段香茹,康 佳,楊若晨,單新雨,李太春,趙 雯,張英杰,劉月琴

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,保定 071000)

雌性動(dòng)物卵巢卵泡的發(fā)育及排卵與生殖性能密切相關(guān)[1]。顆粒細(xì)胞(GCs)在卵泡的募集、選擇、排卵和閉鎖中起著至關(guān)重要的作用[2]。GCs分泌的雌激素(E2)促進(jìn)卵母細(xì)胞和卵泡的發(fā)育[3-4]。研究表明,反芻動(dòng)物卵巢卵泡發(fā)育是一個(gè)高度協(xié)調(diào)和營(yíng)養(yǎng)敏感的過(guò)程[5],其中氨基酸攝入是影響卵泡發(fā)育和決定排卵率的一個(gè)關(guān)鍵因素[6]。Han等[7-8]發(fā)現(xiàn),L-半胱氨酸可以促進(jìn)MG-63和MCF-7細(xì)胞增殖以及各自的雌激素反應(yīng)元件(ERE)活性。

L-Cys作為一種非必需氨基酸,除了合成蛋白質(zhì)外,L-Cys可作為谷胱甘肽的前體,是一種重要的抗氧化劑[9]。許多研究證實(shí),通過(guò)飲食、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑或藥物使用L-Cys,可以提高雌性動(dòng)物的生殖性能[10-11]。前人研究表明,添加100 μmol·L-1的L-Cys衍生物N-乙酰-半胱氨酸可促進(jìn)綿羊卵巢GCs增殖[12]。但關(guān)于L-Cys通過(guò)調(diào)控卵巢GCs的增殖和凋亡從而影響動(dòng)物繁殖性能的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本試驗(yàn)通過(guò)研究不同濃度L-Cys對(duì)綿羊GCs增殖、凋亡的影響,為L(zhǎng)-Cys對(duì)綿羊卵泡發(fā)育及排卵的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù),同時(shí)也為營(yíng)養(yǎng)調(diào)控繁殖提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采集卵巢

于河北省唐縣瑞麗屠宰場(chǎng)采集新鮮的母羊卵巢(年齡為1歲齡的小尾寒羊),用生理鹽水沖洗干凈后立即放入含1%雙抗的37 ℃緩沖鹽水溶液中,在4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用預(yù)熱的37 ℃,75%酒精和生理鹽水各沖洗卵巢3次。用無(wú)菌刀片劃破表面直徑為2～8 mm的卵泡,獲取卵泡液,將卵泡懸浮液在1 500×g離心10 min后立即收集顆粒細(xì)胞。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù),將GCs以2×105個(gè)·孔-1的密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,添加5 mL 的10%完全培養(yǎng)基在37 ℃和5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,每24 h更換1次培養(yǎng)基。

將GCs以3×106個(gè)·孔-1接種于6孔板中,檢測(cè)不同L-Cys濃度對(duì)類(lèi)固醇合成的影響,以及GCs增殖凋亡和類(lèi)固醇生成相關(guān)基因/蛋白的表達(dá)。在每次處理中,將細(xì)胞分為5個(gè)不同濃度的L-Cys處理組,每組3個(gè)重復(fù)。GCs培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清和1%鏈霉素/青霉素混合物,直到細(xì)胞融合率達(dá)到80%,取出培養(yǎng)基。用1×PBS洗滌細(xì)胞,然后在細(xì)胞中分別加入0、100、300、500 和700 μmol·L-1的L-Cys再培養(yǎng)48 h。處理48 h后,收集細(xì)胞上清液和GCs進(jìn)行后續(xù)測(cè)量。

1.2.2 綿羊卵巢GCs鑒定 采用免疫熒光染色法鑒定特異表達(dá)于GCs的FSHR。將GCs按3×105個(gè)·孔-1的密度接種到細(xì)胞6孔板中,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。當(dāng)70%的細(xì)胞貼壁時(shí),用4%多聚甲醛固定15 min。用0.2% Triton浸透10 min,后在室溫下用2%牛血清白蛋白(BSA)阻斷30 min。然后,用兔抗FSHR在4 ℃下孵育過(guò)夜。一抗孵育,再與小鼠抗兔IgG/Bio抗體37 ℃孵育90 min。然后使用DAPI染液避光孵育10 min。使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。

