陳璐 張劍 趙松子 陳凱 謝昊星 張華軒 馮立云 趙耀 戎俊

摘 要：【目的】開(kāi)發(fā)能夠準(zhǔn)確、便捷、快速鑒定普通油茶與小果油茶的葉綠體基因分子標(biāo)記，為油茶遺傳資源的挖掘與利用提供參考。【方法】基于高通量測(cè)序技術(shù)組裝了普通油茶和小果油茶的葉綠體全基因組，通過(guò)比較基因組學(xué)技術(shù)尋找兩者葉綠體全基因組的差異，并根據(jù)其差異來(lái)開(kāi)發(fā)可用于鑒定普通油茶與小果油茶的分子標(biāo)記。為驗(yàn)證標(biāo)記的有效性，分別選取具有代表性的12 個(gè)普通油茶居群和6 個(gè)小果油茶居群的個(gè)體，提取葉綠體全基因組，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和凝膠電泳檢驗(yàn)?！窘Y(jié)果】組裝的普通油茶與小果油茶葉綠體基因組序列全長(zhǎng)分別為156 977、156 539 bp，兩者葉綠體全基因組具有高度的保守性，但小果油茶在atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區(qū)存在長(zhǎng)度為452 bp 的大片段缺失。所開(kāi)發(fā)引物的PCR 擴(kuò)增結(jié)果表明，所有普通油茶樣本均可擴(kuò)增出609 bp的條帶，而小果油茶擴(kuò)增出227 bp 的條帶，條帶差異顯著且穩(wěn)定。【結(jié)論】使用所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記能夠穩(wěn)定、便捷、精確地鑒定出普通油茶與小果油茶，但是使用時(shí)應(yīng)先確定所鑒定的物種為普通油茶和小果油茶中的一種。

關(guān)鍵詞：普通油茶；小果油茶；葉綠體全基因組；遺傳分化；分子標(biāo)記

中圖分類(lèi)號(hào)：S601 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1003—8981（2023）03—0206—08

油茶是山茶科Theaceae 山茶屬Camellia 中種子油脂含量較高、有栽培經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一類(lèi)植物的總稱(chēng)[1]。油茶籽油富含以油酸與亞油酸為主的不飽和脂肪酸，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值可以與橄欖油媲美，是一種優(yōu)質(zhì)的食用植物油[2-4]。在我國(guó)，油茶具有悠久的栽培歷史，分布地區(qū)廣、栽培面積大，其中普通油茶C. oleifera 的栽種面積已經(jīng)突破446.7 萬(wàn)hm2，為第一大木本油料作物，小果油茶C. meiocarpa 次之[5-6]。

普通油茶與小果油茶的花、葉、果性狀及株形等都具有高度的相似性[7-9]。因此，對(duì)于兩者的親緣關(guān)系存在一些爭(zhēng)議。胡先骕[10] 最早命名了小果油茶，而張宏達(dá)等[11] 認(rèn)為小果油茶是普通油茶的1 個(gè)變種。經(jīng)測(cè)定，兩者存在著明確的染色體倍性差異（普通油茶6 倍體，小果油茶4 倍體）以及較大的遺傳分化[12]。形態(tài)性狀（果實(shí)大小、種皮厚度、單果種籽數(shù)量等）常被用于辨別兩者的種類(lèi)[13]，個(gè)體間性狀的連續(xù)變異，導(dǎo)致兩者的中間類(lèi)型不易區(qū)分（圖1），且又存在同域分布的現(xiàn)象[14]，因此，通過(guò)觀測(cè)常規(guī)形態(tài)性狀難以準(zhǔn)確、有效區(qū)分兩者的種類(lèi)。葉綠體基因保守且含有較多的遺傳信息，擁有較高的分辨率和更好的通用性，因此被廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育研究等領(lǐng)域[15]，有利用葉綠體基因組來(lái)分析系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系復(fù)雜的山茶屬植物的報(bào)道[16]。根據(jù)葉綠體基因間的差異開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記是一種常用的物種鑒定方法，殷鑫等[17] 以山茶屬9 個(gè)組9 個(gè)物種的葉綠體基因組建立了山茶屬cpSSR 分子標(biāo)記體系，并初步篩選出在種間具有較好多態(tài)性的cpSSR 標(biāo)記。關(guān)于油茶葉綠體基因組的研究報(bào)道較多，其中‘三華油茶的葉綠體基因組已被發(fā)布[18]，也有其他一些近緣種的相關(guān)報(bào)道[19-20]。然而，鮮見(jiàn)關(guān)于小果油茶葉綠體全基因組序列的研究報(bào)道。

