劉悅陽,李夢媛,2,聶雪伊,馬亞博,侯雨欣,馬伯利,楊 易,徐金瑞*

(1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室,銀川 750021; 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室,銀川 750010)

2022年WHO全球結(jié)核病報告顯示,在2021年里全球新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)、耐藥性結(jié)核病患者數(shù)及結(jié)核病死亡人數(shù)較往年相比均有所上升[1]。在全球30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家中,我國結(jié)核病發(fā)病數(shù)排第三位。結(jié)核病(tuberculosis,TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)引起的慢性人畜共患傳染病,具有較強的傳染性和危害性[2]。Mtb是一種胞內(nèi)寄生菌,能夠寄生于巨噬細胞中,同時巨噬細胞作為Mtb入侵機體的第一道防線,當(dāng)Mtb入侵機體時,能夠激活駐留在肺組織中的巨噬細胞,活化后的巨噬細胞通過膜內(nèi)陷、出芽等方式吞噬Mtb,進而參與到抗結(jié)核的保護性免疫作用之中[3-4]。盡管如此,Mtb仍具有能夠逃脫巨噬細胞捕殺的機制,從而在宿主體內(nèi)存活。因此,闡明Mtb與巨噬細胞相互作用的機制具有重要意義。細胞自噬是一種重要的生理代謝途徑,對細胞內(nèi)成分的利用及維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用[5]。細胞自噬參與Mtb感染的多個環(huán)節(jié),包括自噬溶酶體形成、炎癥細胞因子分泌、抗原遞呈、抗菌肽產(chǎn)生[6]。在細胞饑餓、缺氧、胞內(nèi)細胞器損傷、微生物感染等多種應(yīng)激狀態(tài)下,自噬通常會被激活[7]。多種自噬相關(guān)蛋白(autophagy associated proteins)相互協(xié)調(diào),共同參與不同階段的自噬調(diào)控。自噬典型的特征是形成雙層膜自噬體,并涉及超過35個自噬相關(guān)蛋白,包括自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3(light chain 3)[8-9],在自噬過程中,細胞質(zhì)LC3-Ⅰ被水解后與脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ,LC3-Ⅱ可用于評估自噬的發(fā)生程度。研究表明,在Mtb感染過程中,肺泡巨噬細胞啟動細胞內(nèi)自噬、凋亡等多種機制,抑制或清除Mtb[10]。鈣結(jié)合蛋白S100A4也被稱為成纖維細胞特異性蛋白1(fibroblast specific protein1,FSP1),是S100鈣結(jié)合蛋白家族成員之一,含有101個氨基酸,相對分子質(zhì)量為12 ku,通常在免疫細胞如中性粒細胞、活化的巨噬細胞和某些T細胞的細胞質(zhì)中表達。S100A4為同源二聚體結(jié)構(gòu),這有利于目的蛋白的結(jié)合,在胞外通過與蛋白間相互作用從而達到調(diào)節(jié)細胞活力、血管生成、侵襲的作用。在腫瘤細胞中,S100A4作為一種典型的核定位信號,與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移有關(guān),包括細胞黏附、運動、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。S100A4也被報道參與調(diào)控多種細胞自噬,不僅參與腫瘤細胞自噬的調(diào)控,在非腫瘤疾病自噬調(diào)控過程中也至關(guān)重要[12]。在Mtb感染巨噬細胞過程中,S100A4是否對巨噬細胞自噬具有調(diào)控作用,尚未見報道。因此,本研究在干擾S100A4基礎(chǔ)上,對BCG感染的巨噬細胞自噬相關(guān)指標(biāo)進行檢測,旨在闡明S100A4對BCG感染的巨噬細胞自噬的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 菌種與細胞

牛結(jié)核分枝桿菌疫苗株卡介苗(BCG)購自成都生物制品研究所。人單核巨噬細胞(THP-1)由本實驗室保存。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國);結(jié)核分枝桿菌即用型培養(yǎng)液(晶諾生物,中國);佛波酯(Sigma-Aldrich,美國);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊,中國);qRT-PCR檢測試劑盒(全式金,中國);Trizol(Ambion,美國);M-PER、Lipofectamine RNAiMAX試劑(賽默飛,美國);Protease inhibitor Cocktail(Sigma-Aldrich,美國);BCA蛋白定量檢測試劑盒(凱基,中國);β-巰基乙醇(索萊寶,中國);S100A4干擾序列(吉瑪,中國);β-actin兔源多克隆一抗、HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體(H+L)二抗、LC3一抗、Beclin-1一抗(Proteintech,美國);S100A4一抗(Cell Signaling Technology,美國);Atg7一抗(Abcam,美國);4%多聚甲醛(百賽生物,中國)。

