阮 晨, 賈永鵬, 吳 冉, 王來友, 黃可心, 李玉珠

(1.南陽理工學院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室 河南 南陽 473004;2.南陽理工學院生物與化學工程學院 河南 南陽 473004;3.南陽理工學院信息工程學院 河南 南陽 473004;4.南陽師范學院化學與制藥工程學院 河南 南陽 473061)

0 引言

細胞自噬是一種重要的生物學過程,它在動植物及真菌等生物中保持了高度的保守性[1]。這一過程使細胞可以有效應對周圍的應激環(huán)境,平衡和保證細胞內的能量流動,保證細胞的內部穩(wěn)態(tài)[2]。除此之外,它還可以去除細胞內受損的細胞器,清理并分解細胞內出現(xiàn)的錯誤冗余蛋白質,消滅入侵細胞的異常物質,它在癌癥和自身免疫性疾病的治療方面發(fā)揮了重要的作用[3]。

納米材料是空間尺度在100 nm以內的一種微型材料的通稱。研究人員發(fā)現(xiàn),金屬納米顆粒、量子點、稀土元素氧化物納米顆粒和樹狀大分子等均可以引發(fā)細胞的自噬現(xiàn)象[4]。到目前為止,納米顆粒引發(fā)的細胞自噬紊亂現(xiàn)象被認為是納米材料的主要生物毒性之一,而相關研究大部分集中在具有自噬誘導效應的新型材料的發(fā)現(xiàn),其具體誘導調控機制的研究仍處于淺層階段,有待深入挖掘[1,5]。

本項目以二氧化硅納米顆粒(Silica nanoparticles, SiNPs)誘導Hela細胞的自噬效應為研究對象,探討不同尺寸的二氧化硅納米顆粒對細胞的自噬效應。并以此為基礎結合轉錄組測序技術(RNA Sequencing, RNA-seq)系統(tǒng)鑒定二氧化硅納米顆粒處理細胞后的轉錄組,經(jīng)計算分析后篩選差異基因,設計RNA干擾實驗進行功能驗證,揭示二氧化硅納米顆粒誘導細胞自噬激活過程中參與調控的功能蛋白分子,為納米材料在生物醫(yī)學上的應用與優(yōu)化提供了有價值的參考信息。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

DEME高糖培養(yǎng)基、胎牛血清,杭州四季青生物工程材料有限公司。磷酸鹽緩沖液、青霉素、鏈霉素、蛋白檢測試劑盒,杰特生物科技有限公司。Anti-LC3抗體、Anti-ACTB抗體、Anti-GFP抗體,武漢三鷹生物科技有限公司。PVDF膜、蛋白酶抑制劑、甘氨酸等試劑,麥克林生化科技有限公司。

細胞培養(yǎng)箱、液氮罐,新鄉(xiāng)新亞低溫有限公司。蛋白質免疫印跡儀器套裝,武漢聯(lián)豐盛生物科技有限公司。全波長酶標儀,杭州米歐儀器有限公司。雙色紅外成像系統(tǒng),美國Odyssey公司。

1.2 納米顆粒的制備

首先將9.1 mg L-精氨酸充分溶解于6.9 mL純水中,然后將0.45 mL環(huán)己烷加入精氨酸水溶液中充分混勻。混勻裝置采用磁攪拌裝置,同時水浴加熱反應至60 ℃。其次,向反應溶液中加入0.55 mL原硅酸四乙酯,恒溫攪拌20 h,由此得到最小的二氧化硅納米顆粒種子。接著采用再生法制備其他尺寸較大的二氧化硅納米顆粒,得到所需要的二氧化硅納米顆粒后,對其表面進行羧基修飾。

1.3 細胞培養(yǎng)傳代與自噬水平的評價

從液氮罐中取出凍存細胞復蘇后離心,加入新鮮培養(yǎng)基后放入恒溫細胞培養(yǎng)箱開始培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為37 ℃,CO2濃度為5%。培養(yǎng)細胞匯合度至70%時,進行細胞傳代。傳代后繼續(xù)培養(yǎng),培養(yǎng)至細胞匯合度至80%時,用不同尺度的60 μg/mL二氧化硅納米顆粒處理細胞24 h。處理完畢后,用胰酶消化洗脫細胞,用低鹽裂解液裂解細胞樣本提取總蛋白,使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白定量。取適量蛋白質進行SDS-PAGE凝膠電泳, 電泳完畢后用濕轉法把目標蛋白轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉過夜。封閉完畢清洗,分別用含有一抗的PBS溶液封閉過夜,封閉溫度為4 ℃。第二天用含有二抗的PBS溶液室溫孵育2 h,再次洗滌后置于凝膠成像系統(tǒng)成像[6]。

