李青璞,白建海,姚 拓*,雷 楊,周 澤,張 琛,付衛(wèi)剛
(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070;2. 甘肅欣海牧草飼料科技有限公司,甘肅 蘭州 730070)
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)作為重要的豆科牧草,不僅具有廣泛適應(yīng)性、極高的飼用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1],而且由于其獨(dú)特的氮利用方式,能夠固氮改土,也發(fā)揮出了較高的生態(tài)價(jià)值。此外與禾谷類牧草相比,紫花苜蓿的蛋白質(zhì)含量較高。因此種植紫花苜蓿人工草地是解決畜牧業(yè)發(fā)展中蛋白飼料資源短缺的重要途徑和有效方法。我國(guó)苜蓿種植區(qū)域主要集中在北方地區(qū),如甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等地是我國(guó)苜蓿牧草的主產(chǎn)區(qū)[2]。甘肅河西地區(qū)作為我國(guó)西北地區(qū)紫花苜蓿優(yōu)勢(shì)主產(chǎn)區(qū),但因其地處內(nèi)陸,常年降雨稀少,制約了牧草生產(chǎn)和發(fā)展,同時(shí)該地區(qū)土壤養(yǎng)分匱乏,部分地區(qū)的種植戶和種植企業(yè)為了提高紫花苜蓿牧草產(chǎn)量,施用了大量化肥[3]。有研究表明,施肥可提高苜蓿粗蛋白含量,降低中性和酸性洗滌纖維含量,提高相對(duì)飼喂價(jià)值[4],但持續(xù)施用化肥并不能帶來(lái)持續(xù)增產(chǎn),相反會(huì)造成資源浪費(fèi),土壤質(zhì)量降低等問(wèn)題[5]。因此,這種經(jīng)驗(yàn)施肥不僅提高了生產(chǎn)成本也浪費(fèi)了肥料,而利用微生物菌劑與化肥搭配施用可以減少化肥用量,節(jié)約成本。
近年來(lái),微生物菌劑的研究與應(yīng)用有了很大的突破,其中以植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria,PGPR)為主要成分研制的新型PGPR菌肥已成為國(guó)內(nèi)外化肥替代物研究的熱點(diǎn)之一[6]。微生物菌劑是將有益的活性菌經(jīng)過(guò)特殊的加工,制成便于使用的生物制劑或活菌制劑[7],具有改善作物營(yíng)養(yǎng)狀況、調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng),提高土壤酶活性以及提升肥料利用率等功能,是提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一[8]。目前有關(guān)微生物菌劑與氮肥減量配施在設(shè)施作物領(lǐng)域研究較多,而對(duì)微生物菌劑與氮肥減量配施對(duì)紫花苜蓿生產(chǎn)和紫花苜蓿地土壤肥力的影響研究較少?;诖?本試驗(yàn)在甘肅河西地區(qū)進(jìn)行,研究微生物菌劑與氮肥減量配施對(duì)苜蓿草地生產(chǎn)力及土壤肥力特征的影響,以達(dá)到減少氮肥用量的同時(shí)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育及提高土壤肥力特性,為河西地區(qū)牧草生產(chǎn)提供科學(xué)合理的施肥量。
供試材料為‘驚盛’紫花苜蓿,由甘肅欣海牧草科技有限公司提供;供試菌株(表1)來(lái)源于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草地微生物實(shí)驗(yàn)室。
表1 供試菌株Table 1 Strains for test
1.2.1試驗(yàn)區(qū)概況 試驗(yàn)地位于甘肅省武威市民勤縣(甘肅欣海牧草科技有限公司,103°35′E,39°08′N),屬溫帶大陸性干旱荒漠氣候,平均海拔1 400 m,年平均氣溫8.8℃,年平均降水量為115 mm,年蒸發(fā)量2 646 mm;該地區(qū)太陽(yáng)輻射強(qiáng),光照充足;無(wú)霜期較短,極端最低氣溫-29.5℃,極端最高氣溫41.7℃,晝夜溫差大。土壤類型為灌漠土,土壤質(zhì)地偏砂,pH值8.28,鹽分含量0.41%,有機(jī)質(zhì)含量0.4%,全氮含量0.52 g·kg-1,全磷含量0.44 g·kg-1。
