范菁,唐昊翔,王銀輝,范煒斌,謝姣,林彬

(1.浙江省長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院藥學(xué)部,長(zhǎng)興 313100;2.湖州市智能藥學(xué)與個(gè)體化治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)興 313100;3.浙江省長(zhǎng)興縣疾病預(yù)防控制中心,長(zhǎng)興 313100;4.西安交通大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部,西安 710004)

2021年奈瑪特韋片/利托那韋片組合包裝上市,根據(jù)公司發(fā)布的臨床數(shù)據(jù)表明,其可大大降低輕度或中度新型冠狀病毒感染(簡(jiǎn)稱(chēng)新冠)患者的住院或死亡風(fēng)險(xiǎn),為新冠患者治療帶來(lái)曙光,引起業(yè)內(nèi)的高度關(guān)注[1]。2022年12月奈瑪特韋片/利托那韋片組合包裝作為新型抗新冠病毒藥物被寫(xiě)入《新型冠狀病毒感染診療方案(試行第十版)》,用于新冠患者的治療[2-3]。其中奈瑪特韋是新型冠狀病毒SARS-CoV-2主要蛋白酶抑制劑,它能夠通過(guò)阻斷病毒多蛋白前體的加工,從而阻止病毒復(fù)制。利托那韋作為CYP3A的抑制劑,與奈瑪特韋聯(lián)合應(yīng)用時(shí),可防止奈瑪特韋過(guò)早的代謝失活,從而提高奈瑪特韋在患者體內(nèi)的藥物濃度[4-5]。當(dāng)奈瑪特韋/利托那韋與通過(guò)該途徑代謝的藥物聯(lián)合使用時(shí),會(huì)影響其療效或增加不良反應(yīng)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。為了避免藥物之間的相互作用,明確奈瑪特韋、利托那韋在患者體內(nèi)的血藥濃度十分重要[6]。因此,使用奈瑪特韋/利托那韋治療的患者,建議進(jìn)行藥物濃度監(jiān)測(cè),對(duì)提高臨床療效和降低不良反應(yīng)具有重要意義。

截至2023年5月,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spec-tormetry,UPLC-MS/MS)法用于患者體內(nèi)奈瑪特韋/利托那韋血藥濃度檢測(cè)方法學(xué)的報(bào)道有2篇,但測(cè)定方法存在樣本處理復(fù)雜、樣本分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等,無(wú)法滿(mǎn)足臨床大樣本檢測(cè)[7-8]。本文建立UPLC-MS/MS檢測(cè)奈瑪特韋/利托那韋的血藥濃度,為新冠患者的治療藥物監(jiān)測(cè)以及藥動(dòng)學(xué)相關(guān)研究提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1儀器 質(zhì)譜儀(型號(hào):Xevo TQ-S cronos,美國(guó)沃特世公司);超高效液相色譜儀(型號(hào):H-Class Plus,美國(guó)沃特世公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(型號(hào):5424R,德國(guó)艾本德公司),旋渦混勻器(型號(hào):VORTEX-3,德國(guó)艾卡公司),電子分析天平(型號(hào):BSA-124S,德國(guó)賽多利斯公司,感量:0.1 mg)。

1.2藥品與試劑 奈瑪特韋對(duì)照品(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào):N17HS201609,含量≥98%);利托那韋對(duì)照品(中檢院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限公司,批號(hào):F1503111,含量≥99%);奈瑪特韋-D9內(nèi)標(biāo)[島津(上海)有限公司,批號(hào):DD023-221A1,含量≥98%];13C,2H3-利托那韋內(nèi)標(biāo)[島津(上海)有限公司,批號(hào):155216-67-5,含量≥98%],甲酸、乙腈、甲醇溶液(色譜級(jí),美國(guó)西格瑪公司)。

1.3液相色譜條件 色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7μm);流動(dòng)相:A相為100%乙腈,B相為0.1%甲酸,流速:0.3mL·min-1;色譜柱溫:45 ℃;進(jìn)樣量:2 μL,梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4質(zhì)譜條件 離子源電噴霧離子(ESI+)模式;毛細(xì)管電壓:3 000 V;去溶劑化溫度:350 ℃;氮?dú)?nitrogen,N2)流速600 L·h-1;掃描方式為MRM模式,奈瑪特韋、利托那韋及相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的其他質(zhì)譜檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

