王鑫鑫,林樹(shù)梅*,趙冬冬,王學(xué)生

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院,沈陽(yáng) 110866; 2.沈陽(yáng)康利生物科技有限公司,沈陽(yáng) 110000)

膿毒癥是指宿主以臟器發(fā)生功能障礙為特征,對(duì)侵入的病原體產(chǎn)生失控反應(yīng)而造成有生命危險(xiǎn)的癥候群[1]。在機(jī)體眾多受損器官中,肺是膿毒癥最早且最容易受傷的靶器官,在膿毒癥發(fā)病早期可引起急性肺損傷(acute lung injury,ALI),造成病畜呼吸系統(tǒng)發(fā)生功能障礙,ALI甚至是導(dǎo)致膿毒癥動(dòng)物死亡的罪魁禍?zhǔn)譡2]。據(jù)調(diào)研發(fā)現(xiàn),全國(guó)生豬感染膿毒癥的概率已經(jīng)超過(guò)50%,超過(guò)一半的膿毒癥患畜會(huì)發(fā)展為ALI,而ALI的死亡率約為40%[3]。

“炎癥因子風(fēng)暴”是ALI炎癥初期的主要表現(xiàn),本質(zhì)上是肺的急性炎癥反應(yīng)過(guò)程[4]。不分“敵我”的炎癥因子,對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成持續(xù)性損傷。膿毒癥引起肺損傷的致病機(jī)理錯(cuò)綜復(fù)雜,涉及肺內(nèi)多種細(xì)胞間的相互作用,如肺泡上皮細(xì)胞(alveolar epithelial cells,AECs)、肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages,AMs)、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞等[5]。目前,對(duì)于ALI還沒(méi)有特定的治療方法。ALI的臨床治療主要包括肺保護(hù)性通氣和限制性液體管理,并輔助糖皮質(zhì)激素、吸入性肺血管擴(kuò)張劑、神經(jīng)肌肉阻滯和體外膜肺氧合[6-7]。盡管上述治療方法能夠改善ALI的癥狀,但是會(huì)伴有長(zhǎng)期的后遺癥,包括認(rèn)知障礙、肺功能不全、肌肉無(wú)力等[8]。因此,迫切需要探尋安全有效的ALI治療新策略。

AMs是駐留在肺組織中的主要免疫細(xì)胞,在ALI的發(fā)病中扮演著重要角色[9]。AMs通過(guò)不斷地接受來(lái)自周圍或其他遠(yuǎn)處細(xì)胞的外源信號(hào),激活A(yù)Ms,釋放過(guò)量的炎性細(xì)胞因子,促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。最新研究發(fā)現(xiàn),AMs與肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞密切相關(guān)[10]。AECs是具有大表面積的結(jié)構(gòu)細(xì)胞,作為肺泡中病原體防御的第一道防線,在肺損傷過(guò)程中,AECs通常是最先被攻擊的細(xì)胞[11]。當(dāng)肺部感染病原微生物時(shí),AECs參與包括巨噬細(xì)胞在內(nèi)的各種免疫細(xì)胞和炎癥介質(zhì)的募集,免疫細(xì)胞在對(duì)抗病原微生物的同時(shí),不可避免地?fù)p傷AECs,同時(shí),受損的AECs也會(huì)以外泌體形式發(fā)出調(diào)節(jié)信息影響AMs的表型及功能。

