張 穎,袁莉剛,陳國娟,張 芳,楊大鵬

(甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院,蘭州 730070)

內皮素-1(endothelin-1, ET-1)是從豬主動脈內皮細胞培養(yǎng)液中提取并命名,是血管收縮作用最強的內源性肽類物質,具有廣泛的生物學效應[1];ET-1主要通過引起血管平滑肌細胞增殖,使得血管結構和功能改變,從而刺激血管收縮[2]。睪丸具有產生精子和分泌雄激素的功能[3],睪丸支持細胞產生ET-1后,通過旁分泌方式作用于間質細胞,促進睪酮分泌,并可介導睪丸管周肌樣細胞(testicular peritubular myoid cells, TPMC)周期性收縮,促進精子運輸,維持精子細胞活力及性功能[4-5]。正常情況下,機體內ET-1和NO處于動態(tài)平衡狀態(tài)有利于維持血管的正常舒縮功能;當ET-1表達上調時,NOS-NO cGMP也上調以完全或不完全克服ET-1的血管收縮作用[6]。一氧化氮合酶(NOS)是合成NO的關鍵酶,由于NO活性高且半衰期短,因此關于NO的研究都集中在NOS;NOS有神經元NOS (nNOS)、內皮NOS (Endothelial nitric oxide synthase, eNOS) 和誘導型NOS (iNOS)。生理條件下eNOS產生的少量NO,有助于維持生物體正常的生理功能,包括調控血管緊張度、維持血壓及促進血管平滑肌細胞的增殖和抑制血栓形成等[7-8]。研究表明,eNOS作為鈣依賴性一氧化氮合酶在哺乳動物組織中廣泛表達,鼠睪丸局部注射NOS抑制劑可導致eNOS合成降低,血管收縮,血流減少,影響生殖功能[9]。

牦牛為世代生活在青藏高原高寒、低氧極端生境的大型哺乳動物[10-11],經過長期的自然選擇和自身適應,形成了能夠適應高海拔、低氣壓和缺氧環(huán)境的代償性機能,獲得了適應高原高寒低氧穩(wěn)定遺傳學特征。ET-1在動物血管生成和低氧適應中發(fā)揮著重要作用,其可能通過局部激素調節(jié),影響動物睪丸的微循環(huán)[12]。當 ET-1 水平過高會引起氧化應激反應,抑制睪酮合成及性功能;當ET-1水平不足會導致睪丸管周肌樣細胞及生精細胞功能減退,影響生殖功能[4]。低氧會刺激機體產生更多的eNOS和NO,調節(jié)血壓和氧含量[13-14],當睪丸中生成高濃度NO時,則會抑制間質細胞分泌睪酮,影響精子形成,從而使雄性動物生育能力降低[15]。

隱睪癥是陰囊內沒有睪丸或僅一側有睪丸,有單雙側、生理性和病理性之分[16]。雙側或單側隱睪時,導致睪丸處于非正常狀態(tài)(如:高溫、缺血、缺氧等),對生精功能產生不良影響[17]。ETs-NOS 的上調或失衡與缺氧誘導的損傷有關,在缺氧情況下,eNOS可在短期內產生對組織缺氧信號轉導很重要的 NO[18],NO 被超氧化物消耗后形成高反應性的氧化物,從而損傷血管內皮并損害其功能[8]。本研究通過H.E染色、Masson’s三色染色、免疫組織化學染色、雙重免疫熒光染色、實時熒光定量PCR等技術分析牦牛睪丸組織中ET-1及eNOS的分布特點,旨在探究ET-1及eNOS在牦牛睪丸中的功能,為正常睪丸生理特征理解和隱睪癥治療靶點探索提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 樣品采自青海省西寧市大通回族自治縣青海鑫興源屠宰場,選取健康和病理性成年(4歲)雄性牦牛,采用睪丸摘除手術收集樣本(共20對),分為3組:正常組(10對)、單側下降組(單側隱睪下降至陰囊的睪丸,6對)及隱睪組(位于腹股溝部的單側隱睪及雙側隱睪,4對),用4%的多聚甲醛溶液固定形態(tài)學組織樣本,制作睪丸實質組織切片。

