魯萍,王杰,尹小麗,張順芝,吳蔚

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬長(zhǎng)沙醫(yī)院、長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院Ⅰ期臨床研究中心,長(zhǎng)沙 410011;2.湖南泰新醫(yī)藥科技有限公司,長(zhǎng)沙 410000)

托法替布是一種Janus激酶(Janus kinase,JAK)抑制劑,在甲氨蝶呤治療無(wú)明確療效的中、重度活動(dòng)性風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病例中表現(xiàn)出顯著的療效[1-2],口服吸收迅速,生物利用度高,具有良好的安全性和耐受性[3],患者用藥依從性好[4]。由Pfizer Manufacturing Deutschland GmbH開(kāi)發(fā)的枸櫞酸托法替布片于2012年經(jīng)美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市,為全球首個(gè)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的新型口服靶向JAK抑制劑。2017年該藥獲準(zhǔn)在中國(guó)上市,目前無(wú)國(guó)產(chǎn)枸櫞酸托法替布片批準(zhǔn)上市。文獻(xiàn)報(bào)道枸櫞酸托法替布檢測(cè)方法有高效液相色譜(high performance liquid chromatogra-phy,HPLC)法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromato-graphy-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法[5-6]。筆者在本研究采用HPLC-MS/MS法對(duì)枸櫞酸托法替布在人血漿中濃度進(jìn)行精確測(cè)定,考察空腹和餐后給藥條件時(shí)枸櫞酸托法替布的藥動(dòng)學(xué)行為,分析比較受試制劑和參比制劑的生物等效性及安全性[7-13],為該藥的注冊(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥品 枸櫞酸托法替布片受試制劑[(簡(jiǎn)稱T),湖南九典制藥股份有限公司提供,規(guī)格:5 mg,批號(hào):X200702,含量99.7%];[枸櫞酸托法替布片參比制劑[(簡(jiǎn)稱R,商品名:Xeljanz?),由Pfizer Manufacturing Deutschland GmbH生產(chǎn),規(guī)格:5 mg,批號(hào):AP4444];托法替布檸檬酸鹽對(duì)照品(批號(hào):2604-021A2,含量:97.5%);托法替布-d3檸檬酸鹽對(duì)照品(批號(hào):1534-033A3,含量:96.1%),均由TLC公司提供。

1.2儀器與試劑 API 5500型三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀(AB Sciex 公司),電噴霧電離源(AB Sciex 公司)、Analys數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Version1.6.3),ExionLC AD液相色譜儀(AB Sciex 公司),XPR2/A型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司,感量:0.1mg),0.1%甲酸溶液,乙腈。

1.3受試者選擇 該試驗(yàn)通過(guò)長(zhǎng)沙市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審查,并獲得批件,批件號(hào):20201102CSSY00501,臨床試驗(yàn)登記號(hào):CTR20202253,臨床試驗(yàn)備案號(hào):202000567-01,受試者均簽署知情同意書。

入選標(biāo)準(zhǔn):年齡18～55周歲,體質(zhì)量:男性≥50 kg,女性≥45 kg,身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI):18.6～26.4 kg·(m2)-1,試驗(yàn)前充分了解該試驗(yàn),且自愿簽署知情同意書,遵守方案規(guī)定完成試驗(yàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn):生命體征、心電圖、胸部X線片及各項(xiàng)檢查異常者,患有神經(jīng)、心血管、內(nèi)分泌、泌尿、免疫、消化、呼吸等系統(tǒng)疾病者,過(guò)敏體質(zhì)者,嗜煙嗜酒者,篩選前14 d內(nèi)服用任何藥物者,篩選前30 d內(nèi)服用任何影響藥物代謝的藥物者,近3個(gè)月內(nèi)獻(xiàn)血或參加過(guò)臨床試驗(yàn)者,妊娠或哺乳期者,近半年內(nèi)有生育計(jì)劃者等[8-10]。

1.4治療方法與血樣采集 入組受試者均進(jìn)行2周期試驗(yàn),每周期隨機(jī)交叉服用T或R 1片,洗脫期7 d。

每周期受試者于服藥前1 d進(jìn)行入住檢查,醫(yī)生篩查判斷合格后入住病房,給藥前禁食>10 h,試驗(yàn)當(dāng)日早晨口服試驗(yàn)藥物(T或R)5 mg后,立即飲用溫水240 mL(餐后組給藥前30 min進(jìn)食高脂餐,須30 min內(nèi)進(jìn)食完畢)。藥動(dòng)學(xué)(PK)采血點(diǎn)為:服藥前(服藥前1 h內(nèi))和服藥后5、15、30、45 min及1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5(僅餐后組)、4、4.5(僅餐后組)、5(僅餐后組)、6、8、10、12和24 h(餐后空腹分別21份和18份血樣,每份靜脈血約4 mL)。血樣采集后60 min內(nèi)開(kāi)始離心,4 ℃,1 600×g離心10 min,離心后取上清液,并于1 h內(nèi)置于超低溫冰箱(-60 ℃以下)中保存。

