周文惠,包紅霞,王俊豪,黃遠(yuǎn)玲,王文惠,郝海紅,2,3,4,5*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 農(nóng)業(yè)微生物資源發(fā)掘與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070;2.動(dòng)物育種與健康養(yǎng)殖前沿 科學(xué)中心,武漢 430070;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué),農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室,武漢 430070; 4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)-深圳營(yíng)養(yǎng)與健康研究院,深圳 518000;5.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子 832000)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens,CP)是革蘭陽性厭氧條件致病菌,感染可引起多種畜禽疾病,包括雞壞死性腸炎、羊氣性壞疽等[1-2]。產(chǎn)氣莢膜梭菌作為一種食源性人畜共患病原菌,引起多種腸道疾病,對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生造成了嚴(yán)重的威脅。目前,抗生素在治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染中仍發(fā)揮極大的作用,然而,由于抗生素的濫用與不合理使用等多種因素,導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性增強(qiáng)[3-4]。中藥作為中國(guó)傳統(tǒng)文化的瑰寶和新藥研究領(lǐng)域的重點(diǎn)研究對(duì)象,以其不易誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥性、成本低、殘留少、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前研究熱點(diǎn),對(duì)多種疾病的治療也有一定作用[5-6]。中藥八大碗“參苓術(shù)草、芎歸地芍”中的草即為甘草,是常用且重要的中藥材,其應(yīng)用范圍廣泛,有“十方九草”之說。甘草查爾酮A(licorice chalcone A, LCA)是從甘草中分離出來的一種新型類黃酮類物質(zhì),在甘草中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他成分,具有抗癌、抑菌、抗炎、抗氧化、降血糖、保肝、抗寄生蟲、減少肥胖等多種藥理活性[7-13],其中抑菌作用是被顯著低估的一種重要的藥理作用[14-17],研究表明,LCA對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌具有明顯抑制作用[18],因此,本試驗(yàn)以LCA為代表藥物,探究其與多種抗生素聯(lián)用對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用,為抗生素與中藥單體聯(lián)用抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于98%)、LCA標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于98%)、四環(huán)素(tetracycline,TCN)標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于95%)購自上海源葉生物科技有限公司;克林霉素(clindamycin,CLDM)標(biāo)準(zhǔn)品(純度大于87.2%)購自中國(guó)藥品生物制品檢定所;替米考星(tilmicosin,TMS)標(biāo)準(zhǔn)品(純度95.3%)購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

藥敏板(動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性檢測(cè)板-魏氏梭菌1#、2#、3#)購自一諾康(天津)科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) A型產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CVCC2030)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家獸藥殘留基準(zhǔn)試驗(yàn)室提供。將甘油凍存菌液劃線于強(qiáng)化布氏瓊脂培養(yǎng)皿,于37 ℃厭氧條件培養(yǎng)18～24 h,挑取單個(gè)菌落接種于FTG培養(yǎng)基于上述相同條件下培養(yǎng)8～12 h,劃線接種于強(qiáng)化布氏瓊脂培養(yǎng)皿18～24 h,刮取菌落用無菌PBS調(diào)麥?zhǔn)媳葷?.5(此時(shí)活菌數(shù)約為1×108CFU·mL-1),制成細(xì)菌懸液。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 參照“1.2.1”的方法配制菌液;采用微量肉湯稀釋法[18],檢測(cè)CLDM、TMS、TCN等20種抗生素和LCA、小檗堿(berberine, BBR)2種中藥單體對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CVCC2030的敏感性,測(cè)量其單獨(dú)作用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值。采用棋盤法對(duì)該20種抗生素和2種中藥單體進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn),測(cè)量其聯(lián)合作用時(shí)的FIC值。計(jì)算FIC指數(shù),FIC指數(shù)=甲藥聯(lián)合使用時(shí)的FIC/甲藥單獨(dú)使用時(shí)的MIC+乙藥聯(lián)合使用時(shí)的FIC/乙藥單獨(dú)使用時(shí)的MIC。當(dāng)FIC指數(shù)≤0.5時(shí),表示有協(xié)同作用;當(dāng)0.52時(shí),表示有拮抗作用。選擇有協(xié)同作用的兩種藥物進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 殺菌曲線的繪制 細(xì)菌活化后挑取單菌落接種于100 mL FTG肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃ 過夜厭氧培養(yǎng)。使用FTG培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋100倍,分為10組,每組3個(gè)平行,各組藥物濃度見表1,于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)。分別于之后的24 h內(nèi)每隔2 h從每管內(nèi)取樣100 μL菌液,稀釋涂布于強(qiáng)化布氏培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24 h后分別計(jì)數(shù),繪制不同藥物種類和濃度作用下產(chǎn)氣莢膜梭菌的殺菌曲線[18-21]。