表2 奈瑪特韋和利托那韋及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

1.5儲(chǔ)備液及工作液的配制 精密稱(chēng)取奈瑪特韋及利托那韋對(duì)照品適量,奈瑪特韋及其內(nèi)標(biāo)物奈瑪特韋-D9以乙腈溶解,利托那韋及其內(nèi)標(biāo)13C,2H3-利托那韋以乙腈：水(50：50)溶解,將奈瑪特韋及利托那韋分別制備成1.00mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。將奈瑪特韋-D9及13C,2H3-利托那韋各自溶解后混合,以含有0.1%甲酸的乙腈：甲醇(3：1)稀釋,得到奈瑪特韋-D9及13C,2H3-利托那韋濃度分別為1.00和0.50μg·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)物工作液,-20 ℃避光保存。

取奈瑪特韋及利托那韋對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,以含有0.1%甲酸的乙腈：水(3：1)逐級(jí)稀釋得到系列混合對(duì)照品工作液(奈瑪特韋:100、80、50、20、10、5、1 μg·mL-1;利托那韋:50、40、20、10、5、1、0.5 μg·mL-1),質(zhì)控低濃度(奈瑪特韋:5 μg·mL-1;利托那韋:1 μg·mL-1)、中(奈瑪特韋:10 μg·mL-1;利托那韋:10 μg·mL-1)、高(奈瑪特韋:80 μg·mL-1;利托那韋:40 μg·mL-1)。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及質(zhì)控品的制備 空白人血漿90 μL中加入奈瑪特韋及利托那韋混合對(duì)照品工作液10 μL,配制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和質(zhì)控品,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍為奈瑪特韋:10、8、5、2、1、0.5、0.1 μg·mL-1;利托那韋:5、4、2、1、0.5、0.1、0.05 μg·mL-1;質(zhì)控低濃度(奈瑪特韋:0.5 μg·mL-1;利托那韋:0.1 μg·mL-1)、中(奈瑪特韋:1 μg·mL-1;利托那韋:1 μg·mL-1)、高(奈瑪特韋:8 μg·mL-1;利托那韋:4 μg·mL-1),定量下限(奈瑪特韋:0.1 μg·mL-1;利托那韋:0.05 μg·mL-1)。

1.7血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品100 μL,加入混合內(nèi)標(biāo)工作液300 μL,渦旋混合均勻,12 000 r·min-1離心5 min,取上清液2 μL進(jìn)樣分析。

1.8臨床應(yīng)用

1.8.1患者納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):①>18歲新冠病毒核酸檢測(cè)或抗原檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性;②本人或家屬簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):①擅自中斷或更改藥物劑量;② 1周內(nèi)服用細(xì)胞色素P450酶或P-糖蛋白抑制劑或誘導(dǎo)劑。

1.8.2用藥方法與結(jié)果檢測(cè) 收集長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院2023年1月服用奈瑪特韋片/利托那韋片治療的新冠患者血液標(biāo)本共計(jì)30例。該研究已通過(guò)長(zhǎng)興縣人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批[(2023)倫審藥/械/研第(046號(hào))]。30例患者均接受奈瑪特韋/利托那韋口服治療,其中奈瑪特韋300 mg、利托那韋100 mg,bid。根據(jù)奈瑪特韋以及利托那韋的半衰期計(jì)算,連續(xù)給藥在2 d后血藥濃度達(dá)穩(wěn)態(tài)。于第3天給藥前半小時(shí)采血,血樣收集于血漿分離膠采血管中,離心,取上清液進(jìn)行血漿預(yù)處理后分析檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1方法學(xué)專(zhuān)屬性考察 選取6份不同的空白血漿、已加入定量下限的血漿樣品、來(lái)自服用奈瑪特韋片/利托那韋的患者穩(wěn)態(tài)谷濃度血漿樣品,按血漿樣本處理流程處理后進(jìn)行分析檢測(cè),色譜圖見(jiàn)圖1。奈瑪特韋及其內(nèi)標(biāo)奈瑪特韋-D9的保留時(shí)間均為2.07 min,利托那韋及其內(nèi)標(biāo)13C,2H3-利托那韋的保留時(shí)間均為2.28 min。人血漿中內(nèi)源性物質(zhì)在保留時(shí)間內(nèi)的響應(yīng)值明顯低于定量下限的20%,且不干擾目標(biāo)峰的分析。

