周建浩,王東方,劉 影,王淑娟,馬震原,謝彩華,趙雪麗,楊海波,馮桂丹, 康臺生,胡煜鋒,李博文,閆若潛*

(1.河南農業(yè)大學動物醫(yī)學院,鄭州 450046;2.河南省動物疫病預防控制中心/河南省重大動物疫病監(jiān)測預警 及防控重點實驗室,鄭州 450008;3.河南科技大學動物科技學院,洛陽 471000; 4.上海市動物疫病預防控制中心,上海 201103)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病,以急性腹瀉、嘔吐、脫水為主要特征[1]。PED是當今養(yǎng)豬業(yè)除非洲豬瘟以外危害最為嚴重的腹瀉疫病,該病主要對10日齡內仔豬危害最為嚴重,發(fā)病率可達100%;致死率為80%,最高可達100%[2],我國將其列為二類動物疫病。PEDV是α冠狀病毒屬(Alphacoronavirus)的成員,直徑為90～190 nm的RNA病毒,該基因組長約28 kb,包含2個復制酶蛋白:ORF1a和ORF1b;4個結構蛋白:S、E、M、N;1個非結構蛋白:ORF3。我國當前PEDV毒株主要分為經典毒株(G1)和變異毒株(G2)兩大群,經典毒株以CV777為代表,分為G1a和G1b兩個亞群;變異毒株分為G2a、G2b和G2c三個亞群,以G2a(如AH2012、JS-HZ2012等)最為流行[3]。2010年11月以來,由PEDV變異毒株(G2群)引起的豬群腹瀉性疫病可感染各個階段的豬,尤其對哺乳仔豬危害最嚴重,原有的以CV777毒株代表的經典毒株疫苗對變異株感染保護效力差。PEDV經典毒株和變異毒株基因組中的M和N基因高度保守,因此本研究建立的ddPCR方法引物/探針的選擇根據M基因保守區(qū)域進行設計,以實現(xiàn)可對PEDV經典毒株和變異毒株同時檢測的目的。

數字PCR(digital PCR,dPCR)是繼普通PCR、熒光定量PCR之后出現(xiàn)的第三代聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction)技術[4-5]。目前數字PCR技術主要分為微滴式數字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和芯片式數字PCR[6](chip digital PCR,cdPCR)。dPCR與熒光定量PCR相比較,dPCR不受擴增效率的影響,無需依賴標準曲線和參照樣本[7],極大提高了低拷貝樣品的檢測靈敏度,因而定量結果更加準確[8]。dPCR方法靈敏度高、特異性好,實現(xiàn)了真正意義的絕對定量[9],更有利于低病毒含量樣品的檢測進而推動PEDV核酸標準物質的研制。

本研究將根據PEDV的M基因的保守區(qū)域設計的引物對/探針,建立特異性強、敏感性高、重復性好的ddPCR檢測方法,為臨床上PEDV感染的早期檢測診斷、PEDV核酸標準物質的研制等提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 儀器設備及主要試劑

全自動核酸提取儀、商品化病毒基因組DNA/RNA核酸試劑盒為西安天隆公司產品;ABI 7500熒光定量PCR儀為美國ABI公司產品;微滴式數字PCR儀,2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG、2×qScriptTMXLT 1-Step RT-qPCR ToughMix?、Fluorescein sodium Salt等試劑為法國Stilla Technologies公司產品;PrimeScriptTMRT Master Mix、Premix ExTaqTM等均為寶生物工程(大連)有限公司產品。

1.2 樣品來源

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬丁型冠狀病毒、豬偽狂犬病病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒、豬輪狀病毒、豬細小病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型等10種病毒核酸樣品由河南省動物疫病防控中心實驗室提供;口蹄疫病毒O型、A型國家二級標準物質由河南省動物疫病預防控制中心實驗室提供。疑似PEDV感染的腸內容物、小腸組織、糞便等150份樣品由河南省動物疫病預防控制中心實驗室保存。

1.3 ddPCR引物和探針的設計及合成

根據GenBank登錄的PEDV的基因序列,選取其M基因(MK862249.1)序列保守區(qū),利用Primer Express 3.0軟件設計特異性引物和探針,引物對/探針序列為F:5′-GGCGCAGGACACATTCTTG-3′;R:5′-AAGTAGTGAGAAGCGCGTCTGTT-3′;P:FAMTGGTCTTTCAATCCTG-MGB。引物及探針均由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.4 ddPCR反應程序的優(yōu)化