細胞計數(shù)儀(BioRAD公司,美國),Enspire 熒光酶標(biāo)儀(PerkinElmer公司,美國),光學(xué)顯微鏡(Motic公司,中國);Quantity Studio 5實時熒光定量PCR儀、NanoDrop-8000超微量分光光度計(賽默飛,美國);Amersham Imager600自動化學(xué)發(fā)光成像儀(General Electric公司,美國);熒光共聚焦顯微鏡(賽默飛,美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 BCG培養(yǎng) 將BCG接種于含結(jié)核分枝桿菌即用型培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),待達到對數(shù)生長期時通過分光光度計測定吸光度OD600 nm值,以確定BCG濃度[13-14]。

1.3.2 THP-1細胞培養(yǎng) THP-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和0.05 mmol·L-1β-巰基乙醇的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基中,當(dāng)細胞生長密度達到80%～90%時,采用半換液法進行傳代,傳代后將細胞靜置于37 ℃,5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13-14],按照每孔1×106個接種于6孔板中,每孔加入50 ng·mL-1的佛波酯后,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,將其誘導(dǎo)貼壁,并使其分化為巨噬細胞,更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用于后續(xù)試驗。

1.3.3 BCG感染 待細胞生長融合度達到80%～90%時,用BCG感染THP-1細胞,感染復(fù)數(shù)為10∶1,感染時間為2、4、6、12、24 h。確定最佳感染時間點,進行后續(xù)試驗。

1.3.4 干擾S100A4 將接種于六孔板中的THP-1細胞分別轉(zhuǎn)染siS100A4-1、siS100A4-2以及陰性對照si-NC,干擾序列信息見表1,并按照LipofectamineTM2000說明書要求配制質(zhì)粒和脂質(zhì)復(fù)合體,轉(zhuǎn)染完成后將六孔板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,篩選出干擾效果較好的序列用于后續(xù)試驗。后設(shè)置以下4個組:對照組(siNC)、BCG感染組(siNC+BCG)、siS100A4干擾組(siS100A4)和siS100A4+BCG感染組(siS100A4+BCG)。

表1 S100A4干擾序列Table 1 The interference sequence of S100A4

1.3.5 qRT-PCR 按照上述試驗設(shè)計組處理細胞后,采用Trizol法提取總RNA,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(總反應(yīng)體系為20 μL;反應(yīng)條件:42 ℃ 2 min,37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s),將cDNA進行10倍稀釋,再根據(jù)qRT-PCR試劑盒說明書添加各試劑,后置于PCR儀進行擴增(總反應(yīng)體系為20 μL,反應(yīng)過程分兩步進行,第一步:94 ℃ 30 s;第二步:94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共44個循環(huán)),用2-ΔΔCt法計算各基因的相對轉(zhuǎn)錄量。所用引物信息見表2。

表2 qRT-PCR 所用引物Table 2 the Primers information of qRT-PCR

1.3.6 總蛋白提取 將不同處理組的THP-1細胞分別用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗2次,每孔加入100 μL全蛋白裂解液,將裝有樣品的六孔板置于4 ℃搖床上充分裂解15 min,置于冰上,將細胞刮下,收集至提前加好磁珠的1.5 mL離心管中,渦旋震蕩 30 s,置于4 ℃搖床上5 min,重復(fù)6次,4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min后,吸取上清,根據(jù)BCA試劑盒說明書對提取的蛋白進行定量,并加入上樣緩沖液,于100 ℃沸水浴中5 min,置-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 Western blot檢測 取30 μg變性蛋白樣品進行上樣,通過SDS-PAGE凝膠電泳過后,利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至提前用甲醇激活的PVDF膜上,提前配制含5%脫脂奶粉的封閉液,待轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,將PVDF膜轉(zhuǎn)至封閉液中,室溫下封閉1 h,分別于4 ℃搖床上過夜孵育β-actin(1∶3 000稀釋)、S100A4(1∶1 000稀釋)、LC3(1∶1 000稀釋)、Atg7(1∶5 000稀釋)、Beclin-1(1∶1 000稀釋)等蛋白抗體后,用TBST緩沖液洗滌6次,每次5 min,加入HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG抗體(H+L)二抗(1∶3 000稀釋),室溫下孵育1.5 h,TBST洗滌3次,每次5 min,TBS洗滌3次,每次5 min,通過化學(xué)發(fā)光檢測儀對蛋白表達量進行檢測。