1.2.4 溶血試驗(yàn) 將羊血用PBS清洗后取1 mL沉淀用PBS稀釋為2%體積的紅細(xì)胞懸液,將稀釋好的紅細(xì)胞懸液置于4 ℃條件下保存。將過夜培養(yǎng)后的菌液用無菌PBS稀釋至0.5 MCF(麥?zhǔn)蠞岫葐挝?,設(shè)置11組,A組為無藥陽性對(duì)照,B組為PBS無菌陰性對(duì)照,試驗(yàn)組加入菌液和不同濃度的藥物(表2),37 ℃溫水孵育30 min,加入2 mL紅細(xì)胞懸液,再次溫水孵育30 min后取出,10 000 r·min-1

表1 殺菌曲線分組設(shè)置Table 1 Sterilization curve grouping settings μg·mL-1

離心2 min,取上清液測(cè)量其OD532 nm。根據(jù)公式計(jì)算其溶血定量,溶血定量(%)=(樣品OD532 nm-陰性O(shè)D532 nm)/(陽性O(shè)D532 nm-陰性O(shè)D532 nm)×100%,設(shè)定無藥A組為完全溶血,溶血定量100%,無菌B組為完全不溶血,溶血定量為0%。

表2 溶血試驗(yàn)分組設(shè)置Table 2 Hemolysis test grouping settings μg·mL-1

1.2.5 細(xì)菌的遷移力——滑動(dòng)試驗(yàn) 在BHI瓊脂培養(yǎng)基中加入不同濃度的LCA和TMS,混勻后制備含藥培養(yǎng)皿,用打孔器均勻打孔。按“1.2.1”方法配制菌液至1×108CFU·mL-1,將5 μL菌液滴入所制備的含藥培養(yǎng)皿中,37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,觀察其在平板上形成的菌苔大小與形狀。比較其遷移距離在藥物影響下的變化[22-25]。

1.2.6 氣性壞疽模型的建立 氣性壞疽模型使用25只SPF級(jí)6～8周齡BALB/c 雄鼠進(jìn)行試驗(yàn)。將小鼠分為5組,其中4組分別為1×109、108、107、106CFU·mL-14種不同濃度的菌液,一組為PBS陰性對(duì)照,取0.1 mL右后肢肌肉注射感染小鼠,一段時(shí)間后處死,解剖觀察其感染程度并進(jìn)行分離鑒定,確定最佳菌液濃度[18]。

1.2.7 產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的治療試驗(yàn) 將70 只6～8周齡的BALB/c小鼠分為14個(gè)組,每組5只。每只小鼠右后肢肌肉注射0.1 mL 1×108CFU·mL-1菌液,次日開始對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥,A組和B組分別為陰性和陽性對(duì)照組,治療時(shí)給0.2 mL 50%體積濃度的DMSO,其他組為試驗(yàn)組,分別給予不同濃度和種類的藥物,連續(xù)給藥6 d[26-28],每天觀察小鼠的外觀和精神狀態(tài),詳細(xì)記錄不同組小鼠在治療過程中的死亡情況及死亡時(shí)間,及時(shí)剖殺死亡小鼠,觀察其病理變化并拍照記錄,第7天全部處死、觀察病理變化。

1.2.8 細(xì)菌分離鑒定 取病變組織樣品,分離純化細(xì)菌后進(jìn)行PCR鑒定。PCR引物:cpa.F:5′-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG-3′;cpa.R:5′-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC-3′。采用25 μL PCR反應(yīng)體系:TaqDNA聚合酶12.5 μL,cpa上、下游引物各1 μL,菌液2 μL,ddH2O 8.5 μL,設(shè)立陰性與陽性對(duì)照。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為402 bp。

1.2.9 組織切片與HE染色觀察 無菌取各組小鼠感染的腿部肌肉組織,置于4%甲醛溶液中固定24 h,送至百仟度生物公司切片分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3、4所示,在20種抗生素中,共有紅霉素等6種抗生素與LCA有相加作用,吉他霉素等4種抗生素與LCA有協(xié)同作用;吉他霉素等4種抗生素與BBR有相加作用,喹烯酮等3種抗生素與BBR有協(xié)同作用。

