祝雪麗,張龍超,王立賢,蒲 蕾,劉 欣*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193;2.天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,天津 300384; 3.天津市綠色生態(tài)飼料重點實驗室,天津 301800)

生豬養(yǎng)殖在我國畜牧業(yè)中占有較大的比重,僅2021年年底全國生豬出欄量已達(dá)4億多頭[1]。過去幾十年來,為了提高生產(chǎn)效率,豬的選擇主要集中在胴體瘦肉率和生長性狀上[2]。近年來,多以體脂、肌內(nèi)脂肪作為豬肉品質(zhì)的研究對象[3]。然而豬生長速度提高的同時,卻降低了豬的肉質(zhì)性狀,導(dǎo)致適口性差,缺少風(fēng)味,降低了消費者的滿意度。肌內(nèi)脂肪(IMF)與皮下脂肪(BF)是家畜的兩個主要脂肪庫[4],同時多項研究表明,食肉最佳的肌內(nèi)脂肪含量為2%～3.5%[5]。因此,如何在穩(wěn)定皮下脂肪含量、提高瘦肉率的情況下,提高肌內(nèi)脂肪含量,是當(dāng)今豬業(yè)生產(chǎn)中需要解決的問題。

本研究所關(guān)注的水通道蛋白,目前已在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)13種(AQP0～AQP12),按功能可以分為傳統(tǒng)的水通道蛋白[6]和甘油水通道蛋白(可以通透中性溶質(zhì)如甘油、其他小的非離子物質(zhì)和水)[7]。水通道蛋白9(aquaporin9,AQP9)屬于甘油水通道蛋白一類,于1998年首次在人類白細(xì)胞和大鼠肝臟中被發(fā)現(xiàn)[8],較其他水通道蛋白更易通透水、甘油等小分子溶質(zhì)[9]。另在小鼠研究中發(fā)現(xiàn)AQP9主要在肝臟中表達(dá),參與甘油轉(zhuǎn)運,是血漿甘油轉(zhuǎn)運的主要通道[10]。AQP9促進(jìn)肝臟的甘油攝取并代謝為脂肪合成中間產(chǎn)物3-磷酸甘油,將脂解產(chǎn)生的甘油運輸進(jìn)肝臟,將肝臟中3-磷酸甘油運輸進(jìn)血漿參與脂肪合成,有效的將脂解與脂肪合成通過甘油連接起來[11]。同時,甘油在血漿與肝臟間轉(zhuǎn)運的增強,也促使機體內(nèi)AQP9表達(dá)量的增加[12]。另有研究表明,AQP9是氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的靶基因,PPARα、PPARγ作為典型的成脂相關(guān)基因,其表達(dá)量均影響AQP9的表達(dá)[13]。綜上,可以推斷AQP9可能是影響動物脂肪沉積的潛在基因。

核糖體蛋白(ribosomal protein, RP)是真核生物核糖體的重要組成成分,參與蛋白質(zhì)的合成[14],是核糖體小亞基的組成蛋白,屬于核糖體蛋白家族成員[15]。RPS10的甲基化對核糖體的蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖過程的調(diào)節(jié)具有重要作用[16]。有諸多研究報道了RPS10與豬的生產(chǎn)性狀相關(guān),在對中國東鄉(xiāng)斑點豬的兩個外部性狀(斑點毛色和面部類型)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)中也發(fā)現(xiàn)RPS10是影響面部變異的潛在基因[17]。Lü等[18-19]在研究中指出,RPS10可能與豬的骨骼生長及體型有關(guān)。將恩施黑豬的基因組庫與中國野豬的全基因組結(jié)合,鑒定了嵌入到恩施黑豬基因組中的400多個蛋白質(zhì)編碼基因,并將包括RPS10在內(nèi)的5個基因列為與豬肉脂肪沉積相關(guān)的候選基因[20]。因此,可以推測RPS10對豬的脂肪沉積有影響。