1.3.8 透射電鏡觀察細胞形態(tài)變化 按照透射電鏡樣本準(zhǔn)備說明書要求收集細胞團塊,沿管壁緩慢加入0.5%戊二醛固定液,重懸后在4 ℃冰箱中靜置10 min,將靜置后的細胞懸液轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中,12 000 r·min-1離心10 min,棄上清,再重新加入0.5%戊二醛固定液,低溫保存,用透射電鏡觀察并拍照記錄細胞亞顯微結(jié)構(gòu)。

1.3.9 自噬雙標(biāo)腺病毒轉(zhuǎn)染細胞觀察胞內(nèi)自噬流 將狀態(tài)良好且活率超過95%的THP-1細胞以5×105個·孔-1接種于提前放置了玻璃片的六孔板中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,待細胞貼壁后,棄培養(yǎng)液,每孔加入1 mL不含雙抗的新鮮培養(yǎng)液和10 μL mRFP-GFP-LC3腺病毒,置于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,每孔補加1 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12 h,按照“1.3.3和1.3.4”的方法先后加入siS100A4和BCG,之后用預(yù)冷的PBS緩慢潤洗3遍,每次5 min,加入4%多聚甲醛,室溫下固定20 min后用PBS潤洗3次,每次5 min。在載玻片上滴加1滴抗熒光淬滅劑,取出玻璃片置于載玻片上,用指甲油封片,整個過程需避光。最后將制好的片在熒光顯微鏡下觀察,每組取5個視野觀察并拍照,mRFP-GFP-LC3串聯(lián)的熒光蛋白腺病毒中表達的GFP和mRFP用于標(biāo)記和追蹤LC3,在熒光顯微鏡下成像,紅綠熒光合并后出現(xiàn)的黃色斑點即為自噬小體,紅色的斑點即自噬溶酶體。

1.3.10 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)過3次獨立試驗的驗證,并采用GraphPad Prism8.0.2軟件中的T-test或One Way ANOVE進行統(tǒng)計學(xué)分析,數(shù)據(jù)用Tukey:Compare all Pairs of columns柱狀圖表示,P值<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義(*代表差異顯著,P<0.05;**代表差異極顯著,P<0.01;***代表差異極顯著,P<0.001)。

2 結(jié) 果

2.1 BCG感染THP-1細胞不同時間S100A4和LC3Ⅱ蛋白的表達

BCG感染THP-1細胞不同時間后,采用Western blot檢測S100A4和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達,結(jié)果如圖1所示。與未感染組相比,BCG感染THP-1細胞后,S100A4和自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,在12 h時二者均表達最高(圖1A～C,P<0.001),LC3Ⅱ的表達在4 h與6 h時無顯著差異。以上結(jié)果表明,BCG感染THP-1細胞后,S100A4及細胞自噬水平均顯著升高,且12 h最高。

2.2 BCG感染THP-1細胞自噬體的數(shù)量變化

為了進一步探究BCG感染對THP-1細胞自噬的作用,在BCG感染THP-1細胞12 h后,采用透射電鏡觀察雙層膜的自噬體,并對細胞自噬體的數(shù)量進行分析。結(jié)果表明,與未感染組相比,BCG感染組中自噬體的數(shù)量明顯增多(圖2紅色箭頭所示)。

A. Western blot檢測S100A4和LC3Ⅱ蛋白表達水平;B、C. S100A4和LC3Ⅱ灰度值分析,均相對于β-actin進行計算。與對照組相比, ns.P>0.05, *. P<0.05,**. P<0.01,***. P<0.001 A. The protein expression of S100A4 and LC3Ⅱ detected by Western blot; B, C. Semi-quantification of S100A4 and LC3Ⅱwere calculated relative to β-actin. Compared with control group, ns.P>0.05, *.P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001圖1 BCG感染THP-1細胞不同時間點S100A4和LC3Ⅱ表達的Western blot檢測結(jié)果Fig.1 Western blot analysis of protein expression of S100A4 and LC3Ⅱ in BCG infected THP-1 cells at different time points

紅色箭頭所指為自噬體(對照Control) The red arrow shows the autophagosome圖2 透射電子顯微鏡觀察細胞內(nèi)自噬體Fig.2 Intracellular autophagosomes observed by transmission electron microscopy