外泌體是各類細(xì)胞主動(dòng)分泌的納米級(jí)別的細(xì)胞外囊泡,外泌體能夠穿透細(xì)胞膜并靶向特定組織或細(xì)胞的能力,同時(shí)外泌體具有低免疫力原性,不會(huì)被免疫系統(tǒng)排斥。一些調(diào)節(jié)信息以外泌體為介質(zhì)在結(jié)構(gòu)性細(xì)胞與免疫細(xì)胞之間的交流中扮演著關(guān)鍵角色,成為細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)劑[12]。研究表明,外泌體可以促進(jìn)組織修復(fù)和血管生成,以促進(jìn)缺血組織的重建,從而在多種疾病中顯示出很好的應(yīng)用前景[13-15]。而且,外泌體在炎癥反應(yīng)和自身免疫疾病中體現(xiàn)積極的作用[16-17]。還有研究表明,在ALI的發(fā)病過(guò)程中,AMs通過(guò)不斷地接收來(lái)自包括AECs源性的外泌體刺激發(fā)生極化反應(yīng),從而影響ALI的發(fā)生發(fā)展。外泌體的發(fā)現(xiàn)為ALI的治療開(kāi)辟了新思路。

1 巨噬細(xì)胞極化在急性肺損傷中的作用

1.1 巨噬細(xì)胞極化分型

在炎癥和宿主防御中,巨噬細(xì)胞在肺組織中起著核心作用,是先天性固有免疫的重要組成部分[18]。在肺組織中,巨噬細(xì)胞群有三種不同的來(lái)源:氣道、肺泡和間質(zhì)巨噬細(xì)胞[19]。肺中的巨噬細(xì)胞通過(guò)抗原呈遞,以及吞噬吸入的顆粒、由外來(lái)病原體誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子來(lái)清除抗原及異物[20]。巨噬細(xì)胞的表型不是一成不變的,在各種環(huán)境因素或不同的病理生理?xiàng)l件刺激下,將一種“活化型”轉(zhuǎn)化為另一種“活化型”是一個(gè)快速且可逆的過(guò)程。巨噬細(xì)胞極化主要分為兩種不同的極化狀態(tài):經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞(classically activated macrophages,M1)與選擇活化型巨噬細(xì)胞(alternatively activated macrophages,M2)[21-22]。其中,M2型巨噬細(xì)胞由M2a、M2b、M2c和M2d四種亞型組成[10]。它們被不同的刺激物激活,M2a巨噬細(xì)胞主要是由白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)和IL-13誘導(dǎo)產(chǎn)生,而M2b表型通常是由IL-1β或免疫復(fù)合物誘導(dǎo)形成,IL-10和糖皮質(zhì)激素促進(jìn)M2c巨噬細(xì)胞的合成,M2d型由腺苷A誘導(dǎo)2a受體激動(dòng)劑和Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)協(xié)調(diào)誘導(dǎo)形成[23-24]。研究顯示[25],在ALI的發(fā)病過(guò)程中,表現(xiàn)出較強(qiáng)的促炎及抗原提呈能力的主要為M1型巨噬細(xì)胞;而發(fā)揮抗炎、修復(fù)組織和促進(jìn)纖維化作用的主要是M2巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞這兩種不同的極化狀態(tài)有著截然相反的功能,甚至可以說(shuō)是相互拮抗。

