李雪梅,肖斯婷,高曉新,曹春然（北京市藥品檢驗(yàn)研究院（北京市疫苗檢驗(yàn)中心）,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局創(chuàng)新藥物安全研究與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥成分分析與生物評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206）

紅金消結(jié)膠囊是彝藥，組方由三七、香附、八角蓮、鼠婦蟲、黑螞蟻、五香血藤、雞矢藤、金蕎麥、大紅袍、柴胡十味藥組成，在彝族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，其功能主治補(bǔ)知?jiǎng)P扎諾，且凱色土，哈息黑。依其處方，按中醫(yī)理論解釋，紅金消結(jié)膠囊有舒肝理氣、軟堅(jiān)散結(jié)、活血化瘀、消腫止痛的功效?？捎糜跉鉁鏊碌娜橄傩∪~增生、子宮肌瘤、卵巢囊腫。在文獻(xiàn)檢索中發(fā)現(xiàn)，該藥療效顯著，但其中八角蓮的毒性仍不可小覷，關(guān)于紅金消結(jié)膠囊的急性毒性研究未見報(bào)道[1-6]，本研究將紅金消結(jié)膠囊按其制備工藝進(jìn)行拆方，分別灌胃，對(duì)其全方及其成分分別進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，觀察毒性反應(yīng)，為臨床安全用藥提供依據(jù)[7-17]。

1 材料

1.1 動(dòng)物 種屬、品系：ICR小鼠；來源：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（京）2016-0006號(hào)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（京）2015-0033號(hào)；數(shù)量：100只；性別：雌性；體重：15.5-18g。

1.2 受試藥物 名稱：紅金消結(jié)膠囊（T1），含鬼臼毒素2mg/g（相當(dāng)于臨床用量200倍），批號(hào)：181004，有效期：2020/10/05，規(guī)格：0.4g/粒，用法用量：口服，一次4粒，一日3次。生產(chǎn)廠家：A公司。

處方：三七75g，香附75g，八角蓮45g，鼠婦蟲30g，黑螞蟻30g，五香血藤600g，雞矢藤600g，金蕎麥600g，大紅袍600g，柴胡400g。

制法：以上十味藥材中，取三七、香附、八角蓮、鼠婦蟲、黑螞蟻粉碎成細(xì)粉，混勻，滅菌備用；其余五香血藤等五味藥，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二次1.5小時(shí)，第三次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至相對(duì)密度為1.28-1.35（50攝氏度）的稠膏，與上述粉末混合，干燥，粉碎，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得。

名稱：鬼臼毒素對(duì)照品（T2），批號(hào)：111645-201803，生產(chǎn)單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

