張美玲 張俊環(huán) 殷麗麗 楊麗 姜鳳超 于文劍 王玉柱 孫浩元

摘 要：【目的】苦杏仁苷是形成杏仁苦味的主要物質(zhì)，細(xì)胞色素P450 基因CYP79 是苦杏仁苷合成路徑上的重要基因，研究調(diào)控CYP79 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子對進(jìn)一步闡明杏仁中苦杏仁苷合成與調(diào)控機(jī)制具有重要意義?！痉椒ā恳浴t‘駱駝黃杏仁不同發(fā)育時(shí)期的種皮和子葉為試驗(yàn)材料，構(gòu)建杏仁cDNA 文庫。對杏中PaCYP79 啟動(dòng)子上順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，并利用重組的誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 對杏仁cDNA 酵母文庫進(jìn)行篩選，結(jié)合酵母單雜交實(shí)驗(yàn)，鑒定PaCYP79 啟動(dòng)子可能的上游調(diào)控因子?！窘Y(jié)果】對PaCYP79 啟動(dòng)子順式作用元件分析表明，PaCYP79 啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)植物的組成型核心啟動(dòng)子順式作用元件，還含有ABA、赤霉素、茉莉酸等多種植物激素和環(huán)境脅迫的響應(yīng)元件，參與分生組織發(fā)育及種子特異調(diào)控等順式作用元件。成功構(gòu)建杏仁cDNA 酵母文庫，庫容為1.2×107 CFU，平均插入片段大于1 000 bp，文庫的重組率為100%。酵母文庫篩選結(jié)果經(jīng)測序和Blast 同源性分析，獲得10 個(gè)互作蛋白，其中包括淀粉樣蛋白聚集和蛋白毒性的正調(diào)控相關(guān)的蛋白（small EDRK-rich factor 2），與種子發(fā)育和隨后的萌發(fā)調(diào)控相關(guān)的蛋白（seed biotin-containing proteinSBP65），參與控制纖維素微原纖維定向沉積調(diào)控的類動(dòng)力蛋白（kinesin-like protein KIN-4C），60S 核糖體蛋白L19-2（PREDICTED： 60S ribosomal protein L19-2），聚腺苷結(jié)合蛋白2 亞型X1（polyadenylate-binding protein2 isoform X1），以及5 個(gè)未知功能的蛋白。酵母單雜交進(jìn)一步證實(shí)這10 個(gè)蛋白能與PaCYP79 基因啟動(dòng)子結(jié)合?！窘Y(jié)論】本研究成功構(gòu)建了高質(zhì)量的杏仁cDNA 酵母文庫，并利用酵母單雜交技術(shù)在酵母文庫中篩選并驗(yàn)證了10 個(gè)與PaCYP79 啟動(dòng)子互作的蛋白。這些互作蛋白的篩選為深入研究杏仁中苦杏仁苷的合成與調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：杏仁；酵母cDNA 文庫；酵母單雜交；互作蛋白；PaCYP79 啟動(dòng)子

中圖分類號：S662.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）03—0057—13

杏Prunus armeniaca L. 是原產(chǎn)于中國的重要果樹樹種[1]。其種子—杏仁有甜、苦之分，甜杏仁富含蛋白質(zhì)（其含量為23% ～ 27%）、不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)，可加工成杏仁油、杏仁露等多種食品[2-4]?？嘈尤蕜t是我國傳統(tǒng)的中藥材，具有鎮(zhèn)咳、平喘、抗炎、鎮(zhèn)痛等功效，被廣泛應(yīng)用于止咳潤肺，散寒宣肺等功效中成藥的研制[5]。甜/ 苦杏仁中苦杏仁苷含量差異顯著，其含量變異幅度0.002 ～ 3.778 mg/g[6]。苦杏仁苷是一種生氰糖苷，主要存在于扁桃、桃、杏、李、櫻桃等薔薇科植物中，是形成種子苦味的主要物質(zhì)?？嘈尤受者€是維生素B17 的主要功效成分，因其具有祛痰和治療癌癥的功效而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)[7]。