1.4.1 ddPCR預混酶的選擇 使用自行建立的FQ-PCR引物對/探針。將經FQ-PCR檢測定量后的PEDV核酸稀釋至終濃度1.0×104copies·μL-1作為一步法ddPCR模板,將其核酸RNA反轉錄為cDNA作為兩步法檢測模板(以下簡稱‘模板’)。在一步法和兩步法ddPCR supermix for Probes 體系分別加入2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG、2×qScriptTM XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix?進行擴增。根據兩種預混酶擴增結果,選擇合適的預混酶。

1.4.2 ddPCR引物對/探針濃度以及退火溫度的優(yōu)化 以PEDV核酸cDNA為模板,ddPCR引物的濃度為0.3～0.9 μmol·L-1、探針濃度0.1～0.3 μmol·L-1,采用矩陣法篩選最佳的引物對/探針組合濃度。退火溫度設置52～62 ℃。反應體系:2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG,Fluorescein sodium Salt 2.5 μL,模板3 μL,用無菌蒸餾水補齊至25 μL。ddPCR擴增條件:45 ℃ 5 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,50～62 ℃ 45 s,共45個循環(huán)。通過分析微滴分布狀態(tài)、拷貝數、檢測結果等確定最佳的引物對/探針濃度和最佳退火溫度。

1.5 ddPCR檢測方法與行業(yè)標準FQ-PCR方法敏感性比較試驗

對PEDV核酸cDNA模板進行10倍梯度稀釋,濃度為1.0×104～1.0×10-1copies·μL-1;采用中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準實時熒光RT-PCR檢測方法[10](以下簡稱:行標FQ-PCR方法)和本研究建立的ddPCR方法同時對5個濃度的PEDV cDNA模板進行檢測,比較檢測結果,評估本研究建立的ddPCR檢測方法的敏感性。

1.6 ddPCR檢測方法的特異性試驗

采用本研究建立的ddPCR方法對PEDV、PDCoV、PRV、TGEV等12種全基因組核酸總RNA反轉錄cDNA同時進行檢測,以評估該ddPCR檢測方法的特異性。

1.7 ddPCR檢測方法的重復性試驗

選取濃度分別為1.0×103、1.0×102、1.0×101copies·μL-1PEDV核酸 cDNA為模板,用本研究建立的ddPCR方法進行擴增,對每個濃度進行3批次批間試驗和批內試驗檢測,計算變異系數,評估該方法的重復性。

1.8 ddPCR檢測方法對臨床樣品的檢測

采用本研究建立的ddPCR方法和行業(yè)標準FQ-PCR方法對實驗室保存150份臨床疑似PEDV感染的腸內容物、小腸組織、糞便等樣品進行檢測,將1.0×104copies·μL-1PEDV核酸cDNA模板作為陽性對照,以正常vero細胞培養(yǎng)物作為陰性對照,評價ddPCR方法對臨床樣品檢測效果。

2 結 果

2.1 ddPCR反應程序的優(yōu)化

2.1.1 ddPCR預混酶的選擇 根據兩種預混酶推薦的引物對/探針濃度進行擴增,結果顯示:采用2×qScriptTMXLT 1-Step RT-qPCR ToughMix?的拷貝數為7 338 copies·μL-1;采用2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG的拷貝數為10 647 copies·μL-1。因此,選擇2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG作為本研究的預混酶。

2.1.2 ddPCR引物對/探針濃度以及退火溫度的優(yōu)化 ddPCR引物對/探針濃度的優(yōu)化結果顯示:上下游引物濃度各0.5 μmol·L-1,探針濃度0.25 μmol·L-1時拷貝數最高,檢測結果最穩(wěn)定。最佳反應體系:上下游引物濃度各0.5 μmol·L-1,探針濃度為0.25 μmol·L-1,2×PerfeCTa? qPCR ToughMix? UNG 12.5 μL,Fluorescein sodium Salt 2.5 μL,PEDV模板3 μL,無菌蒸餾水補足至總體積25 μL。ddPCR退火溫度的優(yōu)化結果顯示:退火溫度為56 ℃時,陰陽性微滴分區(qū)最為明顯,拷貝數最高。最佳的反應程序:45 ℃ 5 min,95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,56 ℃ 45 s 共45個循環(huán)。

2.2 ddPCR檢測方法的評價

2.2.1 與行標FQ-PCR方法敏感性比較試驗 行業(yè)標準FQ-PCR方法的標準曲線結果顯示,相關系數R2為0.993,斜率為-3.647。本研究建立的ddPCR方法線性動態(tài)靈敏度范圍和標準曲線:y=-1.045 3x+4.193,R2為99.8%(圖1)。ddPCR方法檢測極限為0.15 copies·μL-1(圖2),行業(yè)標準FQ-PCR方法檢測下限為10 copies·μL-1。結果表明,本研究建立的ddPCR方法敏感性明顯高于行業(yè)標準FQ-PCR方法。

