付超 劉凱 張幸 梁國校 江澤鵬 王凌暉

摘 要：【目的】開發(fā)大量SNP 標(biāo)記用于油茶種質(zhì)資源鑒定及其遺傳差異化分析，為廣西優(yōu)良地方油茶種質(zhì)資源的開發(fā)和利用提供依據(jù)?！痉椒ā恳詮V西鳳山中籽茶8 個居群64 份種質(zhì)資源的葉片為供試材料，參考已公布的茶樹Camellia sinensis var.sinensis 基因組進(jìn)行酶切預(yù)測，選擇最適酶切方案，對油茶基因組DNA 酶切構(gòu)建SLAF-seq 文庫，利用SLAF-seq 測序技術(shù)對其進(jìn)行高通量測序、SNP 標(biāo)記開發(fā)及其進(jìn)化關(guān)系分析。【結(jié)果】通過對照組水稻（Oryza sativa）測序數(shù)據(jù)的評估檢測，顯示本次試驗雙端比對效率為95.53%，酶切效率為95.06%，表明SLAF 建庫正常；構(gòu)建SLAF-seq 文庫并進(jìn)行雙端測序，平均測序深度為13.43 x，共獲得207.34 M 的讀長數(shù)據(jù)，測序平均Q30 為88.94%，平均GC 含量為44.85%，共開發(fā)879 284 個SLAF 標(biāo)簽，其中多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽242 892 個，共得到4 565 217 個群體SNP，進(jìn)一步地開發(fā)獲得199 745 個高一致性的SNP 標(biāo)記；基于高一致性SNP 標(biāo)記的遺傳分析結(jié)果表明：可將這廣西鳳山中籽茶8 個居群64 份種質(zhì)劃分為2 個大類群，4個亞類群，每個亞類群均由來源于1 ～ 3 個地方群體種質(zhì)組成?！窘Y(jié)論】本研究表明SLAF-seq 測序技術(shù)可有效用于油茶群體種質(zhì)SNP 標(biāo)記開發(fā)，其標(biāo)記數(shù)量、質(zhì)量及效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于ISSR、SRAP、SSR 等第一、二代分子標(biāo)記技術(shù)；聚類分析表明，遺傳變異多來自于群體內(nèi)，群體間各群各自聚類、地域性相對明顯，其遺傳分化程度與地理距離遠(yuǎn)近呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性。從全基因組范圍開發(fā)的高質(zhì)量SNP 標(biāo)記可進(jìn)一步用于油茶種質(zhì)資源鑒定、連鎖圖譜構(gòu)建以及重要性狀的關(guān)聯(lián)分析等研究。

關(guān)鍵詞：油茶；SNP；SLAF-seq；遺傳分析

中圖分類號：S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）03—0169—07

油茶Camellia oleifera 別名茶油樹、茶子樹，是我國南方特有的優(yōu)質(zhì)食用油料樹種。油茶籽油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)80% 以上，因其組分與橄欖油相似，故有“東方橄欖油”美譽(yù)[1]。同時，油茶籽油富含生育酚、角鯊烯等天然抗氧化劑成分，且能夠降低人體血清中甘油三酯含量而提高有益膽固醇含量，與其他植物油相比，是一種理想的營養(yǎng)保健食用油[2]。我國油茶栽培歷史悠久，主要栽培區(qū)為湖南、江西、廣西、湖北等地。目前，通過國家審定的油茶良種有百余個，如湖南“湘林”系列、“三華”系列，江西“長林”系列、“贛無”系列、廣西“岑軟”系列等[3]。油茶是異花授粉植物，遺傳背景比較復(fù)雜，個體間變異性大，加上普通油茶常為多倍體，這給油茶種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、評價及利用帶來了很大困難[4-5]。