關(guān)于苦杏仁苷的研究目前主要集中在對其提取純化效率、分析檢測技術(shù)的研發(fā)和提升、苦杏仁苷安全控制及生物活性等[8-10]。而關(guān)于杏仁中苦杏仁苷合成路徑蛋白質(zhì)互作機(jī)制及調(diào)控因子篩選的深入研究仍然較少見，僅在扁桃、梅等物種中苦杏仁苷合成相關(guān)基因的挖掘及功能鑒定取得了一些進(jìn)展。在扁桃中，前體苯丙氨酸首先在2個(gè)細(xì)胞色素P450 單加氧酶CYP79 和CYP71 的催化下，合成扁桃腈（Mandelonitrile），之后在二磷酸尿苷葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶GT1（UDP-glucuronidetransferases，GT） 的作用下生成洋李苷， 再經(jīng)GT2 催化形成苦杏仁苷；同時(shí)，苦杏仁苷在苦杏仁苷水解酶（Amygdalin hydrolases，AH）和李苷水解酶（Prunasin hydrolases，PH）的催化下可進(jìn)行分解轉(zhuǎn)化[11-12]。扁桃腈裂解酶（Mandelonitrilelyase，MDL）可間接地競爭性催化洋李苷底物扁桃腈，從而影響苦杏仁苷的合成 [13]。苦杏仁苷在種皮中合成。位于起始位置2 個(gè)細(xì)胞色素P450 基因PdCYP79 和PdCYP71 在甜仁種皮呈現(xiàn)低表達(dá)[14]，是扁桃中苦杏仁苷合成的重要限速酶。李苷水解酶（PH）參與了苦杏仁苷及洋李苷的降解代謝，且PH 蛋白可在種仁不同發(fā)育時(shí)期的質(zhì)外體和共質(zhì)體之間產(chǎn)生移動(dòng)[15-17]。CYP79 作為苦杏仁苷合成的起始限速酶，已經(jīng)在多個(gè)物種中克隆。Yamaguchi 等[18] 鑒定了梅（Prunus mume） 中的苦杏仁苷合成代謝起始步驟的細(xì)胞色素P450 酶CYP79s 和CYP71s，利用RNA 測序數(shù)據(jù)，克隆獲得了編碼CYP79s 和CYP71s 的全長cDNA 序列。對梅的不同組織中CYP79s 和CYP71s 的表達(dá)和酶活檢測顯示，CYP79D16 和CYP71AN24 在幼苗中呈現(xiàn)高表達(dá)，并在調(diào)控生氰糖苷的合成中起關(guān)鍵調(diào)控作用[18]。

杏仁資源的深加工和綜合利用及杏仁的遺傳改良一直備受重視[5， 19]。杏仁不僅具有豐富的營養(yǎng)應(yīng)用于食品加工，還因其含有重要活性物質(zhì)苦杏仁苷（Amygdalin）被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)[5]。調(diào)控苦杏仁苷含量一直是杏遺傳改良研究的重要目標(biāo)和方向之一，一方面，作為食品利用，要求盡量降低甚至清除杏仁中的苦杏仁苷，以消除杏仁的苦味和致毒性（苦杏仁苷是決定杏仁苦味性狀形成的關(guān)鍵物質(zhì)并具有一定的毒性）并免除加工過程中的脫苦程序；另一方面，作為藥用原材料，則需要盡量提高苦杏仁苷的含量[20]。自1978年Kostina[21] 研究發(fā)現(xiàn)杏仁的苦味是受一對等位基因控制的質(zhì)量性狀以來，國內(nèi)外在杏仁苦味性狀的遺傳規(guī)律、基因型鑒定、苦杏仁苷含量在品種資源中的變異等方面取得了一定進(jìn)展。陳學(xué)森等[22]、Negri 等[23] 利用杏雜種一代群體分析了杏仁苦味性狀的遺傳規(guī)律。Cervellati 等[24] 對杏仁苦杏仁苷進(jìn)行了qNMR 檢測分析及QTL 定位。Liu等[25] 利用SSR 及ISSR 分子標(biāo)記對甜仁杏進(jìn)行了遺傳多樣性分析。黃雪等[6]、Karsavuran 等[26] 分別調(diào)查了國內(nèi)、國外不同杏品種資源的苦杏仁苷的含量。然而，長久以來人們對于杏仁中苦杏仁苷的合成和調(diào)控機(jī)制知之甚少，極大地制約了此方面的杏育種進(jìn)程和生產(chǎn)應(yīng)用。

酵母單雜交技術(shù)是分析蛋白與基因之間互作的一種有效實(shí)驗(yàn)手段，現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能基因組學(xué)等領(lǐng)域[27]。利用特異誘餌基因篩選種仁發(fā)育時(shí)期的酵母cDNA文庫中互作的轉(zhuǎn)錄因子，將為我們研究苦杏仁苷合成路徑、建立蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供更多有益信息[28]。本研究首先構(gòu)建杏仁不同發(fā)育時(shí)期的種皮和種仁的酵母cDNA 文庫。利用杏基因組數(shù)據(jù)克隆獲得杏仁中苦杏仁苷合成關(guān)鍵基因PaCYP79的啟動(dòng)子，并構(gòu)建誘餌載體，結(jié)合酵母單雜交技術(shù)篩選PaCYP79 的上游調(diào)控因子，以期為闡明PaCYP79 調(diào)控機(jī)制、揭示杏仁苦味形成的分子機(jī)制提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料、載體與試劑