1.1.2 主要藥品試劑及儀器 Masson’s(S0071,臺山市化工有限公司),蘇木精-伊紅、ET-1抗體(bs-0954R,北京博奧森生物技術有限公司),eNOS抗體(AF0096,江蘇親科生物研究中心有限公司),免疫組化試劑盒(SP-0023,北京博奧森生物技術有限公司),DAB顯色試劑盒(ZLI-9018,北京中杉金橋生物技術有限公司),熒光素Alexa Fluor 488標記鏈霉親和素(ab150077)及Alexa Fluor 647標記鏈霉親和素(ab150079),DAPI染色液(D-9106);抗熒光淬滅封片液(C02-04003)。

Epon 812包埋機,NIKON ECLIPSE 80i顯微攝像系統(tǒng),LKB 8800型超薄切片機。

1.2 試驗方法

1.2.1 組織學樣本制備 正常睪丸及隱睪樣品在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定,流水沖洗24 h,放入50%軟化液軟化48 h后梯度酒精脫水,石蠟包埋后制作切片(片厚4 μm),用于蘇木素-伊紅(H.E)常規(guī)染色、Masson’s三色染色、Gomori’s染色、ET-1及eNOS免疫組織化學染色。

1.2.2 H.E染色 切片經梯度酒精脫蠟,Mayer蘇木精染色后流水返藍,酒精脫水,醇溶伊紅染色10 s,放置于二甲苯內20 min,中性樹膠封片。

1.2.3 Masson’s三色染色 切片常規(guī)脫蠟至水,Bouin液37 ℃溫箱煤染2 h,流水沖洗,天青石藍染色3 min,Mayer蘇木精染色4 min,鹽酸乙醇分化液分化后麗春紅-品紅染色15 min,磷鉬酸處理10 min直接滴入苯胺藍染色液5 min,弱酸處理3 min,梯度酒精脫水,中性樹膠封片。

1.2.4 Gomori’s染色 切片常規(guī)脫蠟至水,高錳酸鉀氧化5 min,草酸漂白2 min,硫酸鐵銨煤染5 min,Gordon-Sweets銀氨3 min,核固紅染色液復染15 min,梯度酒精脫水,封片。

1.2.5 免疫組織化學染色 切片常規(guī)脫蠟;高壓法進行抗原修復,冷卻至室溫,PBS振洗;滴加3% H2O2,37 ℃孵育15 min;滴加山羊血清白蛋白,孵育15 min;滴加ET-1和eNOS 抗體(稀釋度均為1∶300),37 ℃孵育2 h,PBS振洗;依次滴加試劑B(二抗)、試劑C(辣根酶標記鏈霉卵白素工作液)、DAB顯色液顯色,常規(guī)脫水透明、封片。陰性對照用PBS代替一抗染色。

1.2.6 雙重免疫熒光染色 切片常規(guī)脫蠟,操作步驟均與免疫組織化學相同,將試劑B替換為熒光素Alexa Fluor 488標記鏈霉親和素(稀釋度1∶800)孵育40 min,PBS振洗3次,每次5 min;熒光素Alexa Fluor 647標記鏈霉親和素(稀釋度1∶800)孵育40 min;DAPI染色液孵育10 min后PBS振洗,封片,觀察拍照。

1.2.7 實時熒光定量PCR 通過GenBank查找牛源ET-1序列、eNOS序列及β-actin序列,使用Primer 5.0進行引物設計(引物序列見表1),蘭州天啟基因生物有限公司合成。以反轉錄的cDNA作為模板進行RT-PCR檢測,qPCR反應總體系為20 μL,其中模板1 μL,2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 7 μL。每個樣品3個重復。擴增條件:94 ℃預變性30 s;94 ℃變性5 s,60 ℃退火延伸30 s,循環(huán)40次。根據(jù)Ct值采用2-ΔΔCt分析mRNA的相對表達量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

在NIKON ECLPISE 80i顯微攝像系統(tǒng)中對切片進行拍照,每張切片中隨機選取6個不重復視野(400×),用Image J軟件統(tǒng)計免疫組織化學平均光密度值以及計算間質面積/管腔面積比值等進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析,多組比較使用單因素方差分析(one-way ANOVA),使用Tukey’s HSD (honestly significant difference) 法進行多重比較檢驗。以P<0.05 表示具有統(tǒng)計學差異。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