群體遺傳學(xué)是植物遺傳學(xué)研究的重要組成單位。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，其在群體遺傳學(xué)研究中也得以廣泛應(yīng)用，其原理為利用應(yīng)用數(shù)學(xué)和統(tǒng)計學(xué)方法，分析全基因組中大量高準(zhǔn)確的核苷酸變異信息，討論群體遺傳結(jié)構(gòu)、物種形成機(jī)制、基因交流情況和群體進(jìn)化動態(tài)等研究問題，闡述植物進(jìn)化機(jī)制規(guī)律為育種工作提供理論基礎(chǔ)[6-7]。同時，通過全基因組高密度核苷酸的多態(tài)性位點(diǎn)，研究種群間及群體內(nèi)個體的基因交流、突變及自然選擇等遺傳進(jìn)化過程影響機(jī)制，也提供了一種在基因水平上研究群體遺傳學(xué)的新方法。SLAF-seq（Specific-Locus Amplified FragmentSequencing）是以高通量測序為基礎(chǔ)的簡化基因組測序技術(shù)。通過生物信息學(xué)進(jìn)行實驗方案系統(tǒng)設(shè)計，用特定的限制性內(nèi)切酶對基因組進(jìn)行酶切，篩選特異長度的DNA 片段（即SLAF 標(biāo)簽），構(gòu)建SLAF-seq 文庫，測序獲得海量序列數(shù)據(jù)，利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)信息分析，進(jìn)而開發(fā)特異性的分子標(biāo)記（SNP 和InDel）[8]。SLAF-seq 可在短時間內(nèi)以較低的成本實現(xiàn)全基因組范圍的分子標(biāo)記開發(fā)，是目前最熱門的分子標(biāo)記開發(fā)技術(shù)之一。該技術(shù)具有通量高、有效reads 長、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、成本低等特點(diǎn)[9]。

鳳山中籽茶C. oleifera of Fengshan，也稱鳳山中果茶，泛指廣西鳳山縣境分布的有一定栽培歷史的一類普通油茶實生林。鳳山中籽茶農(nóng)家種質(zhì)作為廣西油茶種質(zhì)資源的重要組成部分之一，因其對當(dāng)?shù)卦耘喹h(huán)境具有較好的適應(yīng)性和抗逆性，加之其具有果實皮薄、籽粒大等優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀，且適宜當(dāng)?shù)囟钙侣涞負(fù)熳炎鳂I(yè)習(xí)慣，深得當(dāng)?shù)胤N植戶青睞。但這一區(qū)域的油茶特色地方優(yōu)良種質(zhì)資源長期處于自然放縱狀態(tài)，至今尚未得到有效研發(fā)和利用，長期缺乏地方良種支撐，一定程度制約了當(dāng)?shù)赜筒璁a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。應(yīng)立足當(dāng)?shù)赜筒栀Y源，開展區(qū)域性特色地方種質(zhì)遺傳多樣性研究，是充分發(fā)揮我區(qū)現(xiàn)有油茶優(yōu)良種質(zhì)資源優(yōu)勢，促進(jìn)油茶產(chǎn)業(yè)良種化健康發(fā)展的需要，也是一項迫在眉睫的良種改造工程。本研究以廣西鳳山中籽茶8 個居群64 份種質(zhì)為供試材料，采用SLAF-seq技術(shù)，獲取大量多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽，進(jìn)而開發(fā)出一批高一致性的SNP 位點(diǎn)，并對鳳山中籽茶開展遺傳多樣性分析，探索其遺傳進(jìn)化歷程、生存狀況，為下一步鳳山中籽茶核心種質(zhì)保護(hù)及優(yōu)異形狀選育利用等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究選用廣西鳳山中籽茶8 個居群64 份種質(zhì)，分別為廣西鳳山縣喬音、砦牙、長洲、金牙、中亭、平樂、江州、袍里等8 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的居群；從每個居群中分別選擇8 個單株作為樣株，樣株選擇隔離采樣，每隔500 m 選擇一株，分別采取無病蟲害的嫩葉片，-70 ℃保存?zhèn)溆?。每個品系按照1 ～ 8 進(jìn)行編號（基本信息見表1）。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 提取及質(zhì)量檢測