試驗(yàn)材料‘串枝紅（苦仁品種）和‘駱駝黃（甜仁品種）不同發(fā)育時(shí)期的樣品取自北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹研究所杏資源圃。根據(jù)杏仁發(fā)育形態(tài)分為4 個(gè)時(shí)期：Ⅰ - 胚乳發(fā)育期（種皮內(nèi)的胚乳為液態(tài)，未形成子葉），Ⅱ - 子葉發(fā)育初期（種皮內(nèi)大部分為液體形態(tài)的胚乳，在種仁的尖端形成少部分固態(tài)的子葉），Ⅲ - 子葉發(fā)育完成期（種皮內(nèi)無液態(tài)的胚乳，已完全形成子葉，但種皮還未纖維化，仍為白色且較厚），Ⅳ - 杏仁發(fā)育成熟期（種皮顏色變深并纖維化成薄薄的一層，種仁達(dá)到成熟階段）。在種仁發(fā)育階段，采集‘串枝紅‘駱駝黃Ⅰ、Ⅱ時(shí)期的種皮、Ⅲ時(shí)期的種皮和子葉、Ⅳ時(shí)期的子葉，共計(jì)10 個(gè)樣品，每個(gè)樣品3 次重復(fù)，切成小塊，立即放入液氮中速凍，存于-80 ℃冰箱，用于后續(xù)RNA 提取及酵母文庫構(gòu)建。在新葉生長期，采集幼嫩葉片用于后續(xù)DNA 提取及基因啟動(dòng)子克隆。

試驗(yàn)中涉及的RNA 提?。═rizol）、純化（Oligotex mRNA Midi Kit）、cDNA 反轉(zhuǎn)錄、質(zhì)粒提取等所需的各類試劑購自Invitrogen 和Qiagen 公司。酵母文庫構(gòu)建中所用載體pAbAi及pGADT7、酵母菌株Y187、酵母單雜交菌株Y1HGold由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。載體構(gòu)建所需要的引物合成和測序由生工生物公司和華大基因完成。用于酵母自激活抑制的金擔(dān)子素A、酵母培養(yǎng)所需的各類培養(yǎng)基購自Clontech公司，各種工具酶、Marker 購自TaKaRa 公司。其他常規(guī)試劑耗材購自北京欣匯天東方科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 杏仁總RNA 的提取與mRNA 的分離純化

采用Trizol 法提取‘串枝紅‘駱駝黃杏仁不同發(fā)育時(shí)期種皮及子葉的RNA，經(jīng)Qiagen 的純化試劑盒分離純化mRNA，利用電泳觀察特征條帶后，將10 個(gè)樣品等比例混合形成混樣，利用NanoDrop 微量分光光度計(jì)檢測混合純化產(chǎn)物的OD 值和RIN 值。

1.2.2 杏仁核體系酵母cDNA 文庫的構(gòu)建

采用Gateway 位點(diǎn)特異性重組技術(shù)， 參照Cloneminer cDNA library construction kit 試劑盒說明書進(jìn)行杏仁核體系酵母cDNA 文庫構(gòu)建。將分離純化得到mRNA，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA（dscDNA），經(jīng)連接重組反應(yīng)后，獲得4 mL 初級文庫菌液。提取初級文庫質(zhì)粒，稀釋濃度到300 ng/μL后再經(jīng)重組反應(yīng)獲得次級文庫。篩庫時(shí)，活化擴(kuò)繁酵母次級文庫，并提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞Y187 中進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 酵母初級、次級文庫的質(zhì)量鑒定

參照趙彩良等[29] 的方法對構(gòu)建的酵母初級文庫和次級文庫進(jìn)行質(zhì)量鑒定。將酵母初級文庫、次級文庫菌液各10 μL 稀釋100 倍后，取其中50 μL 涂布在含卡那霉素（濃度：50 μg·mL-1）的LB 固體培養(yǎng)基上，對平板上長出的單克隆進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算庫容量和總庫容。計(jì)算公式為：庫容量= 單克隆數(shù)/ 涂布體積× 稀釋倍數(shù)= 單克隆數(shù)/50 μL×100×1 000（CFU·mL-1），4 mL 文庫菌液的總庫容= 庫容量× 總體積= 庫容量×4（CFU）。同時(shí)，對初級文庫和次級文庫隨機(jī)挑取24 個(gè)單克隆， 利用通用引物M13，pGADT7分別進(jìn)行擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳后鑒定文庫質(zhì)量。初級文庫鑒定引物（M13通用引物，F(xiàn)：GTAAAACGACGGCCAG，R：CAGGAAACAGCTATGAC），次級文庫鑒定引物（pGADT7-DEST 載體引物，F(xiàn)：TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG，R：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT）。

1.2.4PaCYP79 啟動(dòng)子的克隆與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 的構(gòu)建