1.2 巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控

巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用清除機(jī)體內(nèi)“垃圾”,積極參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑、血管生成以及炎癥反應(yīng)等過(guò)程[26]。巨噬細(xì)胞在ALI的發(fā)病機(jī)制中起著主要作用,極化時(shí)間和程度決定了疾病的嚴(yán)重程度和發(fā)展方向,M1型巨噬細(xì)胞與發(fā)病初期密切相關(guān),而M2型巨噬細(xì)胞主要與ALI炎癥的恢復(fù)期有關(guān)[27]。巨噬細(xì)胞的極化可受多種因素的調(diào)節(jié),包括miRNA、蛋白質(zhì)、糖皮質(zhì)激素及中草藥提取物等。其中,miRNA是通過(guò)調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的一種小型非編碼RNA。研究人員發(fā)現(xiàn)干擾素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)或TLR受體激動(dòng)劑促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化過(guò)程中,表達(dá)水平發(fā)生明顯上升的為miR-155[28]。隨后發(fā)現(xiàn),miR-155可以靶向作用于TLR4信號(hào)通路中促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1表型轉(zhuǎn)化的髓樣分化因子88蛋白,上調(diào)促炎因子表達(dá)。而在IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從M1向M2表型轉(zhuǎn)變的過(guò)程中,miR-155下降明顯。彭巍[29]通過(guò)miRNAs基因芯片技術(shù)篩選正常肺泡上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體(AEC-Exo)和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體(LPS-AEC-Exo)的差異miRNA表達(dá)譜,獲得與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的miR-92a-3p,證明LPS-AEC-Exo通過(guò)miR-92a-3p激活A(yù)Ms中的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)炎癥信號(hào)通路,誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體傳遞的miR-16-5p可以通過(guò)抑制TLR4促進(jìn)巨噬細(xì)胞向抗炎M2型極化來(lái)改善盲腸結(jié)扎和穿孔誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠的肺損傷[30]。Song等[31]證明與未經(jīng)IL-1β處理的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體組相比,經(jīng)IL-1β預(yù)處理的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體中miR-146a的表達(dá)顯著增強(qiáng),并且外泌體miR-146a轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞導(dǎo)致其發(fā)生M2極化。Gu等[32]發(fā)現(xiàn),將miR-124模擬物轉(zhuǎn)染單核巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)促進(jìn)甘露糖受體C1基因、殼酶蛋白、IL-10的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化。

除了miRNA之外,許多蛋白質(zhì)和糖皮質(zhì)激素也參與ALI中巨噬細(xì)胞極化和炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。Mittal等[33]發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中,觀察到通過(guò)給小鼠氣管滴注TSG-6(tumor necrosis factor alpha-stimulated gene-6,TSG-6)可以治療肺損傷,其作用機(jī)制主要是促使M1型巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變,使促炎細(xì)胞因子的釋放減少,同時(shí)提高抗炎細(xì)胞因子水平。眾所周知,甲基強(qiáng)的松龍具有抗炎特性,被廣泛用于各種炎性疾病,包括ALI。已有研究證實(shí),甲基強(qiáng)的松龍抗炎作用與促進(jìn)AMs發(fā)生M2極化,從而有助于炎癥的消退和組織的修復(fù)有關(guān)[34]。近年來(lái),研究者從中草藥提取物中分離出許多具有抗炎療效的成分,其中有一種為苯丙素苷類化合物Smiglaside A。研究發(fā)現(xiàn),Smiglaside A能夠減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷,并增加小鼠的存活率。這與其在抑制巨噬細(xì)胞M1極化的同時(shí),促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化有關(guān),極化調(diào)節(jié)作用由腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine activated protein kinase,AMPK)和過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ,PPARγ)信號(hào)通路介導(dǎo)[35]。

2 肺泡上皮細(xì)胞外泌體調(diào)控巨噬細(xì)胞極化在急性肺損傷中的作用

2.1 肺泡上皮細(xì)胞的分類及作用

AECs具有較大的表面積,是保護(hù)肺免受各種侵害的物理屏障,對(duì)維持肺的完整性和生理功能起著重要作用,并積極參與肺的免疫反應(yīng)[36-37]。AECs由兩種主要的細(xì)胞類型形成:肺泡I型細(xì)胞(alveolar epithelial type I cells,AECI)和肺泡II型細(xì)胞(alveolar epithelial type II cells,AECII)。鱗狀肺泡I型細(xì)胞占據(jù)肺泡的大部分表面積(90%以上),是一種很薄的細(xì)胞,有利于機(jī)體進(jìn)行氣體交換,同時(shí)也非常容易受到損傷;另一種主要的細(xì)胞類型是呈立方體細(xì)胞的肺泡II型細(xì)胞,在肺泡上皮中所占比例約為10%,主要參與肺表面活性物質(zhì)的合成、分泌和貯藏[38-40]。在ALI發(fā)病時(shí),AECI主要參與促炎反應(yīng),而作為祖細(xì)胞的AECII,在肺損傷后肺泡上皮的再生過(guò)程中發(fā)揮作用,同時(shí),免疫細(xì)胞也可以通過(guò)多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的分泌而受到影響[41-42]。