表3 甘草查爾酮A(LCA)藥敏試驗(yàn)和聯(lián)合藥敏結(jié)果Table 3 Licorice chalcone A(LCA) drug sensitivity test and combined drug sensitivity results

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果顯示,LCA與多種抗生素聯(lián)用的協(xié)同作用普遍優(yōu)于小檗堿;在與LCA作用的抗生素中,TCN、TMS、CLDM FIC指數(shù)最低,與LCA協(xié)同作用最好。

表4 小檗堿(BBR)藥敏試驗(yàn)和聯(lián)合藥敏結(jié)果Table 4 Berberine (BBR) drug sensitivity test and combined drug sensitivity results

2.2 殺菌曲線

每隔2 h取體系中菌液涂板計(jì)數(shù),以時(shí)間為橫坐標(biāo),體系中菌落數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制殺菌曲線,如圖1～3所示。

圖1 甘草查爾酮A作用下產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030的殺菌曲線Fig.1 Bactericidal profile of Clostridium perfringens CVCC2030 under the action of licorice chalcone A

圖3 LCA與TMS聯(lián)合作用下產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030的殺菌曲線Fig.3 Bactericidal profile of Clostridium perfringens CVCC2030 under the action of licorice chalcone A and tilmicosin

由圖1、2可以看出,LCA對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用不明顯,TMS對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制作用較強(qiáng),生長(zhǎng)情況顯著受到抑制,細(xì)菌活性明顯下降,2×MIC濃度的TMS可在14 h內(nèi)將細(xì)菌殺滅至檢測(cè)線(10 CFU·mL-1)以下,4×MIC濃度的TMS可在12 h內(nèi)將細(xì)菌殺滅至檢測(cè)線以下,且后期無恢復(fù)生長(zhǎng),濃度越高,殺菌速度越快,所需時(shí)間越短,表明體外條件下TMS對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2030的殺菌效果呈現(xiàn)濃度依賴性。

與圖3結(jié)果對(duì)比,在相同濃度下LCA和TMS單獨(dú)使用對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌生長(zhǎng)僅起到抑制作用,不能完全殺滅,但聯(lián)合作用時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)停止,幾乎全部死亡。低于MIC濃度的藥物聯(lián)合作用時(shí),對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有一定的抑制作用,但8 h后恢復(fù)生長(zhǎng)。

2.3 溶血試驗(yàn)

根據(jù)溶血試驗(yàn)結(jié)果(表5)顯示,LCA與TMS對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的溶血效果均有抑制作用,細(xì)菌溶血性顯著降低,聯(lián)合作用處理后抑制作用更顯著,I組與D組和H組相比,溶血定量顯著降低,協(xié)同效果作用明顯。且不同濃度的藥物作用于細(xì)菌后其溶血定量有明顯的濃度梯度,其溶血抑制作用存在濃度依賴性,高濃度藥物對(duì)細(xì)菌的溶血抑制作用較強(qiáng)。

2.4 滑動(dòng)試驗(yàn)

如圖4所示,LCA和TMS對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)都有抑制作用,然而在本次研究結(jié)果中卻發(fā)現(xiàn)低劑量的LCA單獨(dú)使用時(shí)與空白對(duì)照組相比,菌苔平均直徑略有增大,高濃度時(shí)無肉眼可見的菌苔生長(zhǎng);TMS單獨(dú)使用時(shí)對(duì)細(xì)菌遷移的抑制作用隨濃度升高而增強(qiáng),對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的運(yùn)動(dòng)性無增強(qiáng)作用;當(dāng)LCA與TMS聯(lián)合使用時(shí),菌苔直徑顯著增大,但菌苔內(nèi)細(xì)菌密度有一定的降低。

表5 溶血試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Hemolysis test results %

A為空白對(duì)照組;B所用含藥培養(yǎng)基為L(zhǎng)CA 1 μg·mL-1 ;C所用含藥培養(yǎng)基為TMS 1 μg·mL-1;D所用含藥培養(yǎng)基為L(zhǎng)CA 0.5 μg·mL-1+TMS 0.5 μg·mL-1 A. The blank control; B. The drug-containing medium used is LCA 1 μg·mL-1; C. The drug-containing medium used is tilmicosin 1 μg·mL-1; D. The drug-containing medium used is LCA 0.5 μg·mL-1+tilmicosin 0.5 μg·mL-1圖4 滑動(dòng)試驗(yàn)中菌苔大小及形狀Fig.4 Size and shape of the fungal moss in the sliding test

