陳啟偉,權 衡,陳勝利,劉東慧,于永峰,李彩玉,宮曉煒,儲岳峰

(中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所/蘭州大學動物醫(yī)學與生物安全學院,動物疫病防控全國重點實驗室 甘肅省病原生物學基礎學科研究中心,蘭州 730046)

動物養(yǎng)殖業(yè)是抗菌藥物排放和細菌耐藥性產生的源頭之一[1],堅持“人病獸防、關口前移”,更應加強細菌耐藥性的基礎研究[2-3]。鑒于哺乳動物不存在與病原細菌類似的生物素代謝調控機制,這使得“阻斷細菌生物素的合成和轉運途徑”可作為一類嶄新的抗細菌藥物靶標[4-5]。牛支原體(Mycoplasmabovis)是一種能引起牛發(fā)生肺炎、乳房炎和關節(jié)炎等疾病的高度傳染性病原體,在全球范圍內分布和流行,為目前發(fā)現(xiàn)的能在無細胞培養(yǎng)基生長的最簡單原核生物,其感染與生存依賴于外界微環(huán)境提供的各類營養(yǎng)代謝因子[6-7]。目前,世界范圍內M.bovis疫苗的研制尚無顯著成果[8],臨床中只能采用抗生素治療和綜合防控措施相結合的方法進行防控,M.bovis菌株嚴重耐藥,是該病防控中全球面臨的共同難題[9-11]。生物素(Vitmin H或B7)是一個具有7個碳原子骨架的含硫脂肪酸衍生物,是所有生物體所必需的微營養(yǎng)輔助因子[12]?；诖?開展M.bovis的B7轉運機制研究,以期拓寬對細菌B7代謝調控領域的認知,揭示介導細菌B7代謝調控的多樣性和復雜性,將對M.bovis防控具有極其重要的意義[13-14]。

從自然選擇的能量最優(yōu)化的角度來看,B7對細菌的生理代謝起著關鍵作用[12]?？茖W家發(fā)現(xiàn)存在于革蘭陽性菌(乳酸菌、鏈球菌屬、金黃色葡萄球菌、莢膜紅細菌)之中的能量耦合轉運蛋白(energy-coupling factor transporter,ECF)負責攝入一些維生素及其他微量元素[15-19],是近年來新鑒定的一類ATP結合盒(ABC)轉運蛋白家族。通常,ECF 轉運蛋白復合物包含三個原件:S成分(一個識別和轉運底物的膜蛋白),A/A′成分(能量耦合模塊,包括兩個結合并水解 ATP 提供能量的親水蛋白),以及T組分(一個傳遞能量的跨膜蛋白)。研究顯示,ECF轉運蛋白的S組件BioY搬運蛋白[20-21]能積極地發(fā)揮B7的吸收功能[22],并且僅表達BioY搬運蛋白就可以從環(huán)境中攝入足夠的生物素,以支持這類B7缺陷型細菌的存活[16,19]。近年來,原核生物中B7代謝調控的研究已逐步深入,但還有很多問題亟待解決[5,23-24]。從作者對M.bovis生長所需的營養(yǎng)豐富型培養(yǎng)基(需額外添加B7),到對M.bovis生理學的初步了解,暗示其可能存在生物素轉運代謝相關的系統(tǒng),但有關M.bovis代謝調控的研究甚少[25-26],迄今更未見到M.bovisB7代謝相關的研究報道[6-7,27-29]。

近期全基因組重測序和比較基因組學分析發(fā)現(xiàn)M.bovisPG45染色體上的基因MbBioY(MBOVPG45_0349)與ECF轉運蛋白 S成分中的BioY基因同源。明確MbBioY具有攝取外源B7的功能,可作為一類潛在的抗牛支原體藥物靶標,為緩解M.bovis耐藥性的嚴峻形勢提供獨特視角和解決方案。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

牛支原體 PG45株、PG45株熒光突變體庫由本實驗室構建、阿拉伯糖誘導性表達的pBAD表達載體,均由中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所草食動物細菌病團隊保存。大腸桿菌MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)的缺失株由浙江大學贈送,大腸桿菌Red同源重組系統(tǒng)由南京農業(yè)大學贈送;大腸桿菌ATCC25922購自美國菌種保藏中心,大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司。pMD19-T載體購自寶生物大連工程有限公司。