表1 引物信息Table 1 Primers information

2 結 果

2.1 牦牛正常組、單側下降組及隱睪組睪丸的大體形態(tài)與組織結構特點

牦牛睪丸呈長卵圓形且表面光滑,血管豐富,附睪附著于睪丸表面,單側下降組睪丸略小,質地柔軟,表面血管不如正常組清晰,隱睪組顯著變小,質地堅實,彈性下降(圖1)。H.E染色顯示,正常組基膜平整,生精小管發(fā)育良好,血管分布于相鄰生精小管間質區(qū)域內,間質細胞數(shù)量多且細胞較大,胞質豐富,核呈圓形或卵圓形居中,核仁明顯。生精細胞自基膜向管腔面有序排列為4～7層不等,呈長梭形狀管周肌樣細胞分布于生精小管固有膜外周(圖2a-A)。單側下降組生精小管發(fā)育不良,生精上皮細胞排列3～4層,生精細胞數(shù)量較少且部分脫落于管腔之中,精原細胞有序分布,初級精母細胞散在分布,管腔內可見精子(圖2a-B)。相較于正常組,生精小管的平均直徑減小(表2),隱睪組基膜增厚內陷,管腔面積減小,生精小管皺縮,生精細胞缺失。間質疏松,間質細胞減少,組織結構不清晰(圖2a-C)。

圖1 睪丸樣本圖片F(xiàn)ig.1 Images of testicular samples

2.2 牦牛正常組、單側下降組及隱睪組睪丸結締組織膠原纖維和網狀纖維分布特點

Masson’s三色染色結果顯示,正常組間質內富含膠原纖維、血管(圖2a-D);單側下降組間質緊密,膠原纖維與血管豐富,間質面積與管腔面積之比略高于正常組,無顯著差異(P>0.05,圖2a-E,表2),隱睪組間質膠原纖維增生,血管減少且管壁皺縮(圖2a-F)。Gomori’s染色正常組與單側下降組網狀纖維豐富(圖2a-G,圖2a-H,表2),隱睪組間質組織和生精小管固有膜外周的網狀纖維分布明顯多于其他兩組(圖2a-I,表2)。

2.3 ET-1和eNOS免疫組織化學分布特征及檢測結果對比分析

ET-1在正常組表達于各級生精細胞,強表達于間質細胞 (圖2a-J);單側下降組生精上皮表達明顯,間質細胞強表達(圖2a-K);隱睪組上皮未見明顯表達,主要表達于間質細胞(圖2a-L)。eNOS正常組中表達于生精小管和間質細胞(圖2a-M);單側下降組中,eNOS強表達于間質細胞(圖2a-N);隱睪組中,eNOS在生精小管中未見明顯表達,弱表達于間質細胞(圖2a-O)。

免疫組織化學光密度統(tǒng)計表明,ET-1在正常組與單側下降組差異顯著(P<0.05),單側下降組和隱睪組無明顯差異(P>0.05),正常組與隱睪組差異極顯著(P<0.01,圖2b);與正常組相比較,eNOS在單側下降組極顯著升高(P<0.001),隱睪組差異顯著(P<0.05,圖2c)。

(圖2續(xù) Continued)

2.4 雙重免疫熒光染色及光密度分析

綠色熒光標記eNOS, 紅色熒光標記ET-1。ET-1在正常組上皮表達明顯,主要在間質細胞中呈強陽性表達,ET-1在單側下降組及隱睪組間質細胞中呈強陽性表達(圖3a)。免疫熒光化學光密度分析結果表明(圖3b,c),相較于正常組,ET-1在單側下降組和隱睪組下降,存在極顯著差異(P<0.001),eNOS在單側下降組較正常組極顯著升高(P<0.001);在隱睪組較正常組顯著升高(P<0.05)。

2.5 實時熒光定量PCR結果分析

ET-1和eNOS在睪丸和隱睪中均有表達,ET-1在正常組中的相對表達量顯著高于單側下降組及隱睪組(P<0.01,圖 2d),在單側下降組中eNOS的相對表達量比正常組顯著升高(P<0.05,圖2e)。