A.空白血漿;B.定量下限的血漿樣品;C服用奈瑪特韋/利托那韋患者的穩(wěn)態(tài)谷濃度血漿樣品。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與線(xiàn)性范圍 以奈瑪特韋或利托那韋的濃度為橫坐標(biāo)(X),血漿樣品測(cè)得的峰面積與各自?xún)?nèi)標(biāo)物奈瑪特韋-D9或13C,2H3-利托那韋峰面積比(Y)進(jìn)行線(xiàn)性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到奈瑪特韋標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:Y=4.553 82X+0.223 37,r2=0.997 2,線(xiàn)性范圍為0.1～10 μg·mL-1。利托那韋標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為:Y=1.080 27X+0.024 901 3,r2=0.995 2,線(xiàn)性范圍為0.05～5 μg·mL-1。奈瑪特韋定量下限為0.1 μg·mL-1,利托那韋定量下限為0.05 μg·mL-1。

2.3精密度與準(zhǔn)確度 按照血漿樣品處理流程操作,分別配制定量下限、低、中、高質(zhì)控4個(gè)濃度的血漿樣本,每一濃度重復(fù)配制6次,分別檢測(cè)。連續(xù)3 d。結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示奈瑪特韋與利托那韋在各質(zhì)控濃度及定量下限濃度的準(zhǔn)確度均在±10%內(nèi)。奈瑪特韋批內(nèi)精密度范圍為4.26%～9.28%,利托那韋批內(nèi)精密度2.91%～6.01%,奈瑪特韋批間精密度范圍為4.96%～8.31%,利托那韋批間精密度4.40%～9.31%,精密度和準(zhǔn)確度符合《中華人民共和國(guó)藥典》的相關(guān)技術(shù)要求。

表3 奈瑪特韋與利托那韋測(cè)定方法的準(zhǔn)確度與精密度

2.4提取回收率 在3個(gè)質(zhì)控濃度(低、中、高)下,評(píng)價(jià)奈瑪特韋以及利托那韋的提取回收率。將各質(zhì)控濃度的血漿樣本處理后進(jìn)樣分析得到峰面積A。另取空白血漿按血漿處理流程,將混合內(nèi)標(biāo)工作液替換成等體積的含有0.1%甲酸的乙腈：甲醇(3：1),加入對(duì)應(yīng)濃度的奈瑪特韋、利托那韋及內(nèi)標(biāo),進(jìn)樣分析,得到峰面積B,提取回收率(%)為峰面積A與峰面積B的比值×100%。結(jié)果見(jiàn)表4。奈瑪特韋和利托那韋的提取回收率均>94%。

表4 奈瑪特韋與利托那韋提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)

2.5基質(zhì)效應(yīng) 考察6份不同來(lái)源的空白血漿對(duì)奈瑪特韋與利托那韋各質(zhì)控濃度(低、中、高)的影響,空白血漿進(jìn)行血漿樣本處理后添加相應(yīng)濃度的奈瑪特韋、利托那韋與內(nèi)標(biāo)溶液,進(jìn)行分析得到峰面積(C)。相應(yīng)濃度的奈瑪特韋、利托那韋與內(nèi)標(biāo)純?nèi)芤?進(jìn)樣分析得到峰面積(D)?；|(zhì)效應(yīng)(MF)=C/D×100%,結(jié)果見(jiàn)表4,奈瑪特韋的基質(zhì)效應(yīng)為92.4%～97.7%,利托那韋的基質(zhì)效應(yīng)為94.2%～97.6%。