名稱：八角蓮1（T3），含鬼臼毒素24mg/g（相當(dāng)于臨床用量200倍）。

名稱：動(dòng)物藥：鼠婦蟲、黑螞蟻（T4）（相當(dāng)于臨床用量200倍）。

名稱：三七、香附、八角蓮1（含鬼臼毒素24mg/g）原粉（T5）（相當(dāng)于臨床用量200倍）。

名稱：合并水煎液：五香血藤、雞矢藤、金蕎麥、大紅袍、柴胡（T6）（相當(dāng)于臨床用量200倍）。

名稱：八角蓮2（T7），含鬼臼毒素81mg/g（相當(dāng)于臨床用量200倍）。

名稱：八角蓮1（T8），含鬼臼毒素24mg/g（相當(dāng)于臨床用量150倍）。

名稱：三七、香附、八角蓮1（含鬼臼毒素24mg/g）原粉（T9）（相當(dāng)于臨床用量150倍）。

1.3 儀器設(shè)備 電子天平，型號(hào)：PL-203、BSA2201。

2 方法

2.1 受試物配置方法 陰性對(duì)照N：稱取羧甲基纖維素鈉（以下簡(jiǎn)稱CMC）1.001g加純化水至200ml，放置一天溶解。

T1紅金消結(jié)膠囊：稱取紅金消結(jié)膠囊8.030g，加5%CMC制成20ml（0.402g/ml）；T2鬼臼毒素對(duì)照品：稱取鬼臼毒素0.036g，加0.5%CMC制成10ml（3.6mg/ml）；T3八角蓮1（含鬼臼毒素24mg/g）：稱取八角蓮1 0.899g，加0.5%CMC制成20ml（0.045g/ml）；T4鼠婦蟲、黑螞蟻：稱取鼠婦蟲、黑螞蟻1.215g，加0.5%CMC制成20ml（0.061g/ml）；T5三七、香附、八角蓮1（含鬼臼毒素24mg/g）原粉：稱取三七、香附、八角蓮1原粉（按處方比例）3.907g，加0.5%CMC制成20ml（0.195g/ml）；T6合并水煎液：五香血藤、雞矢藤、金蕎麥、大紅袍、柴胡：分別稱取五香血藤12g、雞矢藤12g、金蕎麥12g、大紅袍12g、柴胡8g，加水煎煮三次，第一次2小時(shí)，第二次1.5小時(shí)，第三次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至20ml的稠膏。T7八角蓮2（含鬼臼毒素81mg/g）：稱取八角蓮2 0.627g，加0.5%CMC制成14ml（0.045g/ml）；T8八角蓮1（相當(dāng)于臨床用量150倍）：稱取八角蓮1（低劑量）0.473g，加0.5%CMC制成14ml（0.0338g/ml）；T9三七、香附、八角蓮1原粉（相當(dāng)于臨床用量150倍）：稱取三七、香附、八角蓮1原粉（按處方比例）1.756g，加0.5%CMC制成12ml（0.146g/ml）。

2.2 給藥途徑 小鼠灌胃給予受試物。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法 取ICR品系小鼠100只，雌性，隨機(jī)分成十組，即陰性對(duì)照組（同體積0.5%CMC）。T1（紅金消結(jié)膠囊）、T2（鬼臼毒素對(duì)照品）、T3[八角蓮1（鬼臼毒素含為24mg/g）]、T4（鼠婦蟲+黑螞蟻）、T5[三七、香附、八角蓮1（鬼臼毒素含量為24mg/g）原粉]、T6（水煎部分）、T7[八角蓮2（鬼臼毒素含量為81mg/g）]、T8[八角蓮1（鬼臼毒素含量為24mg/g）]、T9[三七、香附、八角蓮1（鬼臼毒素含量為24mg/g）原粉]。實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水約14小時(shí)，受試物組每只小鼠以0.4ml/10gBW體積灌胃，一天內(nèi)給藥1次。陰性對(duì)照組給同體積0.5%CMC。給藥劑量分別為T1：0.402g/ml（含鬼臼毒素32mg/kg）、T2：3.6mg/ml（含鬼臼毒素145.8mg/kg）、T3：0.045g/ml（含鬼臼毒素43.2mg/kg）、T4：0.061g/ml（不含鬼臼毒素）、T5：0.195g/ml（含鬼臼毒素43.2mg/kg）、T6：2.8g/ml（不含鬼臼毒素）、T7：0.045g/ml（含鬼臼毒素145.8mg/kg）、T8：0.0338g/ml（含鬼臼毒素32.4mg/kg）、T9：0.146g/ml（含鬼臼毒素32.4mg/kg）。T1、T3、T4、T5、T6、T7給藥劑量分別相當(dāng)于臨床用量的200倍；T8、T9給藥劑量相當(dāng)于臨床用量150倍。給受試物后即刻觀察動(dòng)物反應(yīng)、動(dòng)物外觀、四肢活動(dòng)、攝食、飲水、排泄等癥狀，并每天觀察一次，連續(xù)觀察14天，詳細(xì)記錄每只動(dòng)物的反應(yīng)情況。在試驗(yàn)第0天、1天、4天、7天、11天、14天對(duì)動(dòng)物體重進(jìn)行測(cè)定；在試驗(yàn)第1天、4天、7天、11天、14天對(duì)動(dòng)物攝食量進(jìn)行測(cè)定。

飼料加入方法：飼料加入量每次約為150g/籠，第0天給藥0.5小時(shí)后每籠加入約50g飼料。

飼料加入日期：給藥當(dāng)天和給藥后第1、4、7、11天。

測(cè)定方法：按飼料加入日期稱量約150g飼料，加入在籠具的飼料盒內(nèi)，在給藥后第1、4、7、11、14天，收集飼料盒內(nèi)的剩余飼料，用天平稱重。給予量與剩余量之差即為本籠動(dòng)物的飼料攝入量。計(jì)算動(dòng)物每10g體重進(jìn)食量。