1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 氮肥減量配施試驗(yàn)于2022年8月第一茬紫花苜蓿收割后施入。全量氮肥施用量為150 kg·hm-2,所用氮肥為尿素(含N 46%)。采用大田小區(qū)試驗(yàn),設(shè)置7個(gè)施肥水平,如表2所示,每處理3個(gè)重復(fù),共設(shè)21個(gè)小區(qū)。試驗(yàn)小區(qū)面積為5 m×4 m=20(m2),為減少試驗(yàn)誤差,各小區(qū)之間以1 m的小田埂將其隔開。其中根瘤菌劑(GAU-123)施用量為4.5 L·hm-2,促生菌劑為一株根瘤菌和兩株芽孢桿菌的組合(GAU-123+Y1+Y3),施用量為根瘤菌2.25 L·hm-2、兩株芽孢桿菌分別為1.125 L·hm-2,播種前按上述用量拌種。試驗(yàn)田于2022年5月建植,人工條播,播種量為18 kg·hm-2,播種行距為30 cm,播種深度為2 cm,田間管理除施肥外,其他灌溉、除草、病蟲害防治等按照當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)苜蓿田統(tǒng)一進(jìn)行管理。
表2 試驗(yàn)處理Table 2 Test treatments
1.2.3菌劑制備 Y1、Y3采用LB液體培養(yǎng)基(10 g·L-1NaCl、10 g·L-1胰蛋白胨和 5 g·L-1酵母粉,將pH調(diào)節(jié)為7.0),GAU-123采用YMA液體培養(yǎng)基(甘露醇10 g·L-1、酵母粉3 g·L-1,Mg SO40.2 g·L-1,NaCl 0.1 g·L-1,K2HPO40.25 g·L-1,KH2PO40.25 g·L-1),進(jìn)行培養(yǎng)。以上液體培養(yǎng)基均用立式壓力蒸汽滅菌鍋在 121℃下對(duì)培養(yǎng)基滅菌 20 min;冷卻后,在超凈工作臺(tái)上加入菌液,每100 mL的LB液體培養(yǎng)基分別添加100 μL的母液;在28℃,150 r·min-1條件下的恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)48 h后,使用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度,調(diào)節(jié)濃度一致[9-10],三種菌株均OD600 ≥0.5,通過(guò)平板涂布,計(jì)算后活菌數(shù)均約為108CFU·mL-1。
在紫花苜蓿初花期測(cè)定其株高,每個(gè)小區(qū)選取10株長(zhǎng)勢(shì)相近的植株,用卷尺測(cè)植物基部到頂端的長(zhǎng)度,精確到0.1 cm;在紫花苜蓿初花期,每個(gè)小區(qū)分別取1 m × 1 m的樣方刈割測(cè)產(chǎn),留茬5 cm,刈割后立即稱其鮮重,選取300 g鮮草帶回實(shí)驗(yàn)室于烘箱內(nèi)105℃殺青30 min,后調(diào)至65℃烘至恒重,計(jì)算干鮮比,換算為單位面積干草產(chǎn)量;將用于測(cè)定產(chǎn)量的草樣粉碎備用。土壤樣品于初花期(2022年10月9日)紫花苜蓿刈割后采集,利用鐵鍬挖出完整的苜蓿根,抖落根系大塊土壤板結(jié),收集附于根上0~5 mm的土壤。參考《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》測(cè)定粗蛋白(Crude protein,CP)、粗脂肪(Ether extract,EE)、中性洗滌纖維(Neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)含量[11],并計(jì)算飼草相對(duì)飼喂價(jià)值(Relative feed value,RFV)[12];土壤全量養(yǎng)分等參照《土壤農(nóng)化分析》[13]測(cè)定;采用蘇州格銳思生物科技有限公司試劑盒測(cè)定土壤過(guò)氧化氫酶、土壤脲酶、土壤蔗糖酶、土壤堿性磷酸酶活性。
采用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,利用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析,對(duì)不同施肥處理下的植株株高、生物量、土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性采用單因素方差分析(One-way ANOVA),顯著水平為P<0.05,用Origin 2021繪制圖表。
利用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法計(jì)算各處理所選指標(biāo)的隸屬函數(shù)值,并將所選指標(biāo)隸屬函數(shù)值求和,再取均值,以均值大小進(jìn)行排名,均值越大,排名越靠前。隸屬函數(shù)計(jì)算公式[14]:
R(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)
(1)
R(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)
(2)
式中,R(Xi)表示某指標(biāo)隸屬函數(shù)值,Xi表示該指標(biāo)的測(cè)定值;Xmax表示該指標(biāo)最大值;Xmin表示該指標(biāo)最小值。若測(cè)定指標(biāo)與牧草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值呈正相關(guān)關(guān)系,則用式(1)計(jì)算;若呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,則用式(2)計(jì)算。