2.6殘留效應(yīng) 取定量上限血漿樣本(奈瑪特韋:10 μg·mL-1;利托那韋:5 μg·mL-1)進(jìn)樣,每次進(jìn)樣后進(jìn)空白血漿,平行6次,殘留效應(yīng)=進(jìn)樣定量上限后的殘留峰面積/定量下限峰面積。結(jié)果顯示,定量上限濃度點(diǎn)后的空白血漿在奈瑪特韋、利托那韋和內(nèi)標(biāo)對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處未見(jiàn)明顯的信號(hào)峰,奈瑪特韋的殘留韋0.10%,利托那韋的殘留韋0.15%,表明殘留物對(duì)血漿樣品的后續(xù)檢測(cè)無(wú)影響。

2.7稀釋可靠性 取奈瑪特韋及利托那韋儲(chǔ)備液,加入空白血漿,配制含奈瑪特韋及利托那韋濃度分別為20、10 μg·mL-1的混合血漿樣本,平行 15 份樣。用空白血漿對(duì)以上混合血漿樣本進(jìn)行 2、4 和 10 倍稀釋。最終得到含奈瑪特韋/利托那韋濃度10/5、5/2.5、2/1 μg·mL-1混合血漿樣本各5份。處理后進(jìn)樣分析。測(cè)定結(jié)果顯示稀釋2、4 和 10 倍的樣品奈瑪特韋/利托那韋測(cè)定結(jié)果與標(biāo)示量的偏差分別為-3.5%/-4.2%、-5.2%/-2.1%、-4.9%/-6.6%。

2.8穩(wěn)定性 配制各質(zhì)控濃度(低、中、高)血漿樣品,每個(gè)濃度平行配制3份,分別考察質(zhì)控品在長(zhǎng)期穩(wěn)定性(-20 ℃,30 d);反復(fù)凍融穩(wěn)定性(-20 ℃→室溫,3次);短期穩(wěn)定性(室溫,24 h);以及處理后自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性(10 ℃,48 h),結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明奈瑪特韋及利托那韋在以上條件下濃度沒(méi)有明顯變化,RSD在±10%。

表5 奈瑪特韋與利托那韋穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.9臨床結(jié)果 30例患者中,男17例,女13例,年齡(63.9±17.6)歲?；颊咂骄w質(zhì)量(70.3±10.1) kg,肌酐清除率平均值為(98.2±19.9) mL·min-1。其中伴高血壓8例,糖尿病3例,腫瘤2例。

奈瑪特韋谷濃度為0.38～2.05μg·mL-1,平均藥物濃度為(1.00±0.43)μg·mL-1。利托那韋谷濃度為0.07～0.89μg·mL-1,平均藥物濃度為(0.35±0.22)μg·mL-1。提示奈瑪特韋和利托那韋在不同患者間的藥物濃度差異較大。所有結(jié)果均在定量分析線(xiàn)性范圍內(nèi)。本試驗(yàn)建立的UPLC-MS/MS法能滿(mǎn)足臨床對(duì)奈瑪特韋/利托那韋血藥濃度檢測(cè)的需求。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 新冠患者體內(nèi)奈瑪特韋和利托那韋血藥濃度的散點(diǎn)圖

3 討論

目前,有2篇關(guān)于奈瑪特韋/利托那韋定量檢測(cè)方法的報(bào)道,LIU等[7]報(bào)道一種基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定健康志愿者體內(nèi)奈瑪特韋和利托那韋的含量的方法,該液相方法檢測(cè)時(shí)間共7 min,檢測(cè)效率低;另外,該檢測(cè)方法僅應(yīng)用于健康志愿者進(jìn)行濃度監(jiān)測(cè),新冠患者病理生理情況復(fù)雜,不一定適用。MARTENS-LOBENHOFFER等[8]報(bào)道一種基于液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定新冠患者體內(nèi)奈瑪特韋和利托那韋的含量的方法,該方法梯度長(zhǎng)達(dá)13 min,同樣存在檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、效率低的問(wèn)題,不適用于臨床大量樣本檢測(cè)。此外,這2種方法樣本預(yù)處理方法復(fù)雜,檢測(cè)前需要進(jìn)行繁瑣的準(zhǔn)備過(guò)程,影響工作效率。本研究根據(jù)藥品說(shuō)明書(shū)中藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù),設(shè)置合理的濃度范圍,采用UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)人血漿中奈瑪特韋和利托那韋濃度。其中奈瑪特韋檢測(cè)濃度范圍為0.10～10.00μg·mL-1,利托那韋檢測(cè)濃度范圍為0.05～5.00μg·mL-1。該方法檢測(cè)時(shí)間3 min,其中奈瑪特韋及其內(nèi)標(biāo)奈瑪特韋-D9的出峰時(shí)間均為2.07min,利托那韋及其內(nèi)標(biāo)13C,2H3-利托那韋的出峰時(shí)間均為2.28min。