1.4 總RNA提取與轉錄組測序

用二氧化硅納米顆粒處理細胞后,每個時間點約取3×106個細胞,迅速置于液氮中凍存?zhèn)溆?。取樣完畢?每個細胞樣品分別加入Trizol充分混勻離心取上清,獲取RNA沉淀。DECP水溶解分裝后,置于超低溫冰箱保存。使用Nanodrop 2000 spectrophotometer檢測RNA樣品純度。Qubit 3.0檢測RNA樣品濃度。使用Labchip GX檢測樣品RNA的ROS(RNA quality score)值。建庫完成將樣品送至武漢百邁克生物科技有限公司進行測序,得到經(jīng)過質控過濾后的高質量測序數(shù)據(jù)(Clean data)。

1.5 組學數(shù)據(jù)注釋及分析

使用Tophat程序用bowtie2將數(shù)據(jù)中的reads回帖至大鼠(rat)參考基因組根據(jù)經(jīng)典剪切位點標記尋找可能剪切組合[7]。Tophat進一步在沒有剪切位點注釋信息下建立比對索引[7]。使用Cufflinks程序拼接前一步中獲得的轉錄本,并計算表達量。使用Cuffmerge程序將獲得的轉錄本數(shù)據(jù)整合成一個數(shù)據(jù)集,使所有轉錄本數(shù)據(jù)都基于一個標準進行展示和計算[8]。最后用Cuffdiff程序濾篩選差異表達基因[9]。GO(Gene Ontology)富集分析均采用R語言進行計算[8,10-12]。

1.6 RNA干擾實驗

培養(yǎng)細胞至細胞匯合度在80%時,用RNA轉染試劑轉染每個基因相應的siRNA 48 h。用PBS溶液清洗3次后,用二氧化硅納米顆粒處理細胞。收集細胞樣品,用免疫印跡實驗檢測LC3B-II蛋白的表達量。

1.7 數(shù)據(jù)分析與繪圖

使用Microsoft office excel 2016、R language進行數(shù)據(jù)分析和計算。用R language進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 構建GFP-LC3-Hela細胞系

培養(yǎng)細胞至細胞匯合度在70%時,洗滌后加入與GFP-LC3腺病毒轉染原液充分混合后的新鮮培養(yǎng)基,腺病毒侵染48 h。在熒光共聚焦顯微鏡下觀察,根據(jù)熒光光斑數(shù)量選取侵染效率高的細胞,用于后續(xù)熒光拍照實驗(見圖1)。

圖1 GFP-LC3-Hela細胞系熒光拍照圖

2.2 不同規(guī)格的納米材料對細胞自噬效應影響

培養(yǎng)細胞至細胞匯合度在70%～80%時,用不同尺度的二氧化硅納米顆粒(60 μg/mL)分別處理細胞24 h。收集細胞樣品,用免疫印跡實驗檢測細胞自噬Marker LC3-II蛋白的表達情況(如圖2)。由實驗結果可知,經(jīng)16 nm二氧化硅納米顆粒處理細胞后,細胞內LC3-II蛋白質表達量為最大,細胞自噬活性最強。納米材料尺寸越大,LC3-II蛋白質表達量越小,自噬活性越小。緊接著,用GFP-LC3-Hela細胞系進行熒光拍照實驗,將16 nm的二氧化硅納米顆粒處理細胞24 h后,進行熒光拍照,拍照

圖2 不同尺度不同規(guī)格的納米材料對細胞自噬效應影響

結果如圖3。自噬形成時,GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜,在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點,一個斑點相當于一個自噬體,可以通過斑點數(shù)量來評價自噬活性的高低[2,13-14]。由拍照結果可知,細胞內生成了大量的自噬體,細胞自噬被激活。

圖3 納米材料處理后細胞內GFP-LC3熒光斑點成像拍照

2.3 轉錄組測序及分析

用16 nm二氧化硅納米顆粒處理細胞24 h后,送樣進行轉錄組測序?？俶RNA提取后進行質量檢測,如表1所示。待建庫樣本總mRNA濃度均在500 ng/μL以上。樣本OD260/280的值均在標準區(qū)間內,總mRNA純度較高。反映RNA完整性的質量評估參數(shù)RQS值均在9以上,滿足建庫要求。

表1 總mRNA質量檢測

測序完畢拿到Clean data后,用Tophat-Bowtie2-Cufflink程序在Linux系統(tǒng)上進行分析。Cuffdiff程序設定閾值計算過濾篩選差異表達基因。差異表達基因的過濾條件為|log2(Fold Change)|>1和p<0.05。根據(jù)篩選閾值共過濾出422個差異基因,其中共有231個上調基因和191個下調基因。