本研究所采用的北京黑豬是我國著名的培育品種,由通縣豬等本地豬與大白豬雜交形成[21],其肌內(nèi)脂肪含量可達(dá)到3%,肉質(zhì)優(yōu)良,風(fēng)味獨特深受消費者歡迎[22]。然而北京黑豬因含地方豬血統(tǒng),背膘較厚,因此需對其背膘厚開展研究。在本課題組的前期研究中,通過對背膘厚極端差異組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,確定了AQP9基因為脂肪沉積相關(guān)的候選基因[23]。對大白、民豬雜交群體6～7肋間背膘厚進(jìn)行GWAS,注釋到SSC7上多個SNPs,并在連鎖不平衡(LD)區(qū)間發(fā)現(xiàn)了RPS10基因[24]。上述兩基因雖已被確定為影響背膘厚度的候選基因,但其在北京黑豬的多態(tài)性及與背膘厚的相關(guān)性尚不清楚。本研究通過對AQP9和RPS10基因進(jìn)行突變位點檢測,并開展基因型與背膘厚度性狀的關(guān)聯(lián)分析,以期篩選到影響北京黑豬背膘厚的候選功能位點,為今后北京黑豬背膘厚度性狀的分子選育提供標(biāo)記,并為背膘厚的遺傳機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織樣本及表型數(shù)據(jù)收集

本研究所用413頭北京黑豬均來自北京黑六牧業(yè)科技有限公司,屠宰后使用游標(biāo)卡尺測量試驗豬右側(cè)胴體背部脂肪不同位置(肩部、6～7肋間、胸腰結(jié)合處、腰薦結(jié)合處)的背膘厚度,從左側(cè)胴體采集背部脂肪樣品于液氮速凍后,-80 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取

使用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kti)從組織樣本中提取基因組DNA,利用超微分光光度計(IMPLEN)檢測DNA濃度,并用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA質(zhì)量評估,檢測合格的DNA樣品存放于-20 ℃冰箱中。

1.3 RNA提取

對組織樣品進(jìn)行研磨,并使用RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)進(jìn)行RNA提取,隨后通過超微分光光度計(IMPLEN)檢測其濃度及質(zhì)量。對于合格的RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反轉(zhuǎn)好的cDNA樣品置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計及合成

利用美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI,http://www.ncbi.nim.nih/)的基因序列對AQP9(Gene ID: 100127153)和RPS10(Gene ID: 100155444)的啟動子及外顯子區(qū)域共設(shè)計22對引物,部分引物見表1,設(shè)計好的引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及基因分型

對413頭北京黑豬進(jìn)行PCR擴增,反應(yīng)體系:(2×Phanta Max Buffer 12.5 μL,DNA 1 μL,dNTP 0.5 μL,上、下引物各1 μL,聚合酶 0.5 μL,RNase-free水 8.5 μL)。PCR反應(yīng)程序如下:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,57～62 ℃退火30 s,72 ℃延伸30～90 s,35個循環(huán);72 ℃延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后,由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行Sanger測序。

1.6 AQP9和RPS10基因表達(dá)量的檢測

利用NCBI(http://www.ncbi.nim.nih/)的基因序列對AQP9和RPS10基因設(shè)計熒光定量PCR引物,引物見表2,設(shè)計好的引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

以GAPDH基因為內(nèi)參,反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,開展實時熒光定量PCR,檢測AQP9、RPS10基因的表達(dá)。采用20 μL反應(yīng)體系:10 μL TB Green,0.4 μL PCR Forward Primer,0.4 μL PCR Reverse Primer,0.4 μL ROX Reference Dye П,2 μL模板,6.8 μL 無菌水。RT-qPCR反應(yīng)條件為:預(yù)變性階段(95 ℃ 30 s);擴增階段(95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40循環(huán));建立熔解曲線階段(60～95 ℃,每10 s緩慢升溫0.5 ℃)。

表1 PCR引物信息Table 1 PCR primers information

表2 RT-qPCR引物信息Table 2 RT-qPCR primers information

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2016對基因型頻率和各位點的等位基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計。分別計算各突變位點的多態(tài)信息含量、雜合度及哈代-溫伯格平衡檢驗。使用SAS9.4軟件進(jìn)行不同基因型個體間背膘厚的差異顯著性分析(P<0.05),采用混合線性模型,加入體重作為協(xié)變量,利用協(xié)方差分析法,具體模型如下:

Yij=μ+Gi+bW+eij

其中,Yij表示性狀測定值;μ表示群體均值;Gi表示基因型效應(yīng);W表示體重協(xié)變量效應(yīng);b為協(xié)變量的回歸系數(shù);eij為隨機誤差。