‘贛無(wú)1是小果型普通油茶，是較早被選育出來(lái)的江西省良種，結(jié)實(shí)率高，推廣面積較大。與‘三華系列相比，‘贛無(wú)1果實(shí)小，更適宜與小果油茶進(jìn)行比較。本研究中擬組裝出完整的小果油茶和‘贛無(wú)1的葉綠體基因組，通過(guò)進(jìn)行比較基因組學(xué)分析，挖掘普通油茶與小果油茶在葉綠體基因組層面的差異，并基于此開(kāi)發(fā)能夠準(zhǔn)確、便捷鑒定兩者的葉綠體基因分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與葉綠體基因組測(cè)序、組裝及功能注釋

從江西省林業(yè)科學(xué)院山茶園中采集‘贛無(wú)1和小果油茶‘白皮中子的葉片，作為樣品。取待測(cè)樣品干葉片0.02 g，加液氮徹底磨碎，使用新型植物基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN，上海）提取樣本的全基因組DNA。采用將二代測(cè)序平臺(tái)與三代測(cè)序平臺(tái)結(jié)合的方式，獲得普通油茶與小果油茶葉綠體全基因組數(shù)據(jù)。組裝之前，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，將帶有接頭的片段、質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20 的低測(cè)序質(zhì)量數(shù)據(jù)去除。之后根據(jù)二代加三代混合組裝原理，采用以下3 個(gè)步驟進(jìn)行混合組裝：使用SPAdes v3.10.1 軟件[21] 通過(guò)Illumina 和PacBio 數(shù)據(jù)組裝基因組框架；驗(yàn)證組裝結(jié)果，使葉綠體基因組成環(huán)，將gap 補(bǔ)齊；將短讀長(zhǎng)序列重新比對(duì)到組裝好的葉綠體基因組骨架上，糾正錯(cuò)誤堿基，檢查是否存在堿基的插入和刪除。

使用在線質(zhì)體注釋軟件DOGMA[22] 進(jìn)行葉綠體基因組的注釋?zhuān)褂密浖J(rèn)參數(shù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)、tRNA 及rRNA，即“Gene Code for Blastx”設(shè)為“11Plant plastid”，“Percent identity cutoff for protein coding genes”設(shè)為60，“Percent identity cutoff forRNAs”設(shè)為80。5 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG[23]、COG[24]、NR、Swiss-Prot[25] 和GO[26]） 的葉綠體全基因組比對(duì)參數(shù)為E 值不大于1×10-5、最小對(duì)齊長(zhǎng)度百分比不小于40%。使用Organellar Genome DRAWv1.2 軟件[27] 繪制環(huán)狀的葉綠體基因組圖。

1.2 葉綠體基因組序列比較

分析葉綠體基因組序列的結(jié)構(gòu)，利用在線全局比對(duì)軟件EMBOSS 中的Stretcher 進(jìn)行普通油茶和小果油茶的葉綠體全基因組序列比對(duì)。利用在線軟件IRscope 分析葉綠體基因組的LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa、IRa/LSC 4 個(gè)邊界區(qū)域分布情況，以評(píng)估普通油茶和小果油茶葉綠體基因組IR區(qū)的擴(kuò)張和收縮情況。

1.3 葉綠體基因分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證

1.3.1 分子標(biāo)記設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)

基于普通油茶、小果油茶及其近緣種（從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲?。┤~綠體基因組比對(duì)結(jié)果，以普通油茶的葉綠體全基因組序列為參考，針對(duì)葉綠體基因組的變異位點(diǎn)，使用在線軟件primer3 設(shè)計(jì)引物[28]。

1.3.2 PCR 擴(kuò)增、測(cè)序

利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)普通油茶、小果油茶以及其他近源種的DNA，使用耶拿Biometra Tone96G PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行特異性擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系組成為2×FastTaq Premix 10 μL（TOLOBIO， 上海），10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，2 μmol/L的DNA 模板1 μL（反應(yīng)體系模板濃度不宜超過(guò)0.2 μmol/L），ddH2O 7 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性30 s，57 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸90 s，共40 個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃補(bǔ)平10 min，終止溫度為4 ℃。使用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定擴(kuò)增成功后，進(jìn)行一代Sanger 測(cè)序，驗(yàn)證位點(diǎn)作為分子標(biāo)記的潛力。

1.3.3 分子標(biāo)記驗(yàn)證

根據(jù)崔相艷等[29] 基于生態(tài)位模型預(yù)測(cè)的油茶潛在分布區(qū)，從全國(guó)油茶適生區(qū)內(nèi)選取了具有代表性的12 個(gè)區(qū)域的普通油茶居群以及6 個(gè)區(qū)域的小果油茶居群，在每個(gè)居群中隨機(jī)挑選3 株個(gè)體進(jìn)行采樣，居群信息見(jiàn)表1。所有樣本的全基因組DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及凝膠電泳等方法同1.3.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通油茶與小果油茶葉綠體基因組測(cè)序質(zhì)控