1.5血漿測(cè)定方法

1.5.1色譜條件 色譜柱:Waters Xselectable HSS T3(2.1 mm×100 mm,3.5 μm),柱溫為35 ℃,流動(dòng)相A:0.1%甲酸溶液;流動(dòng)相B:乙腈,梯度洗脫:0—0.70 min,10%B;0.70—1.30 min,10%B→30%B;1.30—1.31 min,30%B→95%B;1.31—3.40 min,95% B;3.40—3.50 min,10% B。進(jìn)樣量:20 μL,流速0.4～0.6 mL·min-1。

1.5.2質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源(electric sparay ion source,ESI),多反應(yīng)監(jiān)測(cè),監(jiān)測(cè)離子對(duì):m/z313.1→149.1(托法替布),m/z316.1→152.1(內(nèi)標(biāo)托法替布-d3),離子源噴霧電壓5 500 V,離子源溫度550 ℃。

1.5.3血漿樣品處理 移取血漿樣品50 μL,加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL后加入乙腈200 μL,封板,渦旋3 min,離心條件:4 ℃,2 490×g離心10 min,移取上清液100 μL,加入超純水200 μL,渦旋混勻。

1.6方法學(xué)考察與評(píng)價(jià)

1.6.1專屬性 將空白血漿、加入標(biāo)準(zhǔn)品的血漿樣本和服藥后血漿樣本進(jìn)行分析,托法替布及其內(nèi)標(biāo)的離子通道及保留時(shí)間窗中,待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間約為2.25 min,未發(fā)現(xiàn)任何內(nèi)源性物質(zhì)干擾,專屬性良好,色譜圖見(jiàn)圖1。

A:空白血漿;B:空白血漿+對(duì)照品;C:服藥45 min后血漿。

1.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 分析標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本(托法替布濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、80.0和100.0 ng·mL-1),以托法替布濃度為橫坐標(biāo),以托法替布與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo),加權(quán)回歸,權(quán)重因子1/x2,線性范圍為0.5～100.0 ng·mL-1,標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0451X+2.6×10-4(r2=0.999 6),定量下限為0.5 ng·mL-1。

1.6.3精密度與回收率 取托法替布濃度分別為0.5、1.5、15.0和75.0 ng·mL-1的質(zhì)控樣品,考察批內(nèi)及批間精密度與準(zhǔn)確度。各質(zhì)控樣品制備6份,分析批內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算質(zhì)控樣品濃度,根據(jù)結(jié)果計(jì)算批內(nèi)及批間精密度的RSD。配置托法替布濃度分別為1.5、15.0和75.0 ng·mL-1的質(zhì)控濃度樣本,各制備6份,連續(xù)測(cè)定3個(gè)批次,計(jì)算批內(nèi)及批間精密度。比較3個(gè)濃度經(jīng)提取與未經(jīng)提取的待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值,計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1,結(jié)果顯示批內(nèi)批間精密度良好,滿足生物樣本檢測(cè)要求。

表1 人血漿中托法替布的精密度和回收率

1.6.4基質(zhì)效應(yīng) 分別取不同批次6個(gè)空白血漿,預(yù)處理后分別加入與低、高濃度質(zhì)控樣本相當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)溶液進(jìn)行分析。內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子均值分別為0.97和1.01,變異系數(shù)分別為2.6%和2.3%。

1.6.5穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 配制含托法替布的低、高2個(gè)濃度全血和血漿質(zhì)控樣本,各濃度平行制備6份,經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣分析,考察全血樣本在冰浴,血漿樣本在室溫、-20 ℃和-70 ℃保存條件下及-70 ℃凍融循環(huán)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明托法替布全血樣本冰浴放置2 h穩(wěn)定,血漿樣本室溫放置22 h,-20 ℃放置4.5 d,-70 ℃放置65 d,-70 ℃凍融5次,均穩(wěn)定,對(duì)照品儲(chǔ)備液和工作液分別在室溫放置17 h,-20 ℃放置55 d穩(wěn)定,處理過(guò)的樣品在自動(dòng)進(jìn)樣器(2～8 ℃)下放置62 h再進(jìn)樣穩(wěn)定。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Phoenix WinNonlin 8.2版軟件計(jì)算托法替布主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(AUC、Cmax),并經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行多因素方差分析,將tmax進(jìn)行兩配對(duì)樣本的非參數(shù)Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1受試者入組及完成情況 空腹組入組36例,男28例,女8例,完成試驗(yàn)35例。年齡(24.81±5.75)歲,身高(167.00±7.41) cm,體質(zhì)量(60.39±7.89) kg,BMI(21.62±2.04) kg·(m2)-1。餐后組入組36例,男24例、女12例,均完成試驗(yàn)。年齡(28.86±8.45)歲,身高(163.32±8.29) cm,體質(zhì)量(58.28±7.96) kg,BMI(21.83±2.18) kg·(m2)-1。

2.2血藥濃度-時(shí)間曲線 受試者單次服用枸櫞酸托法替布片T與R后的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2,圖3。結(jié)果顯示兩組血藥濃度-時(shí)間曲線的變化趨勢(shì)基本一致。

