王 瑩,李佳康,曾 悅,史開拓,韋麗婷,彭佳佳,李秋燕,曹龍龍*,周登元,*

(1.武漢科前生物股份有限公司,武漢 430000;2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,武漢 430070)

貓杯狀病毒(feline calicivirus,FCV)屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)水皰性病毒屬(Vesivirus),可感染所有貓科動(dòng)物,目前無(wú)特效治療藥物[1]。FCV感染后主要表現(xiàn)為口炎、結(jié)膜炎、鼻炎等炎癥和全身性的發(fā)熱等,有時(shí)也可引起胃腸炎癥,偶爾出現(xiàn)皮膚潰爛、肺炎、跛行等[2]。劉健等[3]對(duì)上海市17例呼吸道癥狀的貓病例進(jìn)行FCV的鑒定,陽(yáng)性率達(dá)到76.47%。由于FCV感染后極難清除,康復(fù)后仍然會(huì)長(zhǎng)期帶毒并存在持續(xù)排毒的情況,這導(dǎo)致FCV仍是目前貓科動(dòng)物重要的傳染病之一,防控形勢(shì)嚴(yán)峻[4]。

FCV基因組全長(zhǎng)約7.7 kb,單股正鏈RNA(ssRNA)病毒,無(wú)囊膜,直徑為35～40 nm,核衣殼為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)[5]。目前,FCV只有一種血清型,根據(jù)遺傳進(jìn)化關(guān)系分為2種基因型(基因Ⅰ型和Ⅱ型),但沒有明顯的地域分布,而不同毒株間存在較明顯的抗原差異性[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,我國(guó)寵物貓數(shù)量逐年增加,臨床急需特效治療的生物制劑以及快速鑒定FCV感染的方法來緩解我國(guó)FCV的防控及治療壓力。近年來,單克隆抗體技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于ELISA、膠體金等方向。相關(guān)研究表明,無(wú)論是以FCV全病毒還是FCV VP1衣殼蛋白作為免疫原,均可得到良好的單克隆抗體[5]。本研究基于國(guó)內(nèi)FCV流行毒株,通過蔗糖梯度離心制備FCV免疫原進(jìn)行單克隆抗體制備,為FCV的診斷方法優(yōu)化、流行毒株篩選以及深入研究提供生物原料。

1 材料與方法

1.1 主要材料

FCV-SH192(GenBank: OM650792.1)、FCV-HB29(GenBank: OM650783.1)、FCV-JS143(GenBank: OM650785.1)、FCV-HN183(GenBank: OM650786.1)和FCV-SD348(GenBank: OM650796.1)均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存;FCV陽(yáng)性血清和陰性血清均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 FCV蔗糖梯度離心純化及免疫原制備

將FCV-SH192病毒按照參考文獻(xiàn)[5]中蔗糖梯度離心純化方法進(jìn)行純化,純化后滅活作為免疫原。

1.3 FCV單克隆抗體的制備

參照文獻(xiàn)[6]中單克隆抗體的制備方法,將純化滅活后的FCV-SH192株作為免疫原進(jìn)行小鼠免疫、細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選和腹水制備。

1.4 單克隆抗體的生物學(xué)特性鑒定

參照文獻(xiàn)[7]中單克隆抗體的鑒定方法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞株抗體分泌穩(wěn)定性的測(cè)定、單克隆抗體類型鑒定、間接免疫熒光(IFA)特異性鑒定和蛋白免疫印跡(Western blot)特異性鑒定。

1.5 單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)檢測(cè)

按照常規(guī)間接ELISA方法對(duì)所制備的單克隆抗體腹水進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)[7]。

1.6 單克隆抗體腹水與不同毒株反應(yīng)性

取單克隆抗體腹水(1∶500稀釋),采用IFA和Western blot測(cè)定其與5株FCV毒株(FCV-SH192、FCV-HB29、FCV-JS143、FCV-HN183和FCV-SD348)的特異反應(yīng)性。

2 結(jié) 果

2.1 FCV單克隆抗體的制備、效價(jià)測(cè)定與抗體類型鑒定

經(jīng)4次亞克隆,獲得1株分泌FCV抗體的雜交瘤細(xì)胞,命名為3B11。將其連續(xù)傳代至40代,每5代上清抗體效價(jià)檢測(cè)基本穩(wěn)定?？贵w類型鑒定顯示,3B11單抗重鏈為IgG1亞類,輕鏈為κ鏈。