圖1 ddPCR方法對PEDV檢測的標準曲線Fig.1 Standard curve of PEDV detection by ddPCR method

圖2 ddPCR方法對10倍梯度稀釋的PEDV檢測Fig.2 Detection of PEDV with 10-fold gradient dilution by ddPCR

2.2.2 特異性試驗 使用本研究建立方法,僅PEDV陽性對照出現(xiàn)擴增,拷貝數為10 087 copies·μL-1,陰性對照以及PDCoV、PRV、TGEV等11種全基因組核酸均未出現(xiàn)陽性微滴。結果表明,本研究建立的ddPCR方法特異性強。

2.2.3 重復性試驗 結果顯示,批內重復性試驗變異系數(CV)為2.10%～7.40%;批間重復性試驗變異系數(CV)為1.52%～7.40%(表4)。結果表明,本研究建立的ddPCR方法重復性好。

2.2.4 ddPCR檢測方法對臨床樣品的檢測 本研究建立的ddPCR方法和行業(yè)標準FQ-PCR方法對150份臨床樣品的檢測結果顯示:行業(yè)標準FQ-PCR方法檢出76份陽性樣品,檢出率為50.6%;ddPCR方法檢出89份陽性樣品,檢出率為59.3%(其中76份為行業(yè)標準FQ-PCR方法檢測陽性樣品,13份為行標FQ-PCR方法檢測陰性樣品);其中,ddPCR方法檢出的63份陽性樣品中的48份與標準熒光PCR檢測陽性結果一致。結果表明,本研究建立的ddPCR方法靈敏性高,具有很好的臨床應用效果,可以有效避免漏檢。

表3 ddPCR方法檢測PEDV的重復性試驗Table 3 Repeatability test of ddPCR method for PEDV detection

3 討 論

近年來,非洲豬瘟、豬流行性腹瀉、豬丁型冠狀病毒病、豬偽狂犬病等豬重要病毒性疫病嚴重威脅著我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全[11]。由PEDV變異毒株引起的豬群腹瀉性疫病是當前除非洲豬瘟以外嚴重影響我國生豬養(yǎng)殖的重要疫病[12]。目前對PEDV感染進行快速、敏感的病原學檢測的常用手段是FQ-PCR方法,其存在敏感性低、判讀需依賴Ct值等問題。建立PEDV ddPCR方法對PEDV感染的早期診斷、PEDV核酸標準物質的研制以及PEDV疫苗抗原含量評價等具有重要意義。

綜合考慮到變異毒株和經典毒株的保守區(qū)域,本研究在設計引物對/探針時選擇能涵蓋變異毒株與經典毒株的M基因[13],以建立適用性更廣的PEDV ddPCR方法。在設計引物的同時,嚴格控制退火溫度之間的差距,保證上下游引物Tm值的差距最小。對退火溫度進行優(yōu)化,當退火溫度為56 ℃時,PEDV陰陽性微滴分區(qū)最為明顯,可疑微滴最少,拷貝數最高。證明引物之間有著較好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性。

本研究對自建FQ-PCR方法和行業(yè)標準FQ-PCR方法[10]進行比較。結果顯示,自建的FQ-PCR方法在檢測的敏感性、重復性方面優(yōu)于行業(yè)標準FQ-PCR方法。為了使ddPCR方法的檢測定量更加準確,本研究選取敏感性強、重復性好的自建FQ-PCR方法的引物對/探針來建立ddPCR方法。本研究建立的ddPCR方法,極大地提高了檢測的靈敏性,其特異性較強,與PDCoV、PRV等11種病毒均無交叉反應。當PEDV處于潛伏期感染時,病毒的含量較低,使用普通PCR方法和熒光RT-PCR方法很難檢測到。而本研究建立的ddPCR方法最低檢測極限為0.15 copies·μL-1,為PEDV早期檢測提供了重要的技術手段。另外,臨床樣品的檢測結果顯示,ddPCR與行業(yè)標準FQ-PCR方法符合率為100%,敏感性高于行業(yè)標準FQ-PCR,能夠滿足PEDV的臨床樣品檢測。

采用ddPCR方法和FQ-PCR方法對150份臨床樣品進行檢測,結果顯示,ddPCR方法對行業(yè)標準FQ-PCR方法檢測陽性樣品的檢測符合率為100%。在PEDV感染早期及病毒含量較低的臨床樣品檢測中,ddPCR方法更具有檢測優(yōu)勢。

4 結 論

本研究基于PEDVM基因保守區(qū)域為模板設計引物對和探針,經優(yōu)化反應體系及反應條件,建立了一種敏感性高、特異性強、重復性好、臨床應用效果佳的PEDV ddPCR方法,為臨床上PEDV感染的早期診斷和定量檢測、PEDV核酸標準物質的研制以及豬流行性腹瀉防控等提供了技術手段。