3 討 論

睪丸是雄性哺乳動物的重要生殖器官,具有產生精子和性激素的作用,并激發(fā)和維持雄性性征。睪丸組織結構發(fā)生改變與其功能異常密切相關,隱睪時睪丸在腹腔中處于非正常狀態(tài)(如高溫、缺血等),出現(xiàn)睪丸纖維化、生精細胞凋亡等情況,會引起睪丸鈣化等病理性改變[17];研究顯示,牛睪丸間質結締組織增加會影響精子質量[18-20]。前期研究表明,牦牛隱睪組織有纖維化趨勢,實質出現(xiàn)鈣化現(xiàn)象,生精小管基膜變厚,血管減少,提示細胞間物質交換能力受阻,組織局部嚴重缺氧、缺血,最終導致營養(yǎng)不良性鈣化[21-22]。本試驗中,與正常組相比較,單側下降組生精上皮細胞層數(shù)少且發(fā)育不全、排列紊亂,生精小管直徑減小,間質面積與管腔面積的比值極顯著增大;與正常組相比較,隱睪組的平均間質面積明顯增多,膠原和網狀纖維含量增加。朱保平等[23-24]的研究表明,單側隱睪會引起對側睪丸的生精損害。本試驗中,與正常組相比較,單側下降組生精細胞減少且部分脫落于管腔之中,間質結締組織及血管的發(fā)育不良,提示在牦牛單側下降的睪丸中精子生成受到影響;隱睪組則基膜增厚內陷,生精小管皺縮,間質細胞減少,生精小管數(shù)量及管徑的相應變化,間質細胞的局部分泌調節(jié)受到影響,最終導致精子發(fā)生阻滯。

表2 牦牛正常組、單側下降組與隱睪組生精小管特征指數(shù)比較Table 2 The comparison results of the seminiferous tubule characteristic indexes in normal testicles, unilateral descent testicles and cryptorchidism groups of yak

a.正常組、單側下降組和隱睪組睪丸組織中的雙重免疫熒光染色:A-C. ET-1標記的睪丸間質細胞,呈紅色陽性亮點;D-F. eNOS標記的睪丸間質細胞,呈綠色陽性亮點;J-L. 熒光雙標合成圖。Ley. 間質細胞;CV. 微血管。b.正常組、單側下降組和隱睪組睪丸組織中的ET-1平均熒光強度統(tǒng)計。c.正常組、單側下降組和隱睪組睪丸組織中的eNOS平均熒光強度統(tǒng)計 a.Immunofluorescence double staining in normal testicles, unilateral descent testicles and cryptorchidism tissue:A-C.The testis leydig cell labeled with ET-1 showed a red positive bright spot; D-F. The testis leydig cell labeled with eNOS showed a green positive bright spot; J-L. Double-labeled synthetic diagram. Ley. Leydig cell;CV.Capillary vascular. b.The statistical results of the average fluorescence intensity of ET-1 in normal testicles, unilateral descent testicles, cryptorchidism of yak. c.The statistical results of the average fluorescence intensity of eNOS in normal testicles, unilateral descent testicles, cryptorchidism of yak圖3 睪丸組織的雙重免疫熒光染色和平均熒光強度統(tǒng)計Fig.3 Double immunofluorescence staining and average fluorescence intensity statistics of testicular tissue

牦牛睪丸內有大量動靜脈枝,為睪丸提供豐富的血液供應以及輸送營養(yǎng)物質和激素轉運等,是睪丸發(fā)揮正常生理功能的必要條件。睪丸間質細胞分布于生精小管間的結締組織內,具有合成與分泌睪酮的作用[25-26]。ET-1是目前已知最強的內源性血管收縮因子[1,27]。當睪丸ET-1水平正常時,促進睪酮分泌、管周肌樣細胞的周期性收縮和精子運輸,維持精子活力及正常性功能;當ET-1水平過高,會激發(fā)ROS、NOS等的產生,抑制睪酮合成及性功能,誘發(fā)睪丸功能減退;當ET-1水平不足時,直接導致睪丸管周肌樣細胞及生精細胞功能減退,反饋性抑制下丘腦-垂體-性腺[4]。本試驗中,ET-1在牦牛正常組中生精細胞、間質細胞染色呈強陽性表達;與文獻在其他動物中的研究相一致,分析其在睪酮分泌時發(fā)揮作用;在單側下降組中表達于生精細胞、間質細胞,但是ET-1表達量顯著低于正常組,提示睪酮的合成與分泌減少,引起雄激素水平降低,影響精子形成以及睪丸的發(fā)育;隱睪組僅表達于間質細胞,但與單側下降組表達量無明顯差異,因隱睪組織發(fā)育不良,推測ET-1表達量減少主要由間質細胞數(shù)量及血管明顯減少引起。