使用Illumina Hiseq 2500 平臺(tái)測(cè)序下機(jī)得到6.95 G 原始數(shù)據(jù)，經(jīng)質(zhì)控后得到5.48 G 高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)，讀長(zhǎng)（read）為150 bp。使用Bowtie2 比對(duì)至參考基因組C. sinensis 篩選屬于葉綠體基因組的序列，利用Samtools 軟件計(jì)算得到普通油茶與小果油茶葉綠體基因組測(cè)序平均覆蓋度為103.025 6，Q20 分別為91.73%、97.15%，Q30 分別為86.39%、93.03%，表明該測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到后續(xù)葉綠體基因組研究的要求。三代PacBio 測(cè)序平臺(tái)的質(zhì)控結(jié)果表明，測(cè)得的小果油茶與普通油茶樣品堿基總量達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，N50 均超過(guò)6 400 bp，獲得的讀長(zhǎng)集中分布在3 000 ～ 10 000 bp，測(cè)序質(zhì)量較高，達(dá)到三代組裝要求。

2.2 普通油茶與小果油茶葉綠體基因組特征

普通油茶、小果油茶葉綠體基因組由1 個(gè)環(huán)狀雙鏈DNA 分子構(gòu)成（圖2）。普通油茶與小果油茶的葉綠體基因組之間有一定的差異，序列全長(zhǎng)分別為156 977、156 539 bp。兩者葉綠體基因組呈典型的四分體結(jié)構(gòu)，普通油茶的大單拷貝區(qū)（LSC）和反向重復(fù)區(qū)（IRs）均長(zhǎng)于小果油茶，而小單拷貝區(qū)（SSC）短了82 bp（表2）。兩者的葉綠體基因組基因數(shù)量、編碼基因數(shù)量相同，分別為136、88，但是編碼區(qū)序列長(zhǎng)度及非編碼區(qū)序列長(zhǎng)度有較大差異，普通油茶的序列更長(zhǎng)。rRNA 與tRNA 數(shù)量均保持一致。

利用mVISTA 軟件，對(duì)普通油茶、小果油茶葉綠體基因組進(jìn)行比較分析。兩者葉綠體基因組間擁有高度保守的結(jié)構(gòu)，不存在葉綠體基因組結(jié)構(gòu)上的變異及重組（圖3）。但在部分位點(diǎn)出現(xiàn)了多位點(diǎn)空白現(xiàn)象，其中atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區(qū)存在大片段的缺失，與普通油茶葉綠體全基因組相比，小果油茶存在大片段缺失，缺失片段長(zhǎng)度為452 bp。

2.3 普通油茶與小果油茶葉綠體基因分子鑒定標(biāo)記開(kāi)發(fā)

利用上述缺失的片段和atpH、atpI 基因的保守性，提取普通油茶atpH、atpI 基因及其間隔區(qū)序列，設(shè)計(jì)跨過(guò)這段間隔區(qū)序列的最優(yōu)引物，開(kāi)發(fā)成分子標(biāo)記。設(shè)計(jì)得到最優(yōu)引物對(duì)，F(xiàn)：CTCCCTCTCCTAACCAACCC，R：CCGCGGCTTATATAGGTGAA，退火溫度為57 ℃。經(jīng)測(cè)序，普通油茶‘贛無(wú)1與小果油茶‘白皮中子PCR 產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度分別為609、227 bp。

IR 區(qū)對(duì)葉綠體基因組整體大小及各部件結(jié)構(gòu)起決定性作用。在葉綠體基因組的IR/SSC 邊界部分，假基因ycf1 分別從IRb 延伸到SSC 區(qū)，其中小果油茶為29 bp，普通油茶為1 bp。與普通油茶相比，小果油茶的IR 區(qū)擴(kuò)張了72 bp，其IRa 擴(kuò)張至假基因的5' 端（圖4）。

2.4 普通油茶與小果油茶葉綠體基因分子鑒定標(biāo)記驗(yàn)證

使用上述引物，所有普通油茶與小果油茶樣本的葉綠體基因組均能擴(kuò)增出明亮的條帶（圖5），表明該分子標(biāo)記的穩(wěn)定性較好。所有普通油茶樣本PCR 產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量穩(wěn)定在609 bp 左右。所有小果油茶樣本PCR 產(chǎn)物的電泳條帶排成1 條直線，相對(duì)分子質(zhì)量在227 bp 左右。小果油茶與普通油茶的PCR 產(chǎn)物長(zhǎng)度具有非常顯著的區(qū)別，分子標(biāo)記的可靠性、便捷性較高。