不同施肥處理下,紫花苜蓿株高和干草產(chǎn)量如圖1所示。各個(gè)施肥處理之間紫花苜蓿株高無(wú)顯著差異,株高范圍在55.1~60.1 cm之間,其中C7,G7,G6處理下紫花苜蓿株高與其他處理相比較低;與CK相比,接種微生物菌劑和氮肥減量處理下的紫花苜蓿干草產(chǎn)量無(wú)顯著差異。
圖1 不同施肥處理的紫花苜蓿產(chǎn)量和株高Fig.1 Yield and plant height of alfalfa under different fertilization treatments注:誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下圖同Note:The error line is standard error. Different lowercase letters indicate distinct differences,the same as below
不同施肥處理下紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和相對(duì)飼用價(jià)值如表3所示。粗蛋白和粗脂肪含量表現(xiàn)為隨施氮量減少而下降的趨勢(shì),其中C6,G6處理下的粗蛋白均顯著低于其他處理(P<0.05),G7處理下的粗蛋白含量為17.01%,較高于其他施肥處理;G6處理下的粗脂肪含量則顯著低于其他施肥處理(P<0.05),其中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維顯著高于其他施肥處理(P<0.05);通過(guò)計(jì)算相對(duì)飼用價(jià)值發(fā)現(xiàn),CK,G8,C7,G7處理下的相對(duì)飼用價(jià)值顯著高于C6,G6處理(P<0.05),其中CK處理的相對(duì)飼用價(jià)值最高,達(dá)到200.95,C7次之為193.54。
表3 不同施肥處理的紫花苜蓿營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和相對(duì)飼用價(jià)值Table 3 Nutritional quality and relative feeding value of alfalfa under different fertilization treatments
不同施肥處理下土壤理化性質(zhì)如圖2所示。不同施肥處理對(duì)土壤速效磷含量無(wú)顯著影響;與CK相比,C8處理顯著增加了土壤硝態(tài)氮含量,達(dá)到2.14 mg·kg-1(P<0.05),其余接種和施氮處理無(wú)顯著差異,除G6處理外,其余各接種和施氮處理的土壤銨態(tài)氮含量顯著高于CK(P<0.05),其中G8處理下的土壤銨態(tài)氮含量最高,達(dá)到 0.57 mg·kg-1;不同施肥處理間的土壤速效磷、有機(jī)質(zhì)、含水率和pH值與CK相比無(wú)顯著差異;接種促生菌與氮肥減量40%降低了土壤全氮含量;與CK相比各處理間的土壤電導(dǎo)率差異顯著(P<0.05),其中G8,C6處理下土壤電導(dǎo)率低于其他處理。
圖2 不同施肥處理的土壤理化性質(zhì)Fig.2 Soil physicochemical properties under different fertilization treatments
不同施肥處理下土壤酶活性如圖3所示。各施肥處理間的土壤過(guò)氧化氫酶和蔗糖酶活性無(wú)顯著差異,與CK相比,各接種微生物菌劑與氮肥減量處理的土壤過(guò)氧化氫酶活性均有所升高,升高范圍在5.59%~14.98%;C8,G7處理下的土壤堿性磷酸酶活性顯著高于其他處理,較CK提高了19.48%和44.70%(P<0.05);各接種微生物菌劑與氮肥減量處理的土壤脲酶活性均顯著低于CK,降低范圍在9.76%~76.36%(P<0.05)。
圖3 不同施肥處理的土壤酶活性Fig.3 Soil enzyme activities under different fertilization treatments
如圖4所示,苜蓿粗蛋白、粗脂肪與相對(duì)飼用價(jià)值極顯著正相關(guān)(P<0.01),苜蓿中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維與相對(duì)飼用價(jià)值極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),苜蓿粗蛋白、粗脂肪與中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01);土壤堿性磷酸酶與土壤脲酶極顯著正相關(guān)(P<0.01),土壤含水率與土壤速效磷、土壤電導(dǎo)率極顯著正相關(guān)(P<0.01),土壤堿性磷酸酶與酸性洗滌纖維極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。