采用2-ΔΔCt法計算AQP9、RPS10基因的相對表達(dá)量(以GAPDH基因為內(nèi)參),采用T檢驗評估不同基因型間定量表達(dá)結(jié)果差異的顯著性(P<0.05)。

1.8 突變位點功能預(yù)測

使用轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合譜數(shù)據(jù)庫(A database of transcription factor binding profiles, JASPAR)預(yù)測AQP9基因啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點,及突變前后轉(zhuǎn)錄因子的變化。使用miRDB(miRDB-Custom Prediction)分析RPS10基因3′UTR區(qū)潛在的miRNA結(jié)合位點。

2 結(jié) 果

2.1 表型數(shù)據(jù)整理

對413頭北京黑豬的肩部背膘厚、6～7肋間背膘厚、胸腰結(jié)合處背膘厚、腰薦結(jié)合處背膘厚、四點平均背膘厚的測定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析,均值分別為3.86、3.07、2.57、2.74、3.07 cm(表3)。

表3 北京黑豬不同部位背膘厚度性狀的表型值統(tǒng)計Table 3 Statistics of phenotypic values of backfat thickness traits at different parts of Beijing black pigs

2.2 AQP9和RPS10基因SNP位點基因型頻率及群體遺傳特征

通過對AQP9和RPS10基因的啟動子區(qū)及外顯子區(qū)進(jìn)行PCR擴增,最終在AQP9和RPS10基因共發(fā)現(xiàn)12個突變位點(表4和表5)。其中AQP9中有4個突變位點位于啟動子區(qū),而RPS10中有8個突變位點,包括7個突變位置在3′UTR區(qū),1個在CDS區(qū)。AQP9和RPS10基因突變位點的基因型頻率和群體遺傳特性,見表4和表5。全部12個SNPs的基因型頻率變化范圍在1%～87%,等位基因變化頻率為7%～92%。該群體中rs80862457 C>T、rs80795904 C>G、rs80932213 T>C、rs3469834461 C>T、rs3469834461 C>A顯示了中等多態(tài)性 (0.250.05),因此選擇潛力較大。

表4 AQP9基因多態(tài)位點群體遺傳特性Table 4 Population genetic characteristics of AQP9 SNPs

2.3 AQP9、RPS10基因多態(tài)性和不同部位背膘厚性狀的關(guān)聯(lián)分析

將AQP9和RPS10基因篩選出的12個SNPs位點與豬的肩部背膘厚、6～7肋間背膘厚、胸腰結(jié)合處背膘厚、腰薦結(jié)合處背膘厚、四點平均背膘厚進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析(表6和表7)。在AQP9的4個啟動子區(qū)突變中,rs332699245 A>C與胸腰結(jié)合處背膘厚度顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05),其余3個位點與各個部位背膘厚度關(guān)聯(lián)均不顯著。在RPS10的8個SNPs中,7個位于3′UTR區(qū)的突變位點中,有4個SNPs與背膘厚度顯著相關(guān)(P<0.05),分別是:rs80862457 C>T與胸腰結(jié)合處背膘厚、腰薦結(jié)合處背膘厚均顯著關(guān)聯(lián);rs80795904 C>G和rs80932213 T>C與6～7肋背膘厚顯著關(guān)聯(lián);rs3469834461 C>T與肩部背膘厚和四點平均背膘厚均顯著關(guān)聯(lián)。另位于CDS區(qū)的位點rs336938272 A>C與6～7肋背背膘厚、腰薦結(jié)合處背膘厚、四點平均背膘厚均顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)。

表5 RPS10基因多態(tài)位點群體遺傳特性Table 5 Population genetic characteristics of RPS10 SNPs

2.4 SNPs位點突變功能分析

使用JASPAR (https://jaspar.genereg.net/)分析AQP9基因啟動子區(qū)與背膘厚顯著關(guān)聯(lián)的SNP rs332699245 A>C潛在的轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factor,TF)結(jié)合位點。結(jié)果顯示,rs332699245 A>C位于轉(zhuǎn)錄因子SPI1的結(jié)合位點處。