2.2 單克隆抗體的特異性鑒定

IFA結(jié)果顯示:MAb 3B11可與FCV-SH192株產(chǎn)生特異性熒光,熒光強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照一致(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示:MAb 3B11可與FCV-SH192株發(fā)生特異性反應(yīng),條帶與陽(yáng)性對(duì)照一致,與F81細(xì)胞無(wú)反應(yīng)(圖1B)。

A. IFA鑒定MAb 3B11的特異性;B. Western blot鑒定MAb 3B11特異性。M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) A. IFA identified the specificity of MAb 3B11;B. Western blot identified the specificity of MAb 3B11. M. Protein marker圖1 單克隆抗體3B11的特異性鑒定Fig.1 Specificity identification of monoclonal antibody 3B11

2.3 單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)檢測(cè)

3B11雜交瘤細(xì)胞所制備腹水對(duì)5株FCV毒株ELISA效價(jià)為1∶12 800～1∶51 200(圖2)。

圖2 單克隆抗體腹水3B11對(duì)5株FCV毒株的ELISA效價(jià)檢測(cè)Fig.2 ELISA assay of monoclonal antibody ascites 3B11 against 5 FCV strains

2.4 單克隆抗體腹水與不同毒株反應(yīng)性

腹水MAb 3B11與5株FCV均可產(chǎn)生IFA特異性熒光,其中FCV-HB29熒光稍弱,其余熒光強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照一致(圖3A);腹水MAb 3B11與5株FCV均可發(fā)生Western blot特異性反應(yīng),且條帶大小一致,與F81細(xì)胞無(wú)反應(yīng)(圖3B)。

3 討 論

A. 不同F(xiàn)CV毒株的IFA反應(yīng)性;B. 不同F(xiàn)CV毒株的Western blot反應(yīng)性。M. 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) A. IFA reactivity of different FCV strains;B. Western blot identification results of different FCV strains. M. Protein marker圖3 單克隆抗體腹水3B11與不同F(xiàn)CV毒株的IFA和Western blot反應(yīng)性Fig.3 IFA and Western blot reactivity of monoclonal antibody ascites 3B11 with different FCV strains

FCV的高變異性使得其疫苗有效性較差。據(jù)劉健等[3]報(bào)道,上海分離株與FCV-F9疫苗株遺傳關(guān)系較遠(yuǎn),他們認(rèn)為這是當(dāng)前疫苗對(duì)貓的免疫效果不佳的主要原因。因此“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”是FCV防控的主要措施之一[8]。目前臨床上快速診斷FCV感染以qRT-PCR為主[9],近年來ERA、NanoPCR等方法也研究、開發(fā)出來,但存在較大的局限性——需特殊專業(yè)儀器及場(chǎng)地[10-11]。目前,針對(duì)貓泛白細(xì)胞減少癥病毒的單克隆抗體的臨床應(yīng)用已相對(duì)成熟,而FCV的相關(guān)研究卻相對(duì)薄弱[9-11]。因此本研究為了優(yōu)化當(dāng)前診斷方法,將FCV滅活后作為免疫原進(jìn)行單克隆抗體制備,成功篩選到的1株FCV單克隆抗體。研究表明該抗體具有良好的特異性,并對(duì)5株國(guó)內(nèi)流行FCV毒株均具有IFA、Western blot結(jié)合特性。這與先前所報(bào)道的FCV雖然變異較大但單一毒株作為免疫原篩選的抗體對(duì)不同毒株之間仍具有一定結(jié)合特性的相關(guān)研究結(jié)果相符[6]。目前FCV基因的多樣性是抗原檢測(cè)和疫苗免疫失敗的主要原因,但本研究的抗體對(duì)多株流行且遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)的毒株具有廣泛的結(jié)合特性,因此可為國(guó)內(nèi)FCV流行毒株分離、鑒定、篩選以及診斷方法的優(yōu)化提供生物原料。

4 結(jié) 論

本研究成功制備的MAb 3B11對(duì)FCV具有良好的特異性、免疫反應(yīng)性及廣譜識(shí)別性,可作為FCV免疫學(xué)診斷的工具,為FCV的診斷方法優(yōu)化、流行毒株篩選以及深入研究提供生物原料。