2.2 外泌體介導(dǎo)細(xì)胞間通訊緩解急性肺損傷

細(xì)胞間通訊對(duì)于多細(xì)胞生物應(yīng)對(duì)和適應(yīng)環(huán)境變化十分關(guān)鍵,通常通過(guò)細(xì)胞間直接接觸或分泌可溶性介質(zhì)來(lái)完成,是免疫反應(yīng)的基石。20世紀(jì)60年代末,Bonucci[43]和Anderson[44]觀察到軟骨細(xì)胞分泌出約100 nm的小泡,并初次對(duì)這種小泡進(jìn)行描述。通過(guò)使用電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),這種直徑40～100 nm小泡外觀呈“圓盤(pán)狀”。隨著研究的逐漸開(kāi)展,這種由細(xì)胞主動(dòng)釋放的納米級(jí)囊泡被命名為“外泌體”。外泌體是由細(xì)胞膜以出芽方式形成的多泡體,富含特定的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì),幾乎所有的細(xì)胞都具有分泌外泌體的能力,如網(wǎng)狀細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞等[45]。細(xì)胞釋放出的外泌體具有多種多樣的功能,如重塑細(xì)胞外基質(zhì)和向其他細(xì)胞傳遞信號(hào),這種細(xì)胞間的囊泡運(yùn)輸在維持機(jī)體健康和疾病發(fā)生發(fā)展等許多方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,包括生長(zhǎng)發(fā)育、免疫、組織穩(wěn)態(tài)、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等[46]。研究發(fā)現(xiàn),在ALI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,線粒體產(chǎn)生的活性氧導(dǎo)致線粒體DNA轉(zhuǎn)錄缺陷和線粒體功能障礙,受損的線粒體DNA會(huì)進(jìn)一步引發(fā)肺部的不良反應(yīng)[47-48],而間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體將攜帶的線粒體轉(zhuǎn)移至巨噬細(xì)胞,能夠增加巨噬細(xì)胞氧化磷酸化能力,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力,改善LPS誘導(dǎo)的肺損傷[49]。同時(shí),Silva等[50]證實(shí),間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體轉(zhuǎn)移至AECs可以緩解LPS引發(fā)的線粒體功能障礙,并恢復(fù)了AECs屏障完整性。由此可見(jiàn),外泌體可能成為ALI的潛在治療手段。

最新發(fā)現(xiàn),AECs分泌的外泌體可作為細(xì)胞間交流的通訊介質(zhì),參與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展。Chen等[51]發(fā)現(xiàn),AECs通過(guò)外泌體攜帶的HOX反義基因間RNA髓系(Homeobox A transcript antisense RNA myeloid-specific 1,HOTAIRM1)競(jìng)爭(zhēng)性地與肺成纖維細(xì)胞上的miR-30 d-3p結(jié)合,促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞的增殖和分化,從而加速間質(zhì)肺纖維化的發(fā)生。Yu等[52]使用卵清蛋白(ovalbumin,OVA)刺激AECs產(chǎn)生外泌體(OAEs),OAEs可通過(guò)上調(diào)MMP14表達(dá)和裂解CD100激活巨噬細(xì)胞,從而增強(qiáng)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞性氣道炎癥。此外,由AECs衍生的外泌體在哮喘性支氣管炎癥狀態(tài)下可以誘導(dǎo)未分化的巨噬細(xì)胞增殖和趨化性增加[53],在治療以肺損傷-肺纖維化為特征的氣道疾病中,AECs衍生的外泌體也表現(xiàn)了積極的作用[54]。因此,AECs分泌的外泌體是肺部結(jié)構(gòu)細(xì)胞與免疫細(xì)胞聯(lián)系的重要橋梁,成為治療肺部疾病的新方法。