考慮到分析物以及內(nèi)標(biāo)化合物的物理化學(xué)性質(zhì),本研究檢測(cè)離子源選擇了電噴霧正離子模式,并對(duì)以下質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化:毛細(xì)管電壓、N2流速、去溶劑化溫度、四級(jí)桿碰撞能量等。血漿前處理采用了蛋白沉淀法,以含內(nèi)標(biāo)的乙腈：甲醇(3：1)作為沉淀劑,相比于其他檢測(cè)方法沉淀蛋白時(shí)先加內(nèi)標(biāo)混勻后再加沉淀劑費(fèi)時(shí)繁瑣[9-11],筆者在本方法中提前將內(nèi)標(biāo)與沉淀劑制備成混合內(nèi)標(biāo)工作液,僅需一步即可采用高速離心的方法除蛋白,方法簡(jiǎn)單?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)等因素,本方法使用結(jié)構(gòu)相似的同位素作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì),其中奈瑪特韋-D9作為奈瑪特韋的內(nèi)標(biāo),13C,2H3-利托那韋作為利托那韋的內(nèi)標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明當(dāng)奈瑪特韋-D9及13C,2H3-利托那韋作為內(nèi)標(biāo)時(shí),基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),奈瑪特韋和利托那韋在色譜中保留時(shí)間越長(zhǎng),峰形越差。通過(guò)優(yōu)化洗脫程序,將奈瑪特韋和利托那韋的出峰時(shí)間控制在3 min內(nèi),以此獲得優(yōu)越的峰形。此外,柱溫對(duì)奈瑪特韋的峰形有顯著的影響,對(duì)利托那韋無(wú)明顯影響,通過(guò)比較不同的柱溫,發(fā)現(xiàn)柱溫為45 ℃時(shí)峰形最佳。為了提高電離效果,本研究在水相中加入0.1%甲酸。

考慮到奈瑪特韋和利托那韋在患者體內(nèi)的藥物濃度較低[12],筆者在本研究中選擇靈敏度較高的UPLC-MS/MS法,該方法操作簡(jiǎn)便,靈敏度和檢測(cè)效率高,適用于奈瑪特韋和利托那韋的血藥濃度監(jiān)測(cè)。

MARTENS-LOBENHODDER等[8]針對(duì)新冠患者的研究表明,患者接受奈瑪特韋/利托那韋口服治療后(其中奈瑪特韋300 mg、利托那韋100 mg,bid),患者體內(nèi)奈瑪特韋谷濃度范圍為0.33～4.73 μg·mL-1,利托那韋谷濃度范圍為0.05～0.64 μg·mL-1,與本研究中新冠患者體內(nèi)奈瑪特韋/利托那韋藥物濃度范圍相近。結(jié)果顯示,奈瑪特韋和利托那韋在不同患者間的藥物濃度差異較大,結(jié)合部分患者的臨床療效也發(fā)現(xiàn)谷濃度較高的患者更易發(fā)生不良反應(yīng),另外谷濃度過(guò)低可能影響患者的好轉(zhuǎn),但是需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

筆者在本研究中建立同時(shí)測(cè)定人血漿中奈瑪特韋和利托那韋藥物濃度檢測(cè)方法,并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高,檢測(cè)范圍合理,為今后奈瑪特韋和利托那韋的臨床研究以及藥物安全性研究提供方法學(xué)支撐。