使用miRDB(miRDB-Custom Prediction)預(yù)測RPS10基因位于3′UTR區(qū)的4個與背膘厚顯著關(guān)聯(lián)的突變位點(rs80862457 C>T、rs80795904 C>G、rs80932213 T>C、rs3469834461 C>T)中潛在的miRNA結(jié)合位點,發(fā)現(xiàn)rs80862457 C>T為miR-6777-5p的結(jié)合位點。

2.5 AQP9 rs332699245 A>C和RPS10 rs80862457 C>T不同基因型個體的基因表達(dá)差異分析

根據(jù)rs332699245 A>C位點AA型和AC型個體背膘厚差異顯著,利用RT-qPCR技術(shù)檢測AA與AC型個體背膘組織中AQP9基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,AA基因型個體的AQP9表達(dá)量顯著高于AC型個體(P<0.05),見圖1。

根據(jù)rs80862457 C>T位點AA和CC型個體背膘厚差異顯著,利用RT-qPCR技術(shù)檢測了CC與TT型個體背膘組織中RPS10基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,TT基因型個體的RPS10表達(dá)量顯著高于CC型個體(P<0.05),見圖2。

3 討 論

背膘厚對豬的胴體性狀、繁殖性能、肉質(zhì)性狀等均有影響,是評價胴體瘦肉率、育肥效果、繁殖性能等重要性狀的指標(biāo)。關(guān)紅民等[25]研究表明,背膘厚與胴體瘦肉率呈高度負(fù)相關(guān),可以作為衡量瘦肉率的指標(biāo)。育肥豬背膘厚增加可以提高背最長肌的肌內(nèi)脂肪含量、風(fēng)味和多汁性,從而影響豬肉品質(zhì)[26]。此外,背膘厚在各品種間存在顯著差異[27],是重要的數(shù)量性狀[28]。本研究所用北京黑豬在pH、保水力、嫩度等肉質(zhì)指標(biāo)上相比于長白豬、大約克豬等外來瘦肉型豬種有較大優(yōu)勢[29],但存在中國地方豬種背膘較厚、生長速度較慢的問題[30]。因此,對北京黑豬背膘厚遺傳機制的研究是必要的。

表6 AQP9基因SNPs與背膘厚度性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 6 Association analysis of AQP9 gene SNPs with backfat thickness

表7 RPS10基因SNPs與黑豬背膘厚度性狀的關(guān)聯(lián)分析Table 7 Association analysis of RPS10 gene SNPs with backfat thickness

*.P<0.05。下同 *.P<0.05. The same as below圖1 AQP9基因相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of AQP9 gene

圖2 RPS10基因相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of RPS10 gene

目前,研究人員在不同豬種上均發(fā)現(xiàn)了與背膘厚顯著相關(guān)的SNPs。吳正常等[31]在丹系大白豬上利用55K SNP芯片對背膘厚性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS),篩選出2個與背膘厚顯著相關(guān)的SNPs,發(fā)現(xiàn)4個候選基因;Zhu等[32]對一個大白、長白雜交群體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,在7條染色體上檢測到25個與背膘厚顯著關(guān)聯(lián)的SNPs;劉欣[33]在576頭長白豬、民豬的雜交群體中發(fā)現(xiàn)與6～7肋背膘厚度顯著相關(guān)的35個SNPs位點。本課題組前期研究中也發(fā)現(xiàn)了AQP9、RPS10均為影響北京黑豬背膘厚的候選基因,但并未明確上述兩基因多態(tài)性與北京黑豬背膘厚的相關(guān)性關(guān)系,因此,本研究對AQP9、RPS10不同多態(tài)位點與背膘厚度進(jìn)行了分析,為之后北京黑豬背膘厚的分子育種提供了理論依據(jù)。