1.2 主要材料

DL2000 DNA Marker(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。細菌基因組DNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。質粒小提試劑盒(美國Omega)、DNA 凝膠回收試劑盒(美國Omega)。2×Taq Master Mix (Thermo Fisher)。胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)均購自美國 BD difcoTM公司;LB肉湯(英國Oxoid);瓊脂粉(北京Solarbio公司);0.22 μm無菌硝酸纖維素膜和過濾器購自美國 Millipore公司;限制性內切酶,T4 DNA連接酶,質粒提取試劑盒,膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司。改良 Thiaucourt’s 液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基: PPLO肉湯(21 g·L-1)或PPLO 瓊脂(35 g·L-1)、丙酮酸鈉(2 g·L-1)、滅活馬血清(200 mL·L-1)、酵母浸出液(100 mL·L-1)、葡萄糖(2 g·L-1)、1% 酚紅(2. 5 mL·L-1)、青霉素(20 萬U·L-1)、10% 醋酸鉈(1 mL·L-1),調節(jié)pH 至7. 2～7. 4。紫外分光光度計購于美國 Backman 公司;臺式高速離心機購自Beckman公司;PCR熱循環(huán)儀(杭州博日科技公司);CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);搖床(上海蘇坤實業(yè)有限公司);凝膠成像儀(美國Bio-Rad 公司);全自動化學發(fā)光成像儀(天能科技有限公司)。

根據M.bovisPG45株MBOVPG45_0349基因序列(GenBank登錄號:NC_014 760.1),利用NCBI在線設計引物,其中上游引物0349-F序列:5′-cggaattcCTAATATGAAACTTTGTTTCTTT-CA-3′;下 游 引 物0349-R序列:5-gcgtcgacATGGAGGGTATATATAGTAGCAAAGAATT-3′,產物大小966 bp,引物由西安擎科生物科技有限公司合成。

1.3 突變株的篩選

取出已成功構建的M.bovisPG45熒光突變體庫,利用Southern blot鑒定出基因插入的次數,目前的庫容量含有約1 368株突變株。將待測轉座突變菌分別接種在Thiaucourt’s培養(yǎng)基和不含生物素的Thiaucourt’s篩選培養(yǎng)基(利用海貍生物科技有限公司鏈霉親和素BeaverBeadsTMStreptavidin 試劑盒去除培養(yǎng)基中的生物素,即取50 mL改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基加入500 μL的鏈霉親和素磁珠,放置于4 ℃搖床上,結合16 h后,在超凈臺中用磁性分離架去除磁珠,將上清液倒于新的離心管中。為防止污染,可再用0.22 μmol·L-1過濾器進行過濾一次)平板上連續(xù)培養(yǎng),通過平行比較,當同一單克隆菌落在改良Thiaucourt’s培養(yǎng)基上能正常生長,而在去除生物素的Thiaucourt’s篩選培養(yǎng)基上無法生長時,即初步判定該單克隆菌株為生長缺陷突變株,通過對靶基因MBOVPG45_0349進行PCR擴增鑒定,最終篩選出MbBioY基因突變株。

1.4 功能性克隆

取出-80 ℃凍存的MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)的缺失株復蘇。同時從MG1655中提取pBAD質粒,并對提取的質粒進行質量濃度測定。用EcoR Ⅰ/SalⅠ對質粒進行雙酶切鑒定。酶切體系如下:pBAD質粒1 μg,EcoR Ⅰ/SalⅠ酶各1 μL,buffer 3 μL,去離子水補足至30 μL。放置于37 ℃水浴鍋中2～3 h,核酸電泳進行產物分離。按照Omega的瓊脂糖凝膠回收試劑盒對核酸產物進行回收,得到線性化的pBAD質粒。以PG45基因組為模板,以0349-F/0349-R為引物,擴增MBOVPG45_0349基因全長。進行瓊脂糖核酸電泳,膠回收,并測定基因片段的濃度?；蚱芜M行EcoR Ⅰ/SalⅠ雙酶切,酶切體系如上。將酶切完成的質粒pBAD和MBOVPG45_0349片段,進行連接。連接體系如下:2×ligation mix 5 μL,酶切質粒pBAD 1 μL,酶切片段 MBOVPG45_0349 4 μL。25 ℃連接2 h。將連接完成的體系加入到MG1655感受態(tài)細胞,具體操作:冰浴30 min,42 ℃熱激60 s,立即轉回冰上放置2 min左右,加入1 mL LB培養(yǎng)基37 ℃,220 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h。5 000 r·min-1,離心3 min,收集菌體,棄上清(保留底部200 μL),重懸菌體,全部涂布于Amp+LB平板。37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 16 h 后,挑菌接種于Amp+LB 液體培養(yǎng)基,37 ℃ 220 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 h以上至菌液渾濁,PCR鑒定,標記為MG1655(ΔbioC+pMbBioY、ΔbioH+pMbBioY、ΔbioHΔyigM+pMbBioY)。