采用改良CTAB 法提取供試64 份油茶種質(zhì)的葉片gDNA，以瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測DNA 的完整性、純度及濃度，油茶gDNA 檢測合格后，可供后續(xù)試驗。

1.2.2 酶切建庫及高通量測序

目前，尚未見到普通油茶全基因組序列信息公布，無法直接通過其基因組信息選擇最優(yōu)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，故需一個已公布基因組信息的油茶近緣物種作為參考基因組，通過在線電子酶軟件（SLAF-predict）預(yù)測篩選出合適的限制性內(nèi)切酶及酶切方案。茶樹C. sinensis var.sinensis 是山茶科山茶屬植物，為油茶近緣種，且已公布全基因組序列信息（http：//tpia.teaplant.org/index.html，基因組大小為3.1 Gb，GC 含量為42.3%），故可選擇茶樹基因組作為酶切參考，篩選最適限制性內(nèi)切酶及酶切方案，并對油茶基因組DNA 進(jìn)行酶切。將獲得的所有酶切片段（SLAF標(biāo)簽）進(jìn)行3 末端加A 尾巴處理、連接專用測序接頭、PCR 擴(kuò)增、純化、混樣、切膠、回收目的片段，質(zhì)檢合格后的SLAF 文庫用于IlluminaHiSeqTM 高通量測序。

為評估供試油茶酶切實驗的準(zhǔn)確性，選取以水稻O. sativa 作為對照同時進(jìn)行測序檢測驗證。利用Dual-index 軟件識別高通量測序獲得的所有原始數(shù)據(jù)，得到各個樣品所有的讀長（reads），并過濾測序所有reads 的接頭、低質(zhì)量閱讀框和去污染處理，進(jìn)行堿基含量分布值（GC 含量）和測序質(zhì)量值（Q30）分析，以此保證所有供試樣品的測序質(zhì)量及數(shù)據(jù)量。最后利用SOAP 軟件[10] 將對照（水稻）的測序reads 與已公布的水稻組（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）進(jìn)行比對，進(jìn)行酶切效率評估，得以判斷整個實驗酶切測序過程的準(zhǔn)確性和有效性。

1.2.3 油茶特異性SNP 位點(diǎn)的開發(fā)及其遺傳分析

根據(jù)過濾去除獲得的所有原始測序reads 序列相似性，將各樣品測序產(chǎn)生的reads 分別進(jìn)行聚類，所有供試樣品中聚類到一起的reads 均來自于同一個SLAF 片段（SLAF 標(biāo)簽）；不同樣品間的同一個SLAF 標(biāo)簽在序列有堿基差異、缺失（即有多態(tài)性），即定義為多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽。開發(fā)SNP 標(biāo)記是以深度最高的每個SLAF 標(biāo)簽序列類型作為參考序列，利用BWA[11] 軟件技術(shù)將測序得到的reads 比對到參考序列上，再使用GATK[12] 和samtools[13] 兩種軟件分析方法分別開發(fā)SNP，最終以兩種方法得到的交集SNP 標(biāo)記作為可靠的SNP標(biāo)記。通過MEGA 6.0 軟件，采用neighbor-joining算法，對所有供試樣株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。同時，利用cluster 軟件，設(shè)置第一、第二、第三主成分，進(jìn)行主成分分析（Principalcomponent analysis，PCA），得到所有供試樣品的主成分聚類信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 建庫評估

酶切成功與否是直接影響后續(xù)測序及分析實驗成功的關(guān)鍵指標(biāo)之一。利用SLAF-predict 軟件，通過對茶樹參考基因組進(jìn)行電子酶切來預(yù)測，最終確定選取Hae Ⅲ為限制性內(nèi)切酶；對酶切片段的進(jìn)一步分析表明，獲得的茶樹基因組酶切片段基本上均勻分布其基因組上，且在重復(fù)序列區(qū)中的標(biāo)簽占比較少，并把篩選出長度在414 ～ 464 bp的酶切片段序列界定為SLAF 標(biāo)簽，預(yù)測共獲得130 019 個SLAF 標(biāo)簽。為進(jìn)一步評價酶切方案的可靠性與酶切效率，以評估監(jiān)控水稻（對照）測序數(shù)據(jù)的實驗過程正常與否，確定酶切方案實施的可靠性與酶切效率。通過SOAP 軟件將水稻的測序reads 與已公布的水稻組（http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/）進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，水稻雙端比對效率為95.53%，酶切效率為95.06%，表明SLAF建庫正常。