AQP9在維持體內(nèi)能量代謝與平衡、脂肪合成以及個體的生長發(fā)育等方面都具有至關(guān)重要的作用。本研究在北京黑豬群體中對AQP9基因的4個SNPs位點與背膘厚度性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有rs332699245 A>C位點與胸腰結(jié)合處背膘厚顯著相關(guān)。基因表達(dá)差異分析表明,rs332699245 A>C中AQP9基因mRNA水平表達(dá)量AA基因型個體顯著高于AC基因型個體。脂肪的生成及分化受到多種轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)的影響,轉(zhuǎn)錄因子(TF)是人類中存在的最大的蛋白質(zhì)組之一,TF直接控制基因表達(dá)。AQP9啟動子區(qū)的rs332699245 A>C被預(yù)測為TF結(jié)合位點,該位點的突變導(dǎo)致出現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄因子SPI1的結(jié)合位點。轉(zhuǎn)錄因子沙門氏菌致病島1(SPI1)是ETS家族的重要成員,它首先在弗里德氏小鼠紅細(xì)胞白血病中被鑒定為一個促癌基因[34]。SPI1是一種造血轉(zhuǎn)錄因子,經(jīng)鑒定可促進(jìn)糖酵解過程,通過促進(jìn)有氧糖酵解促進(jìn)癌癥進(jìn)展,該轉(zhuǎn)錄因子通過影響糖酵解,進(jìn)而影響脂肪的合成[35]。但其在豬上的功能尚不清楚,仍需后續(xù)研究。

據(jù)報道,RPS10與豬的生長性狀(肌肉生長、脂肪沉積)有強的相關(guān)性[20]。本研究在北京黑豬群體中對RPS10基因的8個位點與各部位背膘厚度性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,并發(fā)現(xiàn)5個(rs3469834461 C>T、rs80932213 T>C、rs80795904 C>G、rs80862457 C>T、rs336938272 A>C)SNPs與背膘厚顯著關(guān)聯(lián)?；虮磉_(dá)差異分析表明,rs80862457 C>T不同基因型個體背膘組織中RPS10基因mRNA表達(dá)量在TT基因型個體顯著高于CC基因型個體。在RPS10的3′UTR區(qū)域的突變位點(rs80862457 C>T)通過預(yù)測被確定為潛在的miR-6777-5p的結(jié)合位點。miRNAs是真核生物中具有競爭性和靶向調(diào)控作用的非編碼RNA[36],長度約為19～25個核苷酸[37],大多數(shù)的miRNA位于蛋白編碼基因的3′UTR區(qū)域[38]、內(nèi)含子區(qū)域,參與生物胚胎發(fā)育、脂質(zhì)代謝、神經(jīng)調(diào)節(jié)等多種調(diào)控過程[39]。miRNA主要是通過與靶基因mRNA堿基配對達(dá)到使mRNA降解或阻礙蛋白質(zhì)翻譯,調(diào)控個體的生理活動[40]。有研究表明,miRNA是肌肉和脂肪組織代謝平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[41],也可作為脂代謝調(diào)節(jié)的潛在媒介[42],主要通過抑制脂代謝靶基因的翻譯從而影響脂肪、膽固醇的合成等過程。在脂肪生成過程中可以加速或抑制脂肪細(xì)胞分化,調(diào)節(jié)脂肪發(fā)育[43],miR-122-5p、miR-142-3p、miR-143等已被報道是脂肪沉積的調(diào)節(jié)因子[44-45]。miR-6777-5p在人類青光眼的臨床癥狀中被觀察到,并被證明參與了青光眼發(fā)病機制的調(diào)控[46]。但其在豬上的功能研究尚不完全,仍需后續(xù)完善。

4 結(jié) 論

通過對413頭北京黑豬開展AQP9和RPS10基因多態(tài)性與背膘厚性狀的關(guān)聯(lián)分析,共發(fā)現(xiàn)12個SNPs位點,其中AQP9基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)4個SNPs,RPS10基因內(nèi)發(fā)現(xiàn)8個SNPs。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,AQP9基因內(nèi)1個SNP(rs332699245 A>C)與背膘厚顯著關(guān)聯(lián);RPS10基因內(nèi)5個SNPs(rs3469834461 C>T、rs80932213 T>C、rs80795904 C>G、rs80862457 C>T、rs336938272 A>C)與背膘厚顯著關(guān)聯(lián)。AQP9基因rs332699245 A>C和RPS10基因rs80862457 C>T不同基因型個體間基因表達(dá)差異顯著。本研究結(jié)果為豬AQP9、RPS10基因調(diào)控背部脂肪含量的分子機理提出了新見解,以期探索調(diào)控性狀變異的候選基因功能位點,為進(jìn)一步闡述性狀變異的遺傳機理奠定基礎(chǔ),為北京黑豬的分子遺傳育種提供理論參考。