1.5 生物素敏感性檢測

復蘇野生株PG45,突變株PG45ΔMbBioY,利用CFU計數法繪制M.bovisPG45株的生長曲線,開展MG1655及其缺失株,PG45ΔMbBioY與PG45親本株生物素敏感性檢測,評價PG45ΔMbBioY和PG45親本株在不同生物素濃度下對其生長的影響。復蘇MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株及MG1655(ΔbioC+pMbBioY、ΔbioH+pMbBioY、ΔbioHΔyigM+pMbBioY)構建的回補株,轉接于10 mL LB培養(yǎng)基或者去除生物素的LB培養(yǎng)基(方法同上),放置于37 ℃,220 r·min-1搖床每2 h取出200 μL 測定OD600 nm,記錄OD600 nm,繪制生長曲線。同時制備包含0.2%阿拉伯糖的0 nmol·L-1生物素和4 nmol·L-1生物素的LB平板,進行劃線培養(yǎng),評估MbBioY對生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌缺失株的生長影響。

2 結 果

2.1 牛支原體PG45 和PG45ΔMbBioY生物素敏感性檢測

利用Southern blot及PCR鑒定出實驗室篩選獲得的MbBioY(MBOVPG45_0349)基因突變株,同時利用CFU計數法繪制的M.bovisPG45株的生長曲線,開展PG45ΔMbBioY與PG45親本株生物素敏感性檢測,評價PG45ΔMbBioY和PG45親本株在不同生物素濃度下對其生長的影響(圖1)。

2.2 大腸桿菌 MG1655及其缺失株生物素敏感性檢測

利用OD600 nm檢測大腸桿菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株的生物素敏感性,繪制大腸桿菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株生長曲線,評價大腸桿菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)在不含生物素的LB培養(yǎng)基中的生長情況(圖2)。結果顯示,在去除生物素的LB培養(yǎng)基中,MG1655能正常生長,而MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)缺失株均無法正常生長,在添加1 nmol·L-1生物素的LB培養(yǎng)基中,MG1655 與MG1655(ΔbioC、ΔbioH)能緩慢生長,而MG1655ΔbioHΔyigM缺失株不能正常生長,表明yigM的缺失,影響大腸桿菌獲取外源生物素的能力。

2.3 牛支原體MbBioY功能性克隆驗證

根據大腸桿菌MG1655及其MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)對生物素的敏感性,將MbBioY基因異源敲入生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌MG1655(ΔbioC+pMbBioY、ΔbioH+pMbBioY、ΔbioHΔyigM+pMbBioY)后,開展M.bovis功能性克隆驗證(圖3),表明MbBioY單獨存在時,就能夠恢復生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌缺失株MG1655ΔbioHΔyigM的正常生長。

3 討 論

M.bovis作為極簡微生物的代表,介于細菌和病毒之間,無細胞壁,是一種最小的有細胞結構的微生物[6]。因基因組很小,研究證實其編碼基因主要與分解代謝有關,而缺失大量涉及生物合成的相關基因[6,9]。通過對M.bovisPG45株全基因組重測序和比較基因組學分析,發(fā)現(xiàn)M.bovis不具有完整的生物素代謝合成途徑(BioFADB),生物素敏感性檢測后發(fā)現(xiàn)M.bovis在去除生物素的培養(yǎng)基中不能正常生長,只有在添加了生物素的培養(yǎng)基中,通過從外界攝取生物素來維持正常的生理功能,說明生物素是M.bovis生長的必須元素(圖1)。PG45染色體上存在能量偶合因子(ECF)轉運蛋白復合物,包含三個完整的原件,其中與能量偶合因子(ECF)轉運蛋白 S成分的BioY同源的基因MbBioY(MBOVPG45_0349),全長996 bp,GC含量30.95%,預測編碼產物MbBioY蛋白長度為332個氨基酸,是一個識別和轉運底物的膜蛋白,MbBioY與目前已知的能量偶合因子(ECF)轉運蛋白家族的S成分親緣關系都很近,在支原體種屬中的氨基酸相似性為23.58%～100.00%,在不同種屬細菌中的氨基酸相似性為10.41%～79.01%,屬于ECF轉運蛋白家族的S成分一員,由7個跨膜結構域組成,與之前發(fā)現(xiàn)的能夠轉運外源生物素的S成分BioY蛋白(6個跨膜結構域)不同,提示該蛋白結構更復雜有待進一步探索;同時,分子對接(UCSF DOCK 6)顯示(與乳酸乳桿菌LactococcuslactisBioYPDB 4DVE比較),MbBioY蛋白轉運生物素的結合位點位于幾個跨膜片段的周質部分,表明可能是一種嶄新的生物素膜轉運蛋白。試驗驗證后發(fā)現(xiàn),當M.bovis缺失能量偶合因子轉運蛋白S組件MbBioY會影響其生長,表現(xiàn)出生物素代謝營養(yǎng)缺陷的表型(圖1)。通過構建生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌,檢測大腸桿菌 MG1655及其缺失株生物素敏感性,發(fā)現(xiàn)MG1655ΔbioC、MG1655ΔbioH的缺失,主要與MG1655的生物素合成相關,所以在添加了生物素的培養(yǎng)基中可以恢復正常的生長,而yigM是大腸桿菌生物素外源轉運的關鍵基因,yigM的缺失影響大腸桿菌獲取外源生物素的能力,MG1655ΔbioHΔyigM缺失株既不能自身合成生物素也不能從外源獲得生物素(圖2),因此MG1655ΔbioHΔyigM缺失株在無生物素的環(huán)境下無法正常生長,當開展MbBioY異源功能性克隆驗證時,通過將MbBioY異源敲入生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌MG1655ΔbioHΔyigM+pBAD-MbBioY后,發(fā)現(xiàn)MbBioY在添加了生物素的培養(yǎng)基中,能夠恢復MG1655ΔbioHΔyigM缺失株的正常生長,MbBioY與大腸桿菌生物素合成的關鍵基因bioC、bioH不同,而與yigM一樣,具有獲取外源生物素的能力,表明MbBioY單獨存在時就能夠恢復生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌缺失株MG1655ΔbioHΔyigM的生理功能(圖3)。