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估

為保證數(shù)據(jù)分析質(zhì)量，本研究采用讀長（reads）125 bp×2 作為后續(xù)的數(shù)據(jù)評估和分析。經(jīng)過Illumina HiSeqTM 高通量測序平臺對所有供試樣品64 份油茶及對照水稻進(jìn)行測序，共獲得207.34 Mreads 數(shù)據(jù)，對照水稻的數(shù)據(jù)量為0.15 M reads；64 份油茶樣品測序獲得的數(shù)據(jù)量在1.27 ～ 6.07 Mreads 之間，GLPT-3 獲得的數(shù)據(jù)量最小為1.27M reads，SJ-7 獲得的數(shù)據(jù)量最大為6.07 M reads（圖1A）。GC 含量在43.24% ～ 46.43% 之間，所有供試樣品測序的平均GC 含量為44.85%（圖1B），說明達(dá)到了測序要求。

在測序識別過程中，每個堿基都會有1 個測序質(zhì)量值（Q），其是衡量高通量測序中堿基識別是否正確的重要指標(biāo)，以此便于衡量此堿基被識別的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，該值越高表明堿基測序錯誤率越低；如果堿基的測序出錯的概率為1‰，則其該堿基的質(zhì)量值Q 為30，所以一般將測序質(zhì)量值（Q）大于等于30（Q30）作為測序結(jié)果較為可靠的標(biāo)準(zhǔn)。本研究64 份油茶樣本的Q30 在85.93% ～ 92.03% 之間，所有樣品測序平均Q30達(dá)到88.94%（圖1B），說明測序錯誤率較低，測序數(shù)據(jù)良好并可用于下一步分析。

2.3 SLAF 標(biāo)簽與特異性SNP 位點(diǎn)開發(fā)

所有供試樣本共獲得879 284 個SLAF 標(biāo)簽， 其中，242 892 個多態(tài)性SLAF 標(biāo)簽， 占開發(fā)SLAF 標(biāo)簽總數(shù)的27.6%，每個供試樣品平均得到141 067 個SLAF 標(biāo)簽，樣本平均測序深度為13.43 x，（ 圖1C—D）。采用GATK 和samtools兩種軟件分別開發(fā)SNP，以兩種方法獲得的交集SNP 標(biāo)記作為最終可靠的SNP 標(biāo)記，本研究共獲得4 565 217 個群體SNP；SNP 的雜合率在10.81% ～ 33.51% 之間， 完整度在48.28% ～98.15% 之間；根據(jù)完整度＞ 0.8，最小等位基因頻率（MAF）＞ 0.05 過濾，共得到199 745 個高一致性的廣西鳳山中籽茶群體SNP（圖1E—F）。

2.4 遺傳進(jìn)化分析

基于獲得的199 745 個高一致性的廣西鳳山中籽茶群體SNP， 通過MEGA 6.0 軟件， 采用neighbor-joining 算法，對廣西鳳山中籽茶8 個居群64 份種質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析，構(gòu)建其進(jìn)化樹。聚類結(jié)果表明，可將64 份油茶種質(zhì)劃分為兩個大類群，繼續(xù)細(xì)分可分為A、B、C、D 這4 個亞類群（圖2），第一大類群只包含A 亞類群，由廣西鳳山縣喬音鄉(xiāng)（DL）、長洲鎮(zhèn)（FS）、砦牙鄉(xiāng)（CX）3 個居群組成；第二大類群包含B、C、D 三個亞類群，由廣西鳳山縣平樂鄉(xiāng)（TY）、中亭鄉(xiāng)（SJ）、江洲鄉(xiāng)（GLPT）、袍里鄉(xiāng)（LP）、金牙鄉(xiāng)（SMI）5 個居群組成。亞群A、B 和D 中均在不同地理來源的種群，說明對應(yīng)亞群內(nèi)部的居群親緣關(guān)系較近，但第一大類群（TY，DL，F(xiàn)S）中3 個居群和第二大類群5 個居群（CX，GLPT，LP，SJ，SMJ）的個體間無交叉聚類的現(xiàn)象，說明兩個大類群的居群遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)一步結(jié)合居群地理信息發(fā)現(xiàn)，第一大類居群均來自廣西鳳山縣西南部，第二大類居群均來自廣西鳳山縣的東北部，由此可見，不同地理來源的居群與其遺傳分化情況一致。