A. Western blot檢測S100A4蛋白表達水平;B. S100A4灰度值分析相對于β-actin進行計算。與對照組相比,***. P<0.001 A. The protein expression of of S100A4 detected by Western blot; B. Semi-quantification of S100A4 was calculated relative to β-actin. Compared with control group, ***. P<0.001圖3 S100A4 siRNA的敲減效果驗證Fig.3 Verification of knockdown effect of S100A4 siRNA

2.3 S100A4小干擾RNA的篩選

采用小干擾RNA轉(zhuǎn)染THP-1細胞24 h后,Western blot檢測S100A4蛋白的表達。結(jié)果顯示,與siNC轉(zhuǎn)染組相比,siS100A4-2能夠極顯著干擾S100A4的表達(圖3A、B,P<0.001),且較siS100A4-1干擾效果明顯。因此,后續(xù)試驗采用siS100A4-2對THP-1巨噬細胞中的S100A4進行干擾(后續(xù)試驗采用siS100A4-2處理THP-1細胞)。

2.4 干擾S100A4對BCG感染THP-1細胞自噬相關(guān)分子的作用

為了驗證S100A4對BCG感染THP-1細胞后自噬的調(diào)控作用,使用篩選出的siS100A4-2轉(zhuǎn)染細胞,經(jīng)BCG感染12 h,采用qRT-PCR和Western blot檢測S100A4和自噬相關(guān)分子的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平。

由圖4可見,在mRNA轉(zhuǎn)錄水平上,BCG感染組中S100A4的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于siNC組(圖4A,P<0.05),siS100A4+BCG組S100A4轉(zhuǎn)錄水平極顯著低于siNC+BCG組(圖4A,P<0.001);siNC+BCG組中自噬相關(guān)因子LC3、Atg7、Beclin-1的轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于未感染組(圖4B～D,P<0.05),siS100A4+BCG組中LC3、Atg7的轉(zhuǎn)錄水平均極顯著低于siNC+BCG組(圖4B、4C,P<0.05),Beclin-1的轉(zhuǎn)錄水平均顯著低于BCG感染組(圖4D,P<0.01)。以上結(jié)果表明,S100A4能夠促進BCG誘導(dǎo)的THP-1細胞自噬。

A、B、C、D. q-PCR檢測S100A4、LC3、Atg7、Beclin-1 mRNA 表達水平。組間比較,*. P<0.05,**. P<0.01,***. P<0.001 A, B, C, D. The mRNA expression of S100A4, LC3, Atg7, Beclin-1 detected by q-PCR. Comparison among groups, *.P<0.05, **. P<0.01, ***. P<0.001.圖4 干擾S100A4經(jīng)BCG感染THP-1細胞后S100A4及自噬相關(guān)因子mRNA水平的表達Fig.4 The mRNA levels of S100A4 and autophagy related factors after BCG infection of S100A4 with THP-1 cells

圖5結(jié)果顯示,在蛋白水平上,與未感染組相比,siNC+BCG感染組中S100A4表達水平極顯著上調(diào)(圖5A、B,P<0.001),與siNC+BCG組相比,siS100A4+BCG組S100A4表達極顯著下調(diào)(圖5A、B,P<0.001);siNC+BCG感染組中自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1表達均顯著高于未感染組(圖5A、C、D、E,P<0.05),siS100A4+BCG組中LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1表達較siNC+BCG感染組均下調(diào)極顯著(圖5A、C～E,P<0.001)。以上試驗結(jié)果表明,干擾S100A4的表達能夠抑制BCG誘導(dǎo)的THP-1細胞自噬。

2.5 干擾S100A4對BCG 感染THP-1細胞后自噬流的影響

為了進一步明確干擾S100A4對BCG感染THP-1巨噬細胞對自噬的調(diào)控作用,采用激光共聚焦顯微鏡觀察自噬流的變化。圖6結(jié)果顯示,BCG感染組中黃色斑點代表的自噬體和由紅色斑點代表的自噬溶酶體的數(shù)量顯著高于未感染組(P<0.01),而siS100A4+BCG組紅色和黃色斑點顯著低于siNC+BCG感染組(P<0.05)。以上結(jié)果表明,干擾S100A4的表達抑制了由BCG誘導(dǎo)的巨噬細胞自噬,與 “2.4” 結(jié)果一致。

(圖6續(xù) Continued)