2.3 肺泡上皮細(xì)胞外泌體調(diào)控巨噬細(xì)胞極化影響急性肺損傷

AMs與肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞(AECs)存在密切聯(lián)系,特別是AECs能夠以外泌體方式調(diào)節(jié)AMs發(fā)生極化反應(yīng)[55]。Lee等[56]發(fā)現(xiàn)酸誘導(dǎo)AECs釋放的微囊泡可以引起AMs發(fā)生極化反應(yīng),且在高氧條件下,AECs衍生的細(xì)胞膜囊泡可以通過(guò)miRNA激活A(yù)Ms發(fā)生M1極化,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Moon等[57]發(fā)現(xiàn)通過(guò)傳遞促凋亡因子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartatespecific protease-3,Caspase-3),可使高氧誘導(dǎo)AECs釋放的外泌體刺激AMs發(fā)生M1極化,釋放大量炎癥因子,從而導(dǎo)致肺部發(fā)生炎癥反應(yīng)。

作為miRNA的載體,外泌體可以將miRNA轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的受體細(xì)胞,參與細(xì)胞間通訊,影響肺部微環(huán)境,調(diào)節(jié)肺部疾病的病理過(guò)程。Liu等[58]在體外使用LPS刺激AECs來(lái)模擬炎癥發(fā)生,與AMs進(jìn)行共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)AECs分泌的外泌體可通過(guò)攜帶miR-92a-3p介導(dǎo)AECs和AMs之間的串?dāng)_,激活巨噬細(xì)胞發(fā)生M1極化,誘導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)的發(fā)生。除此之外,李建軍等[59]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌感染情況下,AECII來(lái)源的外泌體可通過(guò)miR-145刺激AMs向M2型極化并抑制M1型極化,對(duì)抗炎癥反應(yīng)。因此,人們可通過(guò)影響AECs外泌體攜帶的miRNA來(lái)調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化方向,從而減輕ALI的損傷程度(圖1)。

圖1 肺泡上皮細(xì)胞分泌的外泌體調(diào)控巨噬細(xì)胞極化在急性肺損傷中的作用[本文圖片使用在線繪圖軟件科研者之家(https://www.home-for-researchers.com/static/index.html)繪制]Fig.1 Role of exosomes secreted by alveolar epithelial cells in regulating macrophage polarization in acute lung injury[The images in this article are drew by using the online drawing software HOME for Researchers(https://www.home-for-researchers.com/static/index.html)]

此外,AMs對(duì)AECs的功能調(diào)節(jié)也可以通過(guò)外泌體來(lái)進(jìn)行。研究表明,AMs源性的外泌體中含有與細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的抑制蛋白(suppressor of cytokine signaling,SOCS),該蛋白可抑制炎癥性轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)信號(hào)通路[60]。AECs幾乎不表達(dá)SOCS蛋白,但AECs分泌的前列腺素E2和IL-10,可增加AMs含SOCS蛋白的外泌體分泌,含有SOCS蛋白的外泌體被AECs攝取并下調(diào)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的STAT活化,維持AECs處于靜止?fàn)顟B(tài)并限制正常AECs的惡性發(fā)展[61]。因此,在AECs與AMs之間的信息交流中,外泌體可以作為一個(gè)重要的介質(zhì),從而對(duì)肺部的炎癥起到調(diào)節(jié)作用。

3 小結(jié)與展望

ALI是一種嚴(yán)重且潛在致命的急性炎癥性肺部疾病,控制“炎癥因子風(fēng)暴”是控制該疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。相關(guān)研究表明,來(lái)源AECs的外泌體可作用于肺組織中的結(jié)構(gòu)細(xì)胞,介導(dǎo)肺部疾病的發(fā)病,而AMs是肺組織中主要的免疫細(xì)胞,AMs極化又是啟動(dòng)ALI炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。因此,通過(guò)調(diào)控AECs釋放的外泌體成分影響AMs極化,可調(diào)控炎癥反應(yīng),有望為ALI治療開(kāi)辟新思路。