2.5 小鼠氣性壞疽模型的建立

根據(jù)感染情況,選擇使用1×108CFU·mL-1菌液進(jìn)行肌注,成功建立小鼠腿部氣性壞疽模型。

2.6 鼠源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定

PCR結(jié)果如圖5,成功分離鼠源產(chǎn)氣莢膜梭菌16株。

M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1～16. 樣本;+. 陽性對(duì)照;-. 陰性對(duì)照 M. Marker 2000;1-16. Sample to be tested;+. Positive control;-. Negative control圖5 16株鼠源產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR鑒定結(jié)果Fig.5 PCR identification of 16 strains of Clostridium perfringens of murine origin

2.7 產(chǎn)氣莢膜梭菌感染治療試驗(yàn)

小鼠腿部肌肉大體觀察和HE染色切片結(jié)果如圖6、7。

感染1 h后,陰性對(duì)照組小鼠精神良好、皮毛光亮、行動(dòng)靈敏;陽性對(duì)照組和試驗(yàn)組均表現(xiàn)出右后肢行動(dòng)不便、跛行、精神萎靡等癥狀。試驗(yàn)組中高劑量LCA組全部死亡,高濃度TCN組死亡率達(dá)80%,見表6。

a.陰性對(duì)照組;b、c.陽性對(duì)照組;d.TCN 20 mg·mL-1組;e.TCN 80 mg·mL-1組;f.LCA 20 mg·mL-1 TCN 40 mg·mL-1組;g.TMS 10 mg·mL-1組; h.TMS 50 mg·mL-1組; i.LCA 20 mg·mL-1 TMS 10 mg·mL-1組; j.CLDM 5 mg·mL-1組; k.CLDM 10 mg·mL-1組; l.CLDM 50 mg·mL-1組;m.LCA 20 mg·mL-1組;n.LCA 20 mg·mL-1CLDM 40 mg·mL-1組 a. Negative control group; b and c. Positive control groups; d. Tetracycline 20 mg·mL-1 group; e. Tetracycline 80 mg·mL-1 group; f. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 tetracycline 40 mg·mL-1 group; g. Tilmicosin 10 mg·mL-1 group; h. Tilmicosin 50 mg·mL-1 group; i. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 tilmicosin 10 mg·mL-1 group; j. Clindamycin 5 mg·mL-1 group; k. Clindamycin 10 mg·mL-1 group; l. Clindamycin 50 mg·mL-1 group; m. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 group; n. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1 clindamycin 40 mg·mL-1 group圖6 病理組織觀察結(jié)果Fig.6 Pathological tissue observation results

A.陰性對(duì)照,未進(jìn)行感染處理;B.陽性對(duì)照,感染后未進(jìn)行治療;C.LCA 20 mg·mL-1;D. CLDM 5 mg·mL-1;E. CLDM 10 mg·mL-1;F. CLDM 50 mg·mL-1;G. TCN 20 mg·mL-1;H. TCN 80 mg·mL-1;I. TCN 20 mg·mL-1+LCA 20 mg·mL-1;J. TMS 10 mg·mL-1;K. TMS 50 mg·mL-1;L. TMS 10 mg·mL-1+LCA 20 mg·mL-1 A. Negative control, no attack treatment; B. Positive control, no treatment after attack; C. Licorice chalcone A 20 mg·mL-1; D. Clindamycin 5 mg·mL-1; E. Clindamycin 10 mg·mL-1; F. Clindamycin 50 mg·mL-1; G. Tetracycline 20 mg·mL-1; H. Tetracycline 80 mg·mL-1; I. Tetracycline 20 mg·mL-1+Licorice chalcone A 20 mg·mL-1; J. Tilmicosin 10 mg·mL-1; K. Tilmicosin 50 mg·mL-1; L. Tilmicosin 10 mg·mL-1+Licorice chalcone A 20 mg·mL-1圖7 小鼠右后肢肌肉HE染色結(jié)果(200×)Fig.7 HE staining results of right hind limb muscles of mice (200×)