3 討 論

面對結(jié)核病死亡人數(shù)及新增病例雙增加的危機形勢,依然沒有發(fā)現(xiàn)有效的治療手段,藥物仍然是治療TB的主要方法,但是耐藥性的增強使TB的治療進入停滯期,所以仍會出現(xiàn)炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等生理學(xué)過程[15],對結(jié)核病的致病機理研究亟需攻克。細胞自噬常常被認(rèn)為是探究結(jié)核病致病機理的重要切入點,自噬作為細胞防御的第一防線,在多年以前人們就已經(jīng)開始通過這條途徑著手開發(fā)抗結(jié)核藥物[16]。Mtb作為一種胞內(nèi)病原體,當(dāng)Mtb入侵機體時,巨噬細胞會啟動一系列受體相關(guān)的信號級聯(lián)反應(yīng)引發(fā)免疫防御功能,并通過吞噬作用、細胞凋亡和細胞自噬等發(fā)揮抗感染作用[17]。陳琪等[18-19]的研究表明,當(dāng)Mtb入侵機體后,可誘導(dǎo)巨噬細胞活化并激活自噬,當(dāng)自噬發(fā)生時可將包含有Mtb的自噬體運輸至溶酶體進行降解[20]。本研究結(jié)果顯示,BCG感染巨噬細胞后自噬標(biāo)志性分子的表達呈現(xiàn)上升趨勢,表明自噬與結(jié)核病的發(fā)生機制相關(guān)聯(lián)。

鈣結(jié)合蛋白S100A4是S100鈣結(jié)合蛋白家組成員之一,首次在轉(zhuǎn)移細胞和成纖維細胞中發(fā)現(xiàn),同時也是炎癥巨噬細胞的特定亞群[21]。S100A4分布廣泛,在骨髓、脾、淋巴細胞、巨噬細胞及成纖維細胞中都有被檢測到。S100A4作為一種典型的遷移性蛋白,與多種癌癥的發(fā)生相關(guān),如乳腺癌[22]、結(jié)直腸癌[23]、胃癌[24]等。此外,S100A4也會引發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[25]、心肌梗死[26]、鼻竇炎[27]等非腫瘤疾病的發(fā)生。

本研究首先用BCG感染巨噬細胞不同時間,確定BCG誘導(dǎo)細胞自噬的最適時間。在此基礎(chǔ)上,用BCG和siS100A4單獨或共處理THP-1細胞,對S100A4的表達及自噬相關(guān)指標(biāo)進行檢測,以揭示S100A4對BCG感染巨噬細胞自噬的調(diào)控作用。近年來,有學(xué)者研究了S100A4介導(dǎo)的細胞自噬在其他疾病中的作用,如Hou等[28]研究表明,S100A4能抑制癌細胞自噬,從而促進癌細胞的增殖,Wang等[12]研究表明,沉默S100A4表達可促進自噬進一步促進堿燒傷后角膜創(chuàng)面的愈合。本研究結(jié)果顯示,S00A4正向調(diào)控BCG誘導(dǎo)的巨噬細胞自噬,與他人的研究結(jié)果存在差異,可見S100A4在不同疾病中對自噬的調(diào)控作用不同。

此外,S100A4也參與諸多病原體的生命活動,Yang 等[29]研究表明,S100A4+巨噬細胞能夠促進寨卡病毒進入生精小管促使其在睪丸中持續(xù)復(fù)制。此外,細菌在宿主體內(nèi)的高效清除與S100A4有關(guān),Bian等[30]研究表明,S100A4在體外無殺菌作用,當(dāng)宿主受到金黃色葡萄球菌感染后,S100A4可調(diào)節(jié)細菌清除并參與全身或局部炎癥反應(yīng)。由于腸道附著很多菌群,一些疾病的發(fā)展與腸道菌群息息相關(guān),Zhang等[31]研究表明S100A4可以增強腸道上皮細胞中枸櫞酸桿菌的附著力從而促進腸炎的發(fā)展。以上結(jié)果表明,S100A4在不同病原微生物感染中的作用不盡一致,或因病原微生物及宿主細胞類型不同所致。上述結(jié)果提示,S100A4對結(jié)核菌感染的巨噬細胞自噬在結(jié)核菌感染中的作用值得深入研究。

大量研究已經(jīng)表明S100A4能夠通過P53[32]、β-catenin[28]、PI3K/AKT/mTOR[12]等信號通路調(diào)控腫瘤細胞自噬。因此,S100A4調(diào)控BCG誘導(dǎo)巨噬細胞自噬的分子機制有待進一步研究。

4 結(jié) 論

BCG感染THP-1細胞導(dǎo)致細胞自噬的發(fā)生,干擾S100A4表達對BCG誘導(dǎo)的巨噬細胞自噬具有明顯的抑制作用。