1.2.3 GCs增殖活力檢測(cè) 采用96孔板,以1×105個(gè)·孔-1的密度接種GCs,分為5組,每組6個(gè)重復(fù),觀察不同濃度L-Cys對(duì)GCs增殖的影響。藥物添加48 h后,并根據(jù)說(shuō)明書(shū)每孔加入 CCK-8 溶液,溫育2.5 h后,測(cè)定450 nm時(shí)各孔液體的吸光度值,并用公式計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.4 GCs凋亡檢測(cè) 將各組細(xì)胞1 500 r·min-1離心10 min,加70%乙醇4 ℃固定過(guò)夜,加500 μL的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻后,加入5 μL Propidium Iodide 固定細(xì)胞進(jìn)行染色,37 ℃避光反應(yīng)10 min,采用BD Accuri C6 流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析,并使用FlowJo 7.6 軟件處理數(shù)據(jù)。

1.2.5 E2及P4檢測(cè) 收集各組細(xì)胞上清液各1 mL于干凈EP管中,使用ELISA(江蘇晶美生物科技有限公司)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中的E2(JLC02368)和P4(JLC10263)濃度。P4試劑盒靈敏度為1.0 ng·mL-1板內(nèi)和板間變異系數(shù)均小于15%,E2試劑盒靈敏度為1.0 pg·mL-1組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別小于10%。

1.2.6 總RNA提取和cDNA合成 使用高純RNA組織試劑盒(北京全式金生物技術(shù)股份有限公司,ER501-01-V2)提取各組細(xì)胞RNA并選取OD260 nm/OD280 nm值在1.8～2.0之間的樣品進(jìn)一步分析。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司,AE311-03)去除基因組DNA,反轉(zhuǎn)錄RNA樣品。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR) 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)序列信息設(shè)計(jì)引物(表 1),以GAPDH為內(nèi)參,采用 RT-qPCR 檢測(cè)L-Cys 對(duì)綿羊GCs中增殖基因PCNA、CCNB1、CCND2,凋亡基因BAX、Caspase-3、Bcl-2 及和類(lèi)固醇激素基因STAR、CYP11A1、CYP19A1、3β-HSDmRNA表達(dá)的影響,采用 2-△△ct方法分析數(shù)據(jù)。

1.2.8 Western blot檢測(cè) 收集各組培養(yǎng)48 h后的GCs,提取總蛋白。測(cè)定蛋白濃度,SDS 變性,將蛋白質(zhì)用 10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行 SDS-PAGE。電泳結(jié)束后,轉(zhuǎn)移分離膠到 NC 膜,300 mA 恒流,轉(zhuǎn)膜時(shí)間以目的蛋白分子大小而定。將膜完全浸沒(méi)T-TBS中室溫輕搖 60 min。用T-BST稀釋一抗,放 4 ℃搖床過(guò)夜,然后T-TBS漂洗4次,每次5 min;二抗室溫孵育60 min,然后T-TBS漂洗5次,每次4 min。放入化學(xué)發(fā)光儀器,充分滴加發(fā)光液曝光后拍照分析灰度值?？贵w信息如表2所示。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0版進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布的連續(xù)變量,以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)”表示。采用單因素方差分析(one way-ANOVA)對(duì)各組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P<0.05表示差異顯著。采用GraphPad prism 8.0軟件制作圖表。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊卵巢GCs的鑒定

為了闡明L-Cys在GCs分化中的潛在作用,對(duì)綿羊GCs的分布和表達(dá)進(jìn)行了鑒定。免疫熒光檢測(cè)卵巢中GCs特異性標(biāo)志物FSHR的表達(dá)(圖1)。紅色熒光標(biāo)記的細(xì)胞為FSHR陽(yáng)性細(xì)胞,藍(lán)色熒光區(qū)域?yàn)镈API染色的細(xì)胞核。Merge提供了綠色熒光標(biāo)記的FSHR和藍(lán)色熒光標(biāo)記的DAPI的覆蓋層,表示GCs的高純度。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences amplifying genes

表2 一抗信息Table 2 Primary antibody information

A.藍(lán)色熒光為被DAPI染色的細(xì)胞核;B.紅色熒光為FSHR蛋白表達(dá)情況;C.FSHR和DAPI重疊圖 A.Blue fluorescence is the nucleus stained by DAPI; B.Red fluorescence is the expression of FSHR protein; C.FSHR and DAPI overlap圖1 綿羊GCs鑒定結(jié)果Fig.1 The results of identification of sheep granulosa cells