給藥治療后發(fā)現(xiàn),LCA單獨(dú)使用時(shí)效果不顯著,高濃度LCA致死率高達(dá)100%,50 mg·mL-1CLDM抑菌效果較好,但體內(nèi)情況下CLDM與LCA協(xié)同后效果未見顯著增強(qiáng);LCA與TMS和TCN體內(nèi)協(xié)同作用較明顯,抗生素與LCA聯(lián)用后抑菌效果明顯優(yōu)于兩種抗生素單獨(dú)使用,高濃度TCN毒性較強(qiáng),致死率高,TMS組低濃度組未見死亡,高濃度組致死率低,安全性高,綜合效果優(yōu)于TCN。

剖檢時(shí)發(fā)現(xiàn)陽性對(duì)照組和各試驗(yàn)組右后肢均呈現(xiàn)不同程度的腫脹,部分小鼠右后肢毛發(fā)脫落,皮膚可見充氣水泡樣腫大,觸感堅(jiān)實(shí),剖開后見小鼠腿部肌肉組織顏色較深,有不同程度的出血和膿腫塊,如圖6中b、c所示,陰性對(duì)照組小鼠腿部肌肉呈肉粉色,無出血和膿腫,如圖6a所示。與陽性對(duì)照組相比,各試驗(yàn)組的腫脹程度可見不同程度的減輕,但與陰性對(duì)照組相比仍有一定改善。

表6 感染及治療前后小鼠病理變化及死亡率Table 6 Pathological changes and mortality of mice before and after the attack and treatment

隨機(jī)選擇部分小鼠病變組織進(jìn)行切片,如圖7,陰性組中多核肌細(xì)胞的細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣,橫切肌細(xì)胞為形態(tài)不規(guī)則的多邊形,相鄰細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞之間界限清晰,肌束之間間隙大小均勻,組織內(nèi)未見壞死、炎癥、出血、水腫等明顯病理性改變,組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常;陽性對(duì)照組視野中可見肌肉組織局部肌細(xì)胞壞死,組織形態(tài)遭到破壞,壞死肌纖維被增生的纖維結(jié)締組織取代,伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。LCA高劑量組全部死亡,低劑量組視野中可見肌細(xì)胞結(jié)締組織增生,細(xì)胞之間間隙顯著增大,組織排列疏松,伴有炎性細(xì)胞彌散性浸潤(rùn),但肌細(xì)胞壞死較陽性組少,組織形態(tài)仍可見。

低劑量CLDM組視野中肌肉組織局部仍可見肌細(xì)胞大面積壞死和纖維結(jié)締組織增生,伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);高劑量CLDM組肌束間結(jié)締組織輕度增生,肌束間隙輕度增大,炎性細(xì)胞少量彌漫性浸潤(rùn),抑菌效果顯著。CLDM與LCA聯(lián)用組與單獨(dú)使用時(shí)相比效果未見顯著增強(qiáng)。

TCN單獨(dú)作用時(shí)低劑量組效果不明顯,肌細(xì)胞壞死明顯,但與LCA聯(lián)用后組織僅有少量炎性細(xì)胞彌散性浸潤(rùn),但肌纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整,細(xì)胞未見壞死、出血等病理變化,可見TCN與LCA聯(lián)用能夠顯著提升治療效果;高劑量組鏡下細(xì)胞排列緊密,少見有炎性細(xì)胞和結(jié)締組織增生,治療效果顯著,但致死率較高,達(dá)80%。

TMS低劑量組鏡下視野中肌肉組織內(nèi)部分肌細(xì)胞壞死,肌束形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞,由大量結(jié)締組織增生取代,肌束間隙有大量炎性細(xì)胞彌散性浸潤(rùn);同濃度TMS與LCA聯(lián)用后,肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)相對(duì)完整,組織細(xì)胞排列輕度疏松,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少,協(xié)同作用顯著,TMS高劑量組肌細(xì)胞輕度溶解,肌細(xì)胞胞質(zhì)淡染,結(jié)締組織增生和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。

3 討 論

隨著畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展,細(xì)菌感染導(dǎo)致的畜禽疾病日益嚴(yán)重,且由于人們對(duì)抗生素的濫用和誤用,在實(shí)際生產(chǎn)中抗生素濫用現(xiàn)象十分普遍,導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性日益頻發(fā),尤其是“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生為人們敲響了警鐘。“減抗”“禁抗”已成為當(dāng)前流行的大趨勢(shì),抗生素替代品的研發(fā)迫在眉睫。