24小時(shí)攝食量=[（飼料給予量-飼料剩余量）/籠內(nèi)動(dòng)物體重的總和]×10g；每日平均攝食量（g/10gBW）=[（飼料給予量-飼料剩余量）/（天數(shù)×籠內(nèi)動(dòng)物體重的總和）]×10g。

3 結(jié)果

本研究采用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在數(shù)據(jù)資料符合正態(tài)分布的情況下，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1 癥狀觀察結(jié)果 使用八角蓮藥材與同等鬼臼毒素等劑量對(duì)照品相比，使用八角蓮藥材兩天，小鼠全部死亡，而使用鬼臼毒素組則在給藥第四天死亡數(shù)量最多，14天后仍有2只小鼠存活。八角蓮藥材低劑量與八角蓮低劑量加三七、香附相比，單獨(dú)使用低劑量八角蓮藥材14天給藥后有8只小鼠存活，而加用三七和香附后小鼠全部存活。處方水提取部分和動(dòng)物藥部分（鼠婦蟲、黑螞蟻），小鼠連續(xù)觀察14天，外觀、四肢活動(dòng)、體重、攝食、排泄未見異常。使用原處方灌胃的，小鼠連續(xù)觀察14天，出現(xiàn)豎毛、腹瀉癥狀，1-7天體重增長(zhǎng)緩慢。詳見表1。

表1 紅金消結(jié)膠囊小鼠口服給藥急性毒性試驗(yàn)觀察癥狀

3.2 攝食量結(jié)果 給藥0-14天，T4組動(dòng)物攝食量與陰性對(duì)照組無顯著差異，其余各組在給藥后0-1天，動(dòng)物攝食量均顯著降低，其中T3給藥組動(dòng)物攝食量最低。給藥后1-4天，除T2組動(dòng)物攝食量未變外，其余存活動(dòng)物攝食量均有所增長(zhǎng)。在給藥后的4-7天、7-11天、11-14天，存活動(dòng)物攝食量基本恢復(fù)正常，詳見表2。

表2 紅金消結(jié)膠囊小鼠口服給藥急性毒性試驗(yàn)攝食量結(jié)果

3.3 體重變化結(jié)果 試驗(yàn)期間，在第0天、1天、4天、7天、11天、14天對(duì)動(dòng)物體重進(jìn)行測(cè)定，可見除高劑量八角蓮藥材組外，其余各組體重均有所提高，詳見表3。

表3 紅金消結(jié)膠囊小鼠口服給藥急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物體重(,g)

表3 紅金消結(jié)膠囊小鼠口服給藥急性毒性試驗(yàn)動(dòng)物體重(,g)

注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

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4 討論

紅金消結(jié)膠囊口服給藥，給藥劑量達(dá)到臨床用量200倍時(shí)，小鼠出現(xiàn)豎毛、腹瀉、體重增長(zhǎng)緩慢、攝食量少等癥狀，但無動(dòng)物死亡。提示紅金消結(jié)膠囊總體上是安全的，但也存在一定風(fēng)險(xiǎn)。

經(jīng)拆方給藥研究，對(duì)比小鼠出現(xiàn)的毒性癥狀和死亡情況，可見紅金消結(jié)膠囊中的主要毒性（或活性）藥材是八角蓮，八角蓮含有的鬼臼毒素是主要毒性成分，但還有其他的毒性成分。因此應(yīng)對(duì)八角蓮進(jìn)行質(zhì)量控制（測(cè)定鬼臼毒素及其類似物的含量）。

同等給藥劑量下，八角蓮單味藥的毒性明顯，混合三七和香附或其他紅金消結(jié)膠囊中的所有藥味后，毒性明顯減輕，說明組方合用具有明顯的減毒作用。合用可能延緩了毒素的吸收，但動(dòng)物在八角蓮給藥后達(dá)4-5天還有死亡情況，提示也可能還有其他的減毒作用機(jī)制，具體原因有待進(jìn)一步的深入研究。