圖4 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between indicators注:*和**分別表示在0.05和0.01水平上的差異顯著Note:* and ** indicate significant differences at the 0.05 and 0.01 levels respectively
采用模糊數(shù)學(xué)隸屬函數(shù)法對(duì)不同施肥處理的紫花苜蓿生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)和土壤指標(biāo)進(jìn)行分析,結(jié)果表明(表4),在所有處理中,G7處理表現(xiàn)最好,平均隸屬函數(shù)值為0.59,其次為G8處理,平均隸屬函數(shù)值為0.53,C7處理平均隸屬函數(shù)值小于0.42,綜合表現(xiàn)較差。
表4 不同施肥處理的綜合評(píng)價(jià)Table 4 Comprehensive evaluation under different fertilization treatments
研究表明氮肥是限制牧草生產(chǎn)的重要因素之一,施用氮肥可以有效提高牧草的產(chǎn)量[15]。目前關(guān)于苜蓿在種植過(guò)程中是否需要添加額外的氮肥以及氮肥施用量的大小來(lái)提高紫花苜蓿的干草產(chǎn)量這一關(guān)鍵問(wèn)題上仍存在不同觀點(diǎn),部分觀點(diǎn)認(rèn)為苜??梢耘c根瘤菌共生固氮以滿足苜蓿生長(zhǎng)的需要,因此,氮肥的添加并不會(huì)對(duì)苜蓿的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[16],另一部分觀點(diǎn)認(rèn)為在苜蓿生長(zhǎng)初期及衰老期苜蓿根瘤菌固氮酶活性較弱,添加外源氮可以提高苜蓿的干物質(zhì)產(chǎn)量[17]。由微生物菌劑制作成的菌肥來(lái)替代部分化肥是實(shí)現(xiàn)化肥減量的重要技術(shù)途徑之一,近年來(lái)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用也備受重視[18]。本研究中,接種微生物菌劑與氮肥減量處理下的紫花苜蓿株高和產(chǎn)量與CK相比無(wú)顯著差異,說(shuō)明接種微生物菌劑替代部分氮肥未降低紫花苜蓿產(chǎn)量。因此在首年建植的苜蓿田中可以有效減少氮肥施用量從而增加經(jīng)濟(jì)效益。施用微生物菌劑可以改善土壤結(jié)構(gòu),促進(jìn)植株根系生長(zhǎng),從而促進(jìn)植株地上部的生長(zhǎng)能力,同時(shí)減少化肥使用量。韓華雯等[19]研究發(fā)現(xiàn),復(fù)合菌種接種劑+半量磷肥處理的苜蓿生長(zhǎng)效果最佳,其苜蓿株高和產(chǎn)量分別較對(duì)照增加9.00%和11.98%;劉青海[20]的研究表明,混合接種菌劑處理促生效果更好,其中Jm92+Lx22+S11+G處理下的地上植物量較對(duì)照提高121.21%,極大的提高了苜蓿地上生物量。
牧草的粗蛋白、粗脂肪含量、NDF和ADF含量是評(píng)價(jià)優(yōu)質(zhì)飼草的重要指標(biāo),而這與科學(xué)合理的施肥息息相關(guān)。研究表明,施用氮肥顯著提高了牧草的粗蛋白含量[21],有效降低紫花苜蓿的NDF和ADF含量,改善牧草品質(zhì)[22],利用復(fù)合菌劑處理替代半量化肥,紫花苜蓿的干草產(chǎn)量、粗蛋白和粗脂肪含量分別較CK提高10.6%,16.4%和 4.2%[23]。本研究中,當(dāng)接種微生物菌劑與氮肥減量20%和30%時(shí),未降低紫花苜蓿的粗蛋白、粗脂肪、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維含量和相對(duì)飼用價(jià)值,接種微生物菌劑與氮肥減量40%時(shí),其上述營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)均顯著降低,說(shuō)明接種微生物菌劑可以替代20%~30%的氮肥施用量而不降低紫花苜蓿的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。王瑞峰等[24]通過(guò)添加根瘤菌和不同施氮量發(fā)現(xiàn),中等施肥水平及接種根瘤菌可顯著提高苜蓿地上生物量,且接種根瘤菌可降低苜蓿莖葉中纖維素的含量。
