因表達(dá)水平一直處于低位，這可能是從MsWRKY33基因被鹽誘導(dǎo)從而轉(zhuǎn)錄翻譯為MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子蛋白，MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控ACS2基因這一過(guò)程需要時(shí)間，所以才導(dǎo)致ACS2基因表達(dá)較MsWRKY33出現(xiàn)滯后。因此，MsACS2基因可能受到MsWRKY33轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控且這種調(diào)控作用可能是正向的。

目前，已有研究證明WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)節(jié)ACS2基因的表達(dá)。AtWRKY33直接參與MPK3/MPK6級(jí)聯(lián)下游ACS2和ACS6表達(dá)的激活，以響應(yīng)病原體入侵［26］；擬南芥AtWRKY29正調(diào)控ACS5，ACS6，ACS8，ACS11和ACO5基因的表達(dá)從而促進(jìn)乙烯的合成［38］；小麥（Triticum aestivum L.）TaWRKY51通過(guò)結(jié)合ACS基因啟動(dòng)區(qū)域的W-box順式作用元件抑制ACS基因表達(dá)從而影響乙烯的合成，進(jìn)而對(duì)小麥側(cè)根的發(fā)育產(chǎn)生影響［37］；擬南芥WRKY8通過(guò)直接調(diào)控ACS6基因的表達(dá)參與了植物對(duì)TMV-cg的防御反應(yīng)［27］。本研究發(fā)現(xiàn)MsWRKY33可能通過(guò)與MsACS2基因啟動(dòng)子區(qū)的W-box結(jié)合從而調(diào)控其表達(dá)。現(xiàn)有研究大都集中在模式植物擬南芥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子直接靶向調(diào)控乙烯合成的關(guān)鍵限速酶基因從而調(diào)控乙烯生物合成，探討其在生物脅迫和植物生長(zhǎng)發(fā)育方面的影響［26-27，37-38］，而本研究旨在探究WRKY轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控ACS基因從而影響乙烯生物合成，且乙烯可能參與苜蓿的耐鹽脅迫進(jìn)程，但乙烯參與紫花苜蓿鹽脅迫的具體分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

3.3? 乙烯可能增強(qiáng)紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的耐受性

乙烯是通過(guò)對(duì)ROS的清除以增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的耐受性，如乙烯通過(guò)影響RBOHF介導(dǎo)的ROS和Na/K平衡來(lái)提高擬南芥的耐鹽性［39］；乙烯預(yù)處理或者EIN3（關(guān)于乙烯激活的轉(zhuǎn)錄因子）的活化能夠直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控POD的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)過(guò)氧化物酶（POD）的活性以清除ROS，從而提高植物對(duì)鹽脅迫的耐受性［40］。當(dāng)紫花苜蓿受到鹽脅迫時(shí)，MsWRKY33可能會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控MsACS2基因上調(diào)從而使乙烯的生物量增加，乙烯可能通過(guò)清除植物體內(nèi)的ROS活性氧來(lái)增強(qiáng)紫花苜蓿的耐鹽性，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

4? 結(jié)論

本研究克隆了AtACS2和MsACS2基因啟動(dòng)子，利用PlantCARE在線網(wǎng)站分析它們基因啟動(dòng)子順式作用元件，發(fā)現(xiàn)其均含有與WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的逆境響應(yīng)元件W-box；酵母單雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)了MsWRKY33可以與W-box順式作用元件、AtACS2和MsACS2啟動(dòng)子特異性結(jié)合；qRT-PCR結(jié)果表明MsWRKY33基因能被鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且ACS2基因可能受到WRKY33轉(zhuǎn)錄因子的正向調(diào)控并誘導(dǎo)其表達(dá)。因此，紫花苜蓿在受到鹽脅迫時(shí)可誘導(dǎo)體內(nèi)MsWRKY33的表達(dá)，MsWRKY33可能通過(guò)與其下游基因MsACS2啟動(dòng)子中W-box元件結(jié)合進(jìn)而正向調(diào)控其表達(dá)，影響乙烯合成，進(jìn)而影響紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)。

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（責(zé)任編輯? 彭露茜）