為了更加清晰地了解差異基因可能發(fā)揮的生物學功能以及參與的信號通路,對上一步過濾出的差異表達基因進行GO富集分析。分析結果如圖4所示,差異基因主要富集在mTOR信號通路、MAPK信號通路、cAMP信號通路及動物自噬信號通路等,這些信號通路與細胞自噬的發(fā)生存在緊密聯(lián)系[1,15]。這從一個側面說明過濾出的差異表達基因可能在其中發(fā)揮調控功能。同時選取差異基因排序靠前的18個基因進行后續(xù)實驗驗證,各基因的表達熱圖如圖5所示。

圖4 GO富集分析

2.4 差異表達基因的相關功能驗證

對2.6中選取的差異基因進行篩選和功能驗證,采用表達干擾和免疫印跡實驗進行驗證。各基因設計siRNA后轉染細胞,轉染48 h。洗滌后,用二氧化硅納米顆粒處理細胞24 h。提取細胞蛋白利用免疫印跡實驗檢測自噬蛋白Marker LC3B-II的表達量[1]。由圖6可知,干擾Casp4基因的表達,可以降低細胞內LC3B-II蛋白的表達量,影響細胞自噬的正常進行,細胞的自噬活性降低。

3 討論與結論

在當代,納米材料的研發(fā)越來越快,并走進人們生活,應用于食品、醫(yī)療、化工、通信等各種領域。不可避免的接觸和使用帶來了納米材料在人體內部的積累和轉移,其潛在的危害引起科學家們的重視,相關研究持續(xù)展開。在納米毒理和細胞自噬的領域,大多數(shù)研究集中在對具有引起細胞自噬效應的納米材料的發(fā)現(xiàn)和探討,其具體機制研究仍處于淺層階段,相關組學數(shù)據(jù)的產(chǎn)出也寥寥可數(shù)。

在本研究里,為了探究和尋找納米材料誘導細胞自噬的相關調控基因及機制,以二氧化硅納米顆粒誘導細胞自噬效應為核心,首先探究了不同尺寸的二氧化硅納米顆粒對細胞的自噬效應,研究發(fā)現(xiàn)不同尺度的二氧化硅納米顆粒誘導細胞自噬的效應不同,尺寸越小的納米顆粒自噬效應越明顯。在相關的研究中,已有科學家發(fā)現(xiàn)納米和亞微米尺寸的二氧化硅納米顆粒通過小窩蛋白介導的內吞作用和巨飲進入細胞引發(fā)細胞中的自噬作用[16]。在本研究里,我們發(fā)現(xiàn)16 nm的二氧化硅納米顆粒的誘導細胞自噬效應最強。以此為條件進行轉錄組測序和分析,研究共發(fā)現(xiàn)422個差異表達基因,差異基因的GO富集分析結果顯示這些基因主要參與的信號通路與自噬發(fā)生過程有若干聯(lián)系。其中,mTOR(Mammalian target of rapamycin)的一種特定復合物mTORC1蛋白是自噬的關鍵分子,mTORC1通過磷酸化形成的自噬調節(jié)復合物直接或間接參與自噬的各個過程中[17]。MAPK (mitogen-activated protein kinases)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,它通過磷酸化和去磷酸化影響細胞內自噬體以及自噬的發(fā)生過程[18]。這個結論表明過濾出來的差異基因可能在自噬的相關信號通路中發(fā)生作用。緊接著,論文選取排序靠前的差異表達基因進行RNA干擾實驗功能驗證。LC3-II是哺乳動物細胞自噬研究的標志蛋白[19]。當細胞自噬活動被激活,LC3-I蛋白被相關功能酶剪切,從而形成LC3-II。由于兩種蛋白分子的分子質量不同,因此可以通過免疫印跡實驗中的電泳進行分離,檢測LC3-II蛋白的顯影灰度值就可以對細胞的自噬水平進行評價[20]。免疫印跡結果表明干擾基因Casp4的表達,可以降低細胞內LC3B-II的水平。綜上,Casp4在二氧化硅納米顆粒誘導細胞自噬的過程中發(fā)揮了一定功能,其具體機制仍需深入探究。

本研究圍繞二氧化硅納米顆粒誘導細胞自噬進行探究和實驗,發(fā)現(xiàn)了新的潛在功能調控基因Casp4,希望這些發(fā)現(xiàn)可為細胞自噬相關機制的深入挖掘提供參考。