土壤理化性質(zhì)是影響土壤肥力的重要因素,同時(shí)綜合反映了土壤質(zhì)量水平[25],也可表征土壤生產(chǎn)能力的大小。土壤可被植物吸收利用的無(wú)機(jī)氮素包括硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種形式,因此常被作為土壤氮素供應(yīng)水平的重要指標(biāo)[26]。本研究結(jié)果顯示,與CK相比接種微生物菌劑與氮肥減量處理未降低土壤中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量,且在C8處理下的硝態(tài)氮含量顯著高于CK,銨態(tài)氮含量除G6處理外,其他處理均高于CK,且不同施肥處理的土壤速效磷含量無(wú)顯著差異。這表明接種微生物菌劑對(duì)提高土壤中有效性氮含量有一定作用。有研究表明施44 kg·hm-2氮肥能增加0~15 cm土層的全氮含量,而對(duì)15 cm以下土層的全氮含量沒有影響,且每茬刈割后施氮肥不會(huì)造成苜蓿地下硝態(tài)氮的積累[27]。土壤有機(jī)質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量決定了土壤質(zhì)量的好壞除為植物提供不同養(yǎng)分外,還可以反映土壤的肥力[28]。本研究中,與CK相比,接種微生物菌劑與氮肥減量處理的土壤有機(jī)質(zhì)含量差異不顯著,表明氮肥減量未降低土壤有機(jī)質(zhì)含量,這可能是由于施用微生物菌劑后增加了土壤中有益微生物的數(shù)量,提高了土壤質(zhì)量。土壤養(yǎng)分的有效性受土壤pH值的干擾,且植物根系對(duì)養(yǎng)分的吸收也會(huì)受此影響,相關(guān)研究表明,土壤中氮的施入會(huì)加速土壤的酸化,因?yàn)橥寥乐械牧苋?、硝化作用以及植物?duì)陰陽(yáng)離子的吸收不均衡都有可能造成土壤酸化[29-30]。此外,施用生物菌肥也可能導(dǎo)致土壤pH值下降,土壤中的微生物菌群在分解有機(jī)物的過(guò)程中產(chǎn)生的酸類物質(zhì)和呼吸放出的二氧化碳與水形成的碳酸在土壤中積累可能會(huì)造成土壤pH值降低[31]。
土壤酶活性被認(rèn)為是土壤肥力的一種傳感器,它們直接參與土壤中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化以及養(yǎng)分的釋放和固定,并且與土壤養(yǎng)分的供應(yīng)密切相關(guān),土壤酶活性水平反映了土壤中的微生物活性和生化反應(yīng),通常被用作反映微生物活性和土壤肥力的指標(biāo)。本研究表明,紫花苜蓿根際土壤脲酶和堿性磷酸酶活性具有相關(guān)性,主要是因?yàn)橥寥缐A性磷酸酶和脲酶是土壤中的重要成分,其活性與土壤磷和氮的代謝密切相關(guān)[32],氮肥減量處理下的土壤脲酶活性低于CK,而C8,G7處理下的土壤堿性磷酸酶活性高于CK,這可能是由于微生物對(duì)施氮反應(yīng)不同所致,氮的添加可以通過(guò)抑制終產(chǎn)物或微生物同化形成的產(chǎn)物增加土壤中產(chǎn)脲酶微生物的數(shù)量[33],施氮增強(qiáng)了土壤脲酶活性,同時(shí)減少土壤中氮限制,從而增加微生物數(shù)量來(lái)改善紫花苜蓿地下部生長(zhǎng)狀況,促進(jìn)紫花苜蓿生長(zhǎng)[34]。Chibeba等[35]通過(guò)慢生根瘤菌單接種和根瘤菌與固氮螺旋菌共接種試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)共接種并沒有增加籽粒產(chǎn)量,因此需要進(jìn)一步研究有效的共接種菌種來(lái)探究多功能菌種共接種在生產(chǎn)上的限制因素;黃秋良等[36]研究了褐球固氮菌、巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌不同接種量組合對(duì)芳樟生長(zhǎng)的影響,發(fā)現(xiàn)不同接種量會(huì)影響接種效果;趙宇賓等[37]研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)芽孢桿菌與阿氏芽孢桿菌分別接種都具有良好的促生效果,但混合接種卻沒有取得更高的共生固氮效率。本研究中促生菌和根瘤菌共接種且減氮30%的處理效果并沒有高于單接根瘤菌且減氮30%處理,可能是由于菌劑配比,菌間代謝物的互相影響所致,此外土壤作為一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)體系,微生物功效的發(fā)揮也取決于它的數(shù)量、與土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)力以及土壤有機(jī)質(zhì)等含量的高低[38],且豆科植物根系中可以分離出根瘤菌,因此添加根瘤菌劑可能在豆科植物根系定殖較為容易。
與施用全量氮肥相比,接種微生物菌劑與氮肥減量20%~30%處理未降低紫花苜蓿的株高、干草產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),且通過(guò)對(duì)不同施肥處理的紫花苜蓿生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)和土壤指標(biāo)的綜合分析,綜合表現(xiàn)最好的為G7(即接種根瘤菌與氮肥減量30%)處理,有利于減少河西地區(qū)氮肥施用量,為河西地區(qū)紫花苜蓿的科學(xué)施肥提供依據(jù)。