2.5 PCA 分析

主成分分析（PCA，principal component analysis）是一種利用線性代數(shù)方法，把多個變量變?yōu)樯贁?shù)幾個綜合變量數(shù)據(jù)，相對全面地體現(xiàn)出整個數(shù)據(jù)量特征，進(jìn)行由繁到簡的降維研究方法。我們把這些所謂的綜合變量稱為主成分，幾個主成分之間彼此不相關(guān)，也就說明他們之間含有不重復(fù)的信息?；谝陨虾Y選獲得的SNP，通過cluster 軟件，分別設(shè)置3 個變量為主成分代表，對所有64份供試油茶種質(zhì)進(jìn)行主成分分析，由此得到一個三維的聚類圖（圖3）。結(jié)果顯示廣西鳳山中籽茶居群內(nèi)的個體相對集中于一個層面，居群間存在一定程度的群體分層，部分居群間個體少量互有混雜，暗示廣西鳳山縣境內(nèi)的不同居群的中籽茶可能由于距離、時間、小氣候等因素產(chǎn)生的一定差異，同時也一定程度上保留部分共有基因、性狀。PCA 分析與遺傳進(jìn)化聚類結(jié)果較一致。

3 討 論

SLAF-seq 技術(shù)是一種基于高通量測序技術(shù)，在沒有供試物種全基因組序列信息的前提下，通過對供試物種一定數(shù)量的個體進(jìn)行簡化基因組測序，從而獲取該物種基因組中相對多的特異DNA 序列，用以開發(fā)大量的特異SNP 標(biāo)記，并可與前期的重要農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析，以實現(xiàn)候選功能區(qū)域的精細(xì)定位。SLAF-seq 技術(shù)因具有高通量、高效率、高準(zhǔn)確率、成本低等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用在小麥、棉花、白菜、黃瓜等多個物種的研究中[14-16]。

相對于RAPD、SRAP、ISSR、SSR 等第一、二代分子標(biāo)記均是依賴于電泳檢測的分析技術(shù)，PCR 擴(kuò)增過程以及條帶讀取受人為因素以及環(huán)境的影響較大，高通量樣本分析工作量大，而且這些標(biāo)記在基因組中呈現(xiàn)不均勻分布，油茶為異花授粉植物，不同種質(zhì)的雜合度高，遺傳背景復(fù)雜，已開發(fā)的油茶分子標(biāo)記數(shù)量極為有限，因此，難以全面、準(zhǔn)確地反映油茶群體的遺傳多樣性，這也限制了優(yōu)良油茶種質(zhì)資源的開發(fā)和利用。