研究表明,eNOS介導間質細胞因NO引起的睪丸損傷修復或補償機制[28]。eNOS定位于人睪丸精母細胞、支持細胞和間質細胞的細胞膜[29];正常人精子頭部和體部存在eNOS有利于催化合成生理水平的NO,進而對維持精子活動起著重要作用[30]。本研究中,eNOS主要定位于正常組精原細胞、間質細胞和支持細胞,提示eNOS參與正常睪丸生精上皮、精子細胞的發(fā)育。低氧會刺激機體產生更多的eNOS和NO以調節(jié)血壓和氧含量,而當睪丸中生成高濃度NO時,則會抑制間質細胞分泌睪酮,影響精子的生成[31]。研究表明,eNOS基因在生精上皮表達增強與隱睪生精細胞凋亡有密切關系[32-33]。本研究中,eNOS在成年牦牛單側下降組及隱睪組生精上皮表達較弱與精子生成密切相關,隱睪組間質細胞eNOS弱表達與NO產生及氧含量調節(jié)的關系值得進一步研究。研究表明,大鼠單側下降睪丸的生精功能受到抑制,且抗氧化能力下降[23]。研究發(fā)現(xiàn),小鼠單側下降睪丸存在雄激素代償性生理作用[34];早期研究表明,牦牛隱睪VEGF及其受體可能通過拮抗雙側睪丸生精抑制作用,維持單側下降睪丸的生精功能[21]。本研究中,eNOS在單側下降組表達強度高于正常組和隱睪組,可能引起單側下降睪丸中NO 含量升高,血管舒張,以調節(jié)低氧引起的精子生成減少,對維持生殖機能有重要意義。

機體內 ET-1 和 NO 處于動態(tài)平衡有利于維持血管的正常收縮和舒張功能,對維持內皮功能和血管重塑十分重要[35-37]。ET-1具有血管收縮作用,ET-1的過度增加可損傷內皮細胞[18]。eNOS通過催化氧化L-精氨酸生成的NO具有舒張血管的作用[38]。ET-1在成年大鼠睪丸中主要定位于間質細胞,對間質細胞的分泌有促進作用[39]。eNOS在成人睪丸精子發(fā)生的各個階段都定位于間質細胞,提示eNOS會通過調節(jié)間質細胞促進或抑制睪酮分泌[31,40]。本研究中,雙重免疫熒光染色結果及光密度分析顯示,ET-1和 eNOS 共定位于牦牛正常睪丸間質細胞及周圍間質,提示在正常組中ET-1 和 eNOS共同作用,且間質細胞可能調節(jié)ET-1與eNOS的動態(tài)平衡;在單側下降組間質細胞ET-1和eNOS的表達失衡,ET-1顯著降低,eNOS顯著升高,應主要與調節(jié)高原低氧環(huán)境中睪丸血管舒張,雄激素代償性生理作用密切相關。在隱睪組間質細胞ET-1和eNOS的表達失衡,ET-1顯著降低,eNOS顯著升高,結合成年隱睪組織損傷嚴重,應是間質細胞及血管分布異常引起。

4 結 論

高原低氧環(huán)境下,牦牛隱睪基膜增厚內陷,生精小管皺縮,生精細胞缺失,間質細胞減少,局部分泌調節(jié)受到抑制,最終導致精子發(fā)生阻滯。ET-1和eNOS共同作用于間質細胞,參與維持低氧環(huán)境中牦牛睪丸微循環(huán)穩(wěn)態(tài),在單側下降組和隱睪組間質細胞中表達失衡,ET-1顯著降低,eNOS顯著升高,結合成年隱睪組織損傷嚴重,應是間質細胞及血管分布異常引起。