A.親本株PG45與PG45ΔMbBioY在不添加生物素的培養(yǎng)基中均無法生長;B.親本株PG45在添加1 nmol·L-1生物素的培養(yǎng)基中可正常生長,而PG45ΔMbBioY在添加1 nmol·L-1生物素的培養(yǎng)基中無法生長;C.親本株PG45在添加10 nmol·L-1生物素的培養(yǎng)基中可正常生長,而PG45ΔMbBioY在添加10 nmol·L-1生物素的培養(yǎng)基中無法生長;D.親本株PG45在添加100 nmol·L-1生物素的培養(yǎng)基中可正常生長,而PG45ΔMbBioY在添加100 nmol·L-1生物素的培養(yǎng)基中可以緩慢生長;E.親本株PG45和PG45ΔMbBioY在添加1 μmol·L-1生物素的培養(yǎng)基中均可正常生長 A. Neither PG45 nor PG45ΔMbBioY could grow in the absence of biotin; B. The parent strain PG45 could grow normally, but PG45ΔMbBioY could not grow when 1 nmol·L-1 biotin was added to the medium;C. When 10 nmol·L-1 biotin was added to the medium, the parent strain PG45 could grow normally, but PG45ΔMbBioY could not grow; D. When 100 nmol·L-1 Biotin was added to the medium, PG45 could grow normally, but PG45ΔMbBioY grew slowly; E. Both parental strains PG45 and PG45ΔMbBioYgrew normally when 1 μmol·L-1 biotin was added to the medium圖1 PG45ΔMbBioY與PG45親本株生物素敏感性檢測Fig.1 Biotin sensitivity test of PG45ΔMbBioY and PG45 parental strain

當培養(yǎng)基不添加生物素時,MG1655(ΔbioC、ΔbioH、ΔbioHΔyigM)的缺失株均無法生長;當培養(yǎng)基添加4 nmol·L-1生物素時,異源基因敲入生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌MG1655(pBAD-MbBioY)、MG1655ΔbioHΔyigM無法生長,MG1655ΔbioC+pBAD-MbBioY、MG1655ΔbioHΔyigM+pBAD-MbBioY的缺失回補株可正常生長,表明MbBioY單獨存在時,就能夠恢復生物素代謝營養(yǎng)缺陷大腸桿菌缺失株的生理功能 MG1655 without adding biotin (ΔbioC, ΔbioH, ΔbioHΔyigM) were unable to grow; When adding 4 nmol·L-1 biotin, heterologous genes knock into biotin metabolically deficient E. coli MG1655 (pBAD-MbBioY), MG1655ΔbioH ΔyigM cannot grow, MG1655 ΔbioC+pBAD-MbBioY, MG1655 Δ bioH ΔyigM+pBAD-MbBioY can grow normally, indicating that MbBioYalone can restore the physiological function of the deficient strain of Escherichia coli with biotin metabolism and nutrition deficiency圖3 MbBioY功能性克隆驗證Fig.3 MbBioY functional clone verification

4 結 論

通過MbBioY在大腸桿菌生物素代謝合成障礙缺失株中的異源表達,初步證明,MbBioY編碼的是能量偶合因子(ECF)轉運蛋白的S成分,具有攝取外源生物素的能力,揭示了一種潛在的ECF轉運蛋白運輸新機制。這些結果將有助于完善細菌生物素代謝調控的復雜網絡,對M.bovis防控提供獨特視角。