酶切是直接影響后續(xù)測序及分析關(guān)鍵指標(biāo)，故SLAF-seq 測序前應(yīng)先進(jìn)行酶切預(yù)測，先酶切預(yù)測供試物種近緣物種基因組，其原理是借用酶切參考基組與供試物種實際參考基因組的大小比例對開發(fā)得到的標(biāo)簽數(shù)目進(jìn)行換算。油茶為異花授粉植物、雜合度高、遺傳背景復(fù)雜，目前尚無可參考基因組，所以根據(jù)預(yù)測的普通油茶基因組大小以及GC 含量等信息（實際基因組大小約為2.94Gb，GC 含量為44.85%），最終選取茶樹（組裝出的基因組大小為3.1 Gb，GC 含量為42.30%）基因組作為酶切參考基因組；為評估酶切實驗的準(zhǔn)確性，選用水稻作進(jìn)行測序?qū)φ眨Y(jié)果顯示水稻雙端比對效率為95.53%，酶切成功效率為95.06%，表明SLAF 建庫正常，表明選用茶樹基因組作為參考基因組進(jìn)行酶切預(yù)測是可行的。SLAF-seq 自開發(fā)以來已廣泛地應(yīng)用于動植物高密度遺傳連鎖圖譜構(gòu)建、QTL 定位、群體遺傳學(xué)分析等研究中并取得了良好的效果[17-21]。盡管前人開發(fā)了大量的DNA 分子標(biāo)記對油茶群體種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性及差異化分析，包括RAPD、SRAP、ISSR、SSR 等分子標(biāo)記[22-27]。但由于第一、二代分子標(biāo)記均是使用電泳檢測分離技術(shù)，辨別度和靈敏度不高，大量樣本分析比較繁雜，而且這些標(biāo)記在基因組中的分布不均勻，難以全面、準(zhǔn)確地反映油茶群體的遺傳多樣性。

廣西鳳山中籽茶原始野生種質(zhì)資源長期未得到有效保護(hù)，并缺乏有效經(jīng)營管護(hù)措施，加之居群內(nèi)植株樹齡偏大（50 ～ 60 a）、且前期植株密度過大造成樹體畸形、老化嚴(yán)重，導(dǎo)致其原始自然分布居群數(shù)較少、居群內(nèi)正常發(fā)育單株極少，造成本研究供試材料的居群內(nèi)植株選取的基數(shù)偏少（每個居群內(nèi)8 株）。但在有限的供試材料選取采集過程中，嚴(yán)格把控選取供試材料質(zhì)量（如：植株間距離、樹齡相對一致、無病蟲害、葉片完整度、種實數(shù)量等因素），最大限度地體現(xiàn)廣西鳳山中籽茶種質(zhì)資源遺傳分化深度及廣度。本研究基于SLAF-seq 技術(shù)對廣西鳳山中籽茶8 個居群64 份種質(zhì)進(jìn)行SNP 標(biāo)記開發(fā)及差異化分析，獲得的有效標(biāo)記信息豐富，遠(yuǎn)超過以往研究油茶種質(zhì)標(biāo)記開發(fā)數(shù)量總和。因此，油茶全基因組范圍內(nèi)的分子標(biāo)記開發(fā)與利用顯得尤為重要。

4 結(jié) 論

本研究首次從DNA 水平上對廣西鳳山中籽茶開展了遺傳多樣性研究工作，并獲得了199 745 個高一致性的SNP 標(biāo)記位點(diǎn)，進(jìn)一步表明SLAF-seq測序技術(shù)可有效用于油茶群體種質(zhì)SNP標(biāo)記開發(fā)，且標(biāo)記數(shù)量、質(zhì)量及效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于ISSR、SRAP、SSR 等第一、二代分子標(biāo)記技術(shù)。鳳山中籽茶群體遺傳聚類分析表明，廣西鳳山縣境內(nèi)的不同居群的中籽茶可能由于距離、時間、小氣候等因素產(chǎn)生的一定差異，同時也一定程度上保留部分共有基因、性狀；其遺傳變異多來自于居群內(nèi)，居群間各群各自聚類、區(qū)域性相對明顯，其遺傳分化程度與地理距離遠(yuǎn)近呈現(xiàn)正相關(guān)性。本研究基于簡化基因組技術(shù)開發(fā)出的大量鳳山中籽茶群體SNP 標(biāo)記，可為下一步油茶種質(zhì)優(yōu)異性狀QTL 定位及輔助育種奠定基礎(chǔ)，為廣西其他特色地方品種的相關(guān)研究提供有益的參考。

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[ 本文編校：李義華]