2.2 L-Cys對(duì)綿羊GCs增殖的影響

采用 CCK-8 檢測(cè)L-Cys 對(duì)綿羊GCs增殖的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,添加L-Cys 后各組GCs的增殖活力均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。其中,300 μmol·L-1和500 μmol·L-1組間GCs增殖活力差異不顯著(P>0.05),但均顯著高于0 μmol·L-1和700 μmol·L-1組(P<0.05)。

不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05),下同 The different letters indicate the significant difference (P<0.05), the same letter indicate no significant difference (P>0.05), the same as below圖2 不同濃度L-Cys處理48 h后對(duì)綿羊顆粒細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of different concentrations L-Cys on the proliferation of ovine granulosa cells treated for 48 h

2.3 L-Cys對(duì)綿羊GCs凋亡的影響

利用 Annexin V-FITC 檢測(cè)L-Cys 對(duì)綿羊GCs凋亡的影響,結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。圖3A、3B、3C、3D和3E分別為0、100、300、500和700 μmol·L-1組顆粒細(xì)胞凋亡結(jié)果。由圖4可知,100、300和500 μmol·L-1處理組的GCs 48 h后凋亡率顯著低于對(duì)照組(P<0.05),其中100 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率最低;700 μmol·L-1組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 L-Cys 對(duì)綿羊GCs中E2和P4分泌的影響

利用 ELISA 試劑盒檢測(cè)L-Cys 對(duì)綿羊GCs類(lèi)固醇激素分泌的影響。由圖5A可知,P4含量在5個(gè)不同L-Cys 劑量組呈先降低后升高的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,添加100、300和500 μmol·L-1的L-Cys 顯著抑制了GCs中P4的分泌(P<0.05),由圖5B可知,E2含量在5個(gè)不同L-Cys 劑量組呈先升高后下降的趨勢(shì)。其中100 μmol·L-1處理組與對(duì)照組相比有顯著增高趨勢(shì)(0.05

2.5 L-Cys 對(duì)綿羊GCs增殖相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

利用 RT-qPCR 檢測(cè)L-Cys 處理48 h后對(duì)GCs增殖基因及蛋白表達(dá)的影響。由圖6和圖7可知,GCs增殖相關(guān)基因PCNA、CCNB1、CCND2 mRNA及其蛋白表達(dá)在5個(gè)不同L-Cys 劑量組均呈先升高后降低的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,300 μmol·L-1處理組顯著上調(diào)了增殖基因PCNA的表達(dá)(P<0.05),100 μmol·L-1和300 μmol·L-1組顯著上調(diào)增殖基因CCNB1 的表達(dá)(P<0.05),300 μmol·L-1和500 μmol·L-1處理組顯著上調(diào)了增殖基因CCND2 的表達(dá)(P<0.05),并且300 μmol·L-1處理組顯著上調(diào)了增殖蛋白PCNA、CCNB1 和 CCND2 的表達(dá)(P<0.05),與CCK-8細(xì)胞活力結(jié)果相一致。

圖4 不同濃度 L-Cys處理48 h后對(duì)綿羊GCs凋亡的影響Fig.4 Effect of different concentrations of L-Cys on apoptosis of ovine granulosa cells treated for 48 h

2.6 L-Cys 對(duì)綿羊GCs凋亡相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

利用 RT-qPCR 檢測(cè)L-Cys 處理48 h后對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡基因及蛋白表達(dá)的影響。由圖8和圖9可知,與對(duì)照組比,100 μmol·L-1和300 μmol·L-1組的凋亡相關(guān)基因BAX、Caspase-3 mRNA及其蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05);100 μmol·L-1組顯著上升抗凋亡基因Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)(P<0.05);而300 μmol·L-1組僅顯著上升抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)(P<0.05),這與流式凋亡結(jié)果相一致。

2.7 L-Cys 對(duì)綿羊GCs類(lèi)固醇激素相關(guān)基因及蛋白表達(dá)的影響

A. L-Cys對(duì) P4分泌的影響;B. L-Cys對(duì) E2分泌的影響 A. Effect of L-Cys on P4 secretion; B. Effect of L-Cys on E2 secretion圖5 L-Cys對(duì)綿羊GCs分泌類(lèi)固醇激素的影響Fig.5 The effect of L-Cys on the secretion of steroid hormones of ovine granulosa cells

A. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的PCNA mRNA表達(dá)的影響;B. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的CCNB1 mRNA表達(dá)的影響;C. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的CCND2 mRNA表達(dá)的影響 A. Effect of L-Cys on PCNA mRNA expression in sheep GCs; B. Effects of L-Cys on CCNB1 mRNA expression in sheep GCs; C. Effects of L-Cys on CCND2 mRNA expression in sheep GCs圖6 L-Cys 對(duì)綿羊GCs增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of L-Cys on the expression of proliferation-related genes in sheep GCs

利用 RT-qPCR 檢測(cè)L-Cys 處理48 h后對(duì)GCs類(lèi)固醇合成基因表達(dá)的影響。由圖10和圖11可知,類(lèi)固醇生成相關(guān)基因STAR、3β-HSDmRNA及其蛋白表達(dá)在5個(gè)不同L-Cys 劑量組均呈先降低后升高的趨勢(shì),而P4合成基因CYP11A1 和 E2合成基因CYP19A1 mRNA及其蛋白表達(dá)在5個(gè)不同L-Cys 劑量組均呈先升高后降低的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比,100、300和500 μmol·L-1組P4合成基因STAR、3β-HSD的mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05);而100 μmol·L-1組的CYP11A1 的mRNA量及其蛋白顯著上升(P<0.05);100 μmol·L-1和300 μmol·L-1組的CYP19A1的mRNA及其蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

A. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的PCNA表達(dá)的影響;B. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的CCNB1表達(dá)的影響;C. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的CCND2表達(dá)的影響; D. PCNA、CCNB1、CCND2蛋白表達(dá)的 Western blot 結(jié)果 A. The effect of L-Cys on PCNA expression in sheep GCs; B. Effects of L-Cys on CCNB1 expression in sheep GCs; C. Effects of L-Cys on CCND2 expression in sheep GCs; D.Western blot results of PCNA,CCNB1,CCND2 proteins expression圖7 L-Cys 對(duì)綿羊GCs增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of L-Cys on the expression of proliferation-related proteins in sheep GCs

A. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的BAX mRNA表達(dá)的影響;B. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的Bcl-2 mRNA表達(dá)的影響;C. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 A. Effects of L-Cys on BAX mRNA expression in sheep GCs; B. Effects of L-Cys on Bcl-2 mRNA expression in sheep GCs; C. Effects of L-Cys on Caspase-3 mRNA expression in sheep GCs圖8 L-Cys 對(duì)綿羊GCs凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.8 Effects of L-Cys on expression of apoptosis-related genes in sheep GCs

A. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的BAX表達(dá)的影響;B. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的Bcl-2表達(dá)的影響;C. L-Cys 對(duì)綿羊GCs的Caspase-3表達(dá)的影響;D. BAX、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)的 Western blot 結(jié)果 A. The effect of L-Cys on BAX expression in sheep GCs; B. The effect of L-Cys on Bcl-2 expression in sheep GCs; C. Effects of L-Cys on Caspase-3 expression in sheep GCs; D. Western blot results of BAX,Bcl-2,Caspase-3 proteins expression圖9 L-Cys 對(duì)綿羊GCs凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of L-Cys on expresssion of apoptosis-related proteins in sheep GCs

A. L-Cys對(duì)綿羊GCs的STAR mRNA表達(dá)的影響;B. L-Cys對(duì)綿羊GCs的3β-HSD mRNA表達(dá)的影響;C. L-Cys對(duì)綿羊GCs的CYP11A1 mRNA表達(dá)的影響;D. L-Cys對(duì)綿羊GCs的CYP19A1 mRNA表達(dá)的影響 A. Effects of L-Cys on STAR mRNA expression in sheep GCs; B. Effects of L-Cys on 3β-HSD mRNA expression in sheep GCs; C. Effects of L-Cys on CYP11A1 mRNA expression in sheep GCs; D. Effects of L-Cys on CYP19A1 mRNA expression in sheep GCs圖10 L-Cys對(duì)綿羊GCs類(lèi)固醇激素相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.10 Effects of L-Cys on the expression of steroid hormone-related genes in sheep GCs