3 結(jié)論與討論

本研究中組裝的普通油茶與小果油茶葉綠體基因組序列全長(zhǎng)分別為156 977、156 539 bp，小果油茶atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區(qū)存在長(zhǎng)度為452 bp 的大片段缺失。根據(jù)缺失片段開(kāi)發(fā)出分子標(biāo)記，使用該分子標(biāo)記能夠穩(wěn)定、便捷、精確地鑒定普通油茶與小果油茶。

3.1 普通油茶與小果油茶葉綠體基因組特征

6 種山茶科植物葉綠體基因組長(zhǎng)度為156 607 ～157 166 bp[30]，本研究中組裝的普通油茶與小果油茶葉綠體基因組序列全長(zhǎng)分別為156 977、156 539 bp，且GC 含量與已測(cè)定的山茶科植物相近。葉綠體基因組的編碼基因數(shù)量和rRNA 基因數(shù)量與海南油茶葉綠體基因組一致，僅tRNA 基因的數(shù)量有細(xì)微差異[19]。這表明普通油茶與小果油茶葉綠體基因組的特征具有高度的保守性。

普通油茶與小果油茶的葉綠體基因組在編碼區(qū)序列長(zhǎng)度及非編碼區(qū)序列長(zhǎng)度方面有一定的差異，普通油茶的序列更長(zhǎng)。影響葉綠體全基因組大小的主要因素是IR 和SSC 邊界區(qū)域的擴(kuò)張和收縮[31]。Yang 等[32] 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，山茶科植物主要是ycf1 基因發(fā)生從IR 區(qū)向SSC 區(qū)擴(kuò)張。本研究結(jié)果表明，小果油茶ycf1 基因向SSC 區(qū)延伸了29 bp，而普通油茶僅為1 bp。陳凱[33] 的研究結(jié)果表明，使用根據(jù)ycf1 基因差異設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記不能區(qū)分普通油茶與小果油茶，其主要原因可能是兩者間擴(kuò)增的差異較小。對(duì)組裝的葉綠體基因組進(jìn)一步比較，結(jié)果表明小果油茶與普通油茶葉綠體基因組差異較大的區(qū)域主要是在atpH 基因與atpI 基因間的非編碼區(qū)，相較于普通油茶，小果油茶在此區(qū)域存在大片段的缺失，長(zhǎng)度為452 bp。本研究中利用該區(qū)域的大片段缺失，設(shè)計(jì)了分子標(biāo)記，用于鑒定普通油茶與小果油茶。葉綠體基因組的這段缺失在丹寨禿茶C. danzaiensis、西南紅山茶C. pitardii、猴子木C. yunnanensis 等物種中也被報(bào)道[34-35]，油茶組中其他近緣物種的葉綠體基因組也存在缺失情況[34]。因此，在使用本研究中所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記時(shí)，應(yīng)先確定所鑒定的物種為普通油茶和小果油茶中的一種。

3.2 普通油茶與小果油茶葉綠體分子標(biāo)記鑒別的可靠性

本研究中選用了大量不同區(qū)域的普通油茶與小果油茶來(lái)驗(yàn)證分子標(biāo)記的可靠性。根據(jù)前人研究結(jié)果選取了油茶適生區(qū)內(nèi)的典型油茶種群，且著重采集了同域分布區(qū)的部分普通油茶與小果油茶種群[36]。普通油茶樣點(diǎn)分布于11 個(gè)省份，小果油茶取自6 個(gè)區(qū)域，涵蓋了大部分油茶的分布區(qū)域。此外，為了進(jìn)一步保證分子標(biāo)記鑒別的準(zhǔn)確性，在每個(gè)樣點(diǎn)選用3 株油茶個(gè)體作為重復(fù)，以排除偶然誤差。以所開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記作為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果表明所有普通油茶葉綠體基因組均可被擴(kuò)增出609 bp 的條帶，小果油茶葉綠體基因組被擴(kuò)增出227 bp 的條帶，兩者具有非常明顯的差異。以往也有利用分子標(biāo)記來(lái)區(qū)分不同油茶品種的報(bào)道，例如韓欣等[37] 運(yùn)用SRAP 標(biāo)記對(duì)贛南油茶良種進(jìn)行鑒別，但存在條帶不清晰且重復(fù)性較差的現(xiàn)象，于小玉等[38] 利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)66 個(gè)油茶品種進(jìn)行鑒別，也出現(xiàn)某些條帶擴(kuò)增效果不明顯的現(xiàn)象，陳永忠等[39] 利用RAPD和李海波等[40] 利用SCAR 分子標(biāo)記鑒別油茶優(yōu)良無(wú)性系，但存在步驟多、操作繁瑣、易受技術(shù)設(shè)備影響等問(wèn)題。相較于已報(bào)道的其他分子標(biāo)記，本研究中開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記能夠清晰鑒別普通油茶與小果油茶，且操作簡(jiǎn)便，鑒定速度快。

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[ 本文編校：聞 麗]