多項(xiàng)研究表明,LCA有一定的抑菌活性[29-34],但有關(guān)抗菌機(jī)制的研究仍不清楚。Haraguchi等[34]的研究表明,不同于其他查爾酮,LCA和甘草查爾酮C(LCC)在其B環(huán)中各有一個(gè)異戊二烯鏈,能夠?yàn)榉肿訚B透到細(xì)胞膜中提供足夠的疏水性。此外,LCA和LCC都是細(xì)菌NADH氧化酶的有效抑制劑,這些特性為其抗菌作用提供了基礎(chǔ)。

LCA對(duì)多種細(xì)菌都有不同程度的抑制作用。陳環(huán)環(huán)[29]、吳玉霞[35]通過棋盤法證實(shí)LCA與頭孢噻呋鈉聯(lián)合使用對(duì)大腸桿菌具有協(xié)同抑菌作用,與頭孢噻肟聯(lián)合具有協(xié)同和相加作用,與氨芐西林、阿莫西林、阿米卡星具有相加作用,得出結(jié)論,LCA與β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類聯(lián)用的抑菌效果較好,與喹諾酮類聯(lián)用協(xié)同效果不明顯。

LCA通過破壞金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁來抑制其生長(zhǎng),劉一寧[36]通過氣道滴注金葡菌建立小鼠的肺損傷模型,發(fā)現(xiàn)LCA可以降低感染小鼠肺部的載菌量。吳玉霞[35]通過掃描電鏡觀察LCA作用后對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以及標(biāo)準(zhǔn)菌的形態(tài)得出,LCA對(duì)MRSA抗菌活性明顯優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)菌。Qiu 等[37]研究認(rèn)為,LCA可能通過抑制Agr雙組分系統(tǒng),從而顯著降低了甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌分泌的SEA和SEB毒素,從而達(dá)到抑菌作用。

郭晉祥等[31]研究表明,LCA通過抑制生物被膜的形成從而實(shí)現(xiàn)對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用,且LCA對(duì)小鼠體內(nèi)銅綠假單胞菌感染有一定的治療作用,減少小鼠皮膚表面膿腫的形成。LCA對(duì)腸球菌的抑菌活性也是通過影響生物膜的形成實(shí)現(xiàn)的,Liu等[33]研究表明,LCA可以通過調(diào)控MarR家族、TetR家族和MerR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,抑制糞腸球菌生物膜的形成,從而發(fā)揮抗菌的作用。

本試驗(yàn)測(cè)定了LCA和小檗堿兩種中藥單體與紅霉素等20種抗生素對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC,并分別進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類抗生素與小檗堿和LCA聯(lián)合抑菌增效作用明顯,LCA對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值為4 μg·mL-1,有良好的抑菌活性,而小檗堿對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的MIC值為32 μg·mL-1,甘草查爾酮A具有更大的開發(fā)潛力。

殺菌曲線顯示,LCA和TMS對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長(zhǎng)抑制作用較為顯著,對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的溶血性也有濃度依賴性的抑制作用,聯(lián)合作用處理后效果明顯,推測(cè)LCA和TMS可能會(huì)影響產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素的產(chǎn)生,細(xì)菌的磷脂酶活性被抑制,從而影響其溶血性。

小鼠氣性壞疽的治療試驗(yàn)結(jié)果顯示,CLDM對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用在體內(nèi)和體外都有較好的表現(xiàn),但體內(nèi)試驗(yàn)顯示其與LCA協(xié)同作用后效果未見顯著提升,TCN和TMS與LCA協(xié)同作用表現(xiàn)較好。CLDM作為一種被廣泛應(yīng)用于厭氧菌感染的抗生素類藥物[38],對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑制效果極為顯著,雖然本試驗(yàn)中未與LCA表現(xiàn)出顯著的協(xié)同作用,但其單獨(dú)作用時(shí)的效果也值得關(guān)注。目前四環(huán)素類抗生素耐藥廣泛[39-40],出現(xiàn)了越來越多的耐藥菌株,且TCN的毒性較強(qiáng),殘留引起極大危害[41],因此TMS的應(yīng)用前景更加廣泛,治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染在臨床生產(chǎn)上的開發(fā)潛力更大,是一種值得關(guān)注的研究新方向,有待進(jìn)一步發(fā)掘。

4 結(jié) 論

在治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染時(shí),替米考星與甘草查爾酮A聯(lián)合作用,可以降低藥物使用量并提高治療效果。