A. L-Cys對(duì)綿羊GCs的STAR表達(dá)的影響;B. L-Cys對(duì)綿羊GCs的3β-HSD表達(dá)的影響;C. L-Cys對(duì)綿羊GCs的CYP11A1表達(dá)的影響;D. L-Cys對(duì)綿羊GCs的CYP19A1表達(dá)的影響; E. STAR、3β-HSD、CYP11A1、CYP19A1蛋白表達(dá)的 Western blot 結(jié)果 A. The effect of L-Cys on STAR expression in sheep GCs; B. Effects of L-Cys on 3β-HSD expression in sheep GCs; C. The effect of L-Cys on CYP11A1 expression in sheep GCs; D. Effects of L-Cys on CYP19A1 expression in sheep GCs;E. Western blot results of STAR,3β-HSD,CYP11A1,CYP19A1 proteins expression圖11 L-Cys對(duì)綿羊GCs類(lèi)固醇激素相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.11 Effects of L-Cys on the expression of steroid hormone-related proteins in sheep GCs

3 討 論

3.1 L-Cys對(duì)綿羊卵巢GCs增殖和凋亡的影響

卵巢GCs在卵泡的發(fā)育、排卵以及閉鎖過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13],GCs分化、增殖、凋亡以及其與卵母細(xì)胞之間的聯(lián)系還決定著卵母細(xì)胞的正常發(fā)育[14]。研究發(fā)現(xiàn),L-Cys 通過(guò)調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)通路來(lái)提高豬、牛、羊卵母細(xì)胞的增殖能力[15-16]。另外,曾有研究表明,L-Cys 通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)豬腸上皮細(xì)胞死亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn),100、300和500 μmol·L-1組的L-Cys顯著升高綿羊GCs的增殖活力,且凋亡率顯著降低,說(shuō)明適量L-Cys 可促進(jìn)綿羊卵巢GCs增殖,抑制其凋亡,這與Han等[7-8]發(fā)現(xiàn)L-Cys 促進(jìn)MG-63和MCF-7細(xì)胞增殖的研究結(jié)果相似。

PCNA是一種DNA聚合酶重要的輔助蛋白,也是顆粒細(xì)胞DNA合成過(guò)程中促進(jìn)其分裂的一種細(xì)胞內(nèi)抗原。它一般在細(xì)胞增殖周期的S期中表達(dá)量最高,是評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖快慢的一個(gè)重要指標(biāo)[18]。CCNB1 表達(dá)的蛋白cyclin B1主要在G2/M期中表達(dá),并在有絲分裂中起到了重要作用[19]。CCND2 是細(xì)胞周期蛋白D型家族(Cyclin Ds,CCNDs)中的成員,可正向調(diào)控細(xì)胞周期從而促進(jìn)增殖[20]。本試驗(yàn)中,300 μmol·L-1組增殖基因PCNA、CCNB1 mRNA及其蛋白表達(dá)量顯著上升,500 μmol·L-1處理組增殖基因CCND2 表達(dá)量顯著上升,說(shuō)明L-Cys可以通過(guò)調(diào)控PCNA、CCNB1、CCND2 mRNA及其蛋白表達(dá)影響卵巢GCs增殖,這與Wang等[21]發(fā)現(xiàn)L-Cys 可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖結(jié)果相一致。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控途徑之一是線粒體介導(dǎo)的“內(nèi)源性凋亡通路”,卵巢顆粒細(xì)胞是其發(fā)生的主要位置[22]。這個(gè)過(guò)程主要由Bcl-2蛋白家族調(diào)控,其中BAX則具有對(duì)抗Bcl-2的作用,可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡[23]。而卵泡閉鎖與顆粒細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。前人研究發(fā)現(xiàn),N-乙酰-L-半胱氨酸通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和BAX蛋白水平抑制人類(lèi)癌癥細(xì)胞的凋亡[24],這與本研究結(jié)果一致,本試驗(yàn)中100 μmol·L-1和300 μmol·L-1組BAX和Caspase-3的mRNA表達(dá)量顯著下降,100、300和500 μmol·L-1組 BAX、Caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著下降;100 μmol·L-1組Bcl-2 的mRNA表達(dá)量顯著上升,100、300和500 μmol·L-1組 Bcl-2 的蛋白表達(dá)量顯著上升。BAX和Bcl-2 及其蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)相反特征,與之前的研究結(jié)果相符,說(shuō)明100 μmol·L-1和300 μmol·L-1的L-Cys 可以抑制GCs的凋亡。