圖2 空腹組枸櫞酸托法替布片T與R平均血藥濃度-時(shí)間曲線

圖3 餐后組枸櫞酸托法替布片T與R平均血藥濃度-時(shí)間曲線

2.3藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 空腹和餐后分別有35例和36例受試者納入PK濃度集、PK參數(shù)集和BE分析集。受試者單次服用T和R后,血漿中托法替布的tmax、Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、t1/2見(jiàn)表2。

表2 空腹和餐后組服用枸櫞酸托法替布片T和R后的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

2.4生物等效性評(píng)價(jià) 兩制劑的Cmax、AUC0-t、AUC0-∞幾何均值比及90%置信區(qū)間,空腹組為96.35%(90.11%～103.03%)、101.02%(98.76%～103.34%)、100.77%(98.53%～103.06%);餐后組為105.91%(95.20%～117.83%)、102.23%(99.67%～104.86%)、102.40%(99.81%～105.06%),均在80.00%～125.00%內(nèi),表明在空腹及餐后條件下兩種枸櫞酸托法替布片均具有生物等效性。

2.5安全性評(píng)價(jià) 空腹和餐后組各納入安全數(shù)據(jù)集的36例受試者,空腹組9例(25.0%)發(fā)生15例次不良事件,表現(xiàn)為尿白細(xì)胞陽(yáng)性5例次,尿潛血陽(yáng)性、尿膽紅素升高、血尿酸升高、直接膽紅素升高各2例次,尿蛋白檢出和血壓升高各1例次,其中8例(22.2%)14例次不良事件,與說(shuō)明書記載引起泌尿系統(tǒng)感染和肝酶升高的不良反應(yīng)一致,判定為藥物不良反應(yīng)。餐后組10例受試者(27.8%)發(fā)生26例次不良事件,表現(xiàn)為尿白細(xì)胞陽(yáng)性5例次,尿潛血陽(yáng)性、尿紅細(xì)胞陽(yáng)性各4例次,尿膽紅素升高、三酰甘油升高各2例次,血膽紅素升高、腹瀉、嘔吐等各1例次,所有10例(27.8%)26例次不良事件,與說(shuō)明書中引起泌尿系統(tǒng)感染、血脂升高和肝酶升高等不良反應(yīng)一致,判定為藥品不良反應(yīng)。本研究不良事件及不良反應(yīng)發(fā)生率均低于30%,且均為輕度,未發(fā)生非預(yù)期不良反應(yīng),表明2種制劑的耐受性和安全性良好[10]。

3 討論

本研究參考《以藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為終點(diǎn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的化學(xué)藥物仿制藥人體生物等效性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[14]《普通口服固體制劑參比制劑選擇和確定指導(dǎo)原則》[15],以Pfizer Manufacturing Deutschland GmbH的枸櫞酸托法替布片(Xeljanz?)作為參比制劑[16],考察湖南九典制藥股份有限公司生產(chǎn)的枸櫞酸托法替布片(規(guī)格:5 mg)在健康受試者中空腹及餐后條件下的藥動(dòng)學(xué)特征。

空腹和餐后組分別在服藥后0.5和1 h內(nèi)迅速達(dá)到血漿藥物濃度峰值,表明食物會(huì)延緩藥物的吸收速度,與其他文獻(xiàn)報(bào)道均一致[7-11]。餐后組比空腹組AUC均增加約15%,但Cmax、t1/2無(wú)明顯差異,與其他文獻(xiàn)報(bào)道略有差異[7-11],考慮與受試制劑的處方工藝、臨床前藥學(xué)研究特性、受試者樣本量、采血點(diǎn)設(shè)計(jì)、個(gè)體差異及高脂餐配方等有關(guān),還有待進(jìn)一步研究?？崭购筒秃蠼MCmax、AUC0-t、AUC0-∞的個(gè)體內(nèi)變異(CV)分別為16.66%和27.24%,5.60%和6.37%,5.55%和6.44%,均低于30%,不屬于高變異類藥物,餐后Cmax個(gè)體內(nèi)變異(CV)為27.54%,低于文獻(xiàn)報(bào)道的34.83%[10],考慮藥物的BCS分類、高脂餐配方、受試者人口學(xué)特征差異等因素有關(guān),故餐后是否屬于高變異藥物,還待更多研究確證。

本研究的受試制劑國(guó)產(chǎn)枸櫞酸托法替布片已順利通過(guò)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局核查并獲得藥品批準(zhǔn)證明文件,該藥順利上市后,意味著與原研藥的質(zhì)量和療效一致的國(guó)產(chǎn)藥,將有望以更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的價(jià)格,逐步替代昂貴的原研藥,更好地滿足臨床用藥急需,從而減輕患者的醫(yī)療費(fèi)用負(fù)擔(dān),節(jié)約國(guó)家醫(yī)療成本,也有助于提升國(guó)內(nèi)醫(yī)藥行業(yè)高發(fā)展質(zhì)量。