3.2 L-Cys對(duì)綿羊卵巢GCs中P4 和 E2 分泌及相關(guān)基因表達(dá)的影響

卵巢GCs是雌性動(dòng)物體內(nèi)重要的類(lèi)固醇激素分泌細(xì)胞,可合成 P4、E2和其他一些細(xì)胞因子等,這些類(lèi)固醇激素對(duì)于雌性動(dòng)物的卵泡發(fā)育不可或缺[25]。但是L-Cys 與綿羊卵巢GCs的功能關(guān)系尚不清晰。本研究中,在GCs培養(yǎng)液中分別添加不同濃度的L-Cys 處理48 h,發(fā)現(xiàn)P4含量呈先降低后升高的趨勢(shì),并且添加100、300和500 μmol·L-1的L-Cys 顯著抑制了GCs中P4的分泌,這與Ogunlade等[26]發(fā)現(xiàn)D-核糖-L-半胱氨酸(DRLC)在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中可以降低 P4含量的結(jié)果一致。而 E2含量則是呈先升高后下降的趨勢(shì)。其中100 μmol·L-1的L-Cys 促進(jìn)其分泌,但無(wú)顯著性差異。這與Han等[8]發(fā)現(xiàn)L-Cys 可以促進(jìn)MG-63和MCF-7細(xì)胞的ERβ信使RNA(mRNA)表達(dá)和E2反應(yīng)元件(ERE)活性的結(jié)果相似。

類(lèi)固醇激素合成第一步是膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn),其中將膽固醇原料從線粒體外轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體內(nèi)膜是由類(lèi)固醇生成快速調(diào)節(jié)蛋白 STAR(由STAR基因編碼)負(fù)責(zé),這一步是重要的限速反應(yīng)[27]。有研究表明,在兔、牛和綿羊的黃體內(nèi)STARmRNA與其蛋白的合成是不可分割的,同時(shí)STAR在該組織內(nèi)表達(dá)量與 P4的合成呈正相關(guān)[28-29]。而CYP11A1 基因編碼的細(xì)胞色素P450酶可以使膽固醇變?yōu)樵邢┐纪猍30],孕烯醇酮在 3β-HSD的催化下轉(zhuǎn)化為有活性的 P4和雄烯二酮[31],雄烯二酮在CYP19A1 基因編碼的細(xì)胞色素芳香化酶的催化下變成E2[32]。前人研究表明,抗氧化物通過(guò)改變牛卵巢中STAR、3β-HSD和CYP19A1 基因的表達(dá)量來(lái)調(diào)控 P4和 E2變化[33-34]。這與本研究結(jié)果一致,本研究中,添加100 μmol·L-1和300 μmol·L-1的L-Cys 顯著抑制了基因STAR、3β-HSDmRNA及其蛋白表達(dá),添加100 μmol·L-1的L-Cys 顯著促進(jìn)了基因CYP11A1 和CYP19A1 的mRNA表達(dá),添加300 μmol·L-1的L-Cys 顯著促進(jìn)了 CYP11A1 和 CYP19A1 蛋白的表達(dá)。說(shuō)明L-Cys 通過(guò)抑制 P4合成酶編碼基因STAR、3β-HSDmRNA及其蛋白表達(dá)和促進(jìn) P4合成的限速酶基因CYP11A1 mRNA及其蛋白表達(dá)來(lái)抑制綿羊卵巢GCs中P4的分泌;但本試驗(yàn)中,L-Cys顯著促進(jìn)E2合成酶編碼基因CYP19A1 mRNA及其蛋白表達(dá)使 E2的分泌呈上升趨勢(shì)但未達(dá)顯著水平,這可能與物種差異有關(guān)。

4 結(jié) 論

4.1 L-Cys 通過(guò)上調(diào)基因PCNA、CCNB1、CCND2、Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)、下調(diào)基因BAX、Caspase-3 mRNA及其蛋白表達(dá),促進(jìn)綿羊GCs增殖,抑制其凋亡。

4.2 L-Cys通過(guò)下調(diào)基因STAR、3β-HSDmRNA及其蛋白表達(dá)以及上調(diào)基因CYP11A1 mRNA及其蛋白表達(dá)抑制P4的分泌。