PaCYP79 啟動(dòng)子序列選取杏基因組中PaCYP79（NCBI 中PaCYP79 基因登錄號：OL321787） 基因起始密碼子上游1 674 bp。根據(jù)所提取的序列設(shè)計(jì)PaCYP79 啟動(dòng)子的擴(kuò)增引物（CYP79-Pro-F：ACAATGATCAGTGCAAGATTTG；CYP79-Pro-R：GACTGCACGAGTAGAAAA）。提取杏基因組DNA，克隆得到PaCYP79基因的啟動(dòng)子并測序。利用啟動(dòng)子分析在線軟件PlantCARE（網(wǎng)址：http：//bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測該啟動(dòng)子序列上的順式作用元件。

采用雙酶切的方法構(gòu)建誘餌載體pAbAi-PaCYP79p。誘餌序列（PaCYP79 啟動(dòng)子）兩端加入酶切位點(diǎn)Sal I 和Xho I。用Sal I 和Xho I 雙酶切pAbAi 質(zhì)粒，得到純化的線性化pAbAi 片段后與加了酶切位點(diǎn)的PaCYP79 啟動(dòng)子片段進(jìn)行連接反應(yīng)，經(jīng)氨芐青霉素（濃度：100 μg·mL-1）的抗性篩選，獲得陽性單克隆。經(jīng)Sal I 和Xho I雙酶切和測序驗(yàn)證（測序引物F：GTTCCTTATATGTAGCTTTCGACAT），獲得構(gòu)建好的誘餌載體pAbAi-PaCYP79p。

1.2.5 誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 轉(zhuǎn)化Y1HGold酵母菌株

采用LiAC/PEG 法將誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 轉(zhuǎn)化到酵母Y1HGold 菌株中（方法參照Clontech 產(chǎn)品說明書）。用Bst BI 酶對誘餌質(zhì)粒pAbAi-PaCYP79p 進(jìn)行單酶切，并純化酶切產(chǎn)物。取1 μg 線性化誘餌質(zhì)粒pAbAi-PaCYP79p 轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)Y1HGold 中，并在SD/-Ura 缺陷培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 ～ 3 d 后進(jìn)行篩選，利用PCR 鑒定轉(zhuǎn)化成功的陽性單克隆。

1.2.6 金擔(dān)子素（Aureobasidin A， AbA） 抗性篩選

參照余婧等[30] 的方法，對實(shí)驗(yàn)中需要的ABA抗性進(jìn)行篩選和確定。將500 μL 轉(zhuǎn)化成功的含有pAbAi-PaCYP79p 的陽性Y1HGold 菌液，稀釋至濃度達(dá)到OD600=0.002 時(shí)，涂布到含有不同濃度梯度的AbA的SD/-Ura 平板上，AbA濃度分別為0，100，150，200，300，500，700，900 ng/mL。觀察不同平板上單克隆的生長狀況，如果在某個(gè)濃度下陽性克隆的自激活可得到抑制，無法正常生長，則可以確定該AbA 濃度及以上可以用于后續(xù)篩選試驗(yàn)。

1.2.7 杏仁cDNA 酵母文庫的篩選

參照Clontech 公司的MatchmakerTM LibraryConstruction&Screening Kit 試劑盒說明書，對杏仁cDNA 酵母文庫進(jìn)行篩選。取10 μg 酵母文庫質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到1.2.5 含有誘餌載體pAbAi-PaCYP79p的Y1HGold 酵母菌液中，按照10、102、103 倍稀釋后，涂布于SD/-Leu 缺陷培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，統(tǒng)計(jì)平板上單克隆數(shù)，計(jì)算酵母文庫篩選總克隆數(shù)CFU=[ 平板上單克隆數(shù)]×[ 稀釋倍數(shù)]×[ 重懸體積（6 mL）]，酵母文庫轉(zhuǎn)化效率CFU/μg=文庫總克隆數(shù)/ 酵母文庫質(zhì)量（10 μg）。剩余菌液涂布于SD/-Leu/AbA（AbA 添加量為1.2.6 中篩選的濃度） 平板， 待SD/-Leu/AbA 平板長出單克隆后，初篩完成。將初篩板上長出的陽性克隆再次轉(zhuǎn)移到SD/-Leu/AbA 平板上， 進(jìn)行二次篩選。挑取單菌落進(jìn)行PCR 鑒定（T7 通用引物，F(xiàn)：TAATACGACTCACTATAGGGC 和R：GTAGATGGTGCACGATGCACAG）， 測序獲得將陽性克隆的序列，通過uniprot（網(wǎng)址：https：//www.uniprot.org/）和NCBI 數(shù)據(jù)庫（網(wǎng)址：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取該序列的注釋信息和蛋白功能預(yù)測。

1.2.8 篩選陽性克隆與誘餌載體單雜交驗(yàn)證

將1.2.7 中獲得的陽性克隆的酵母質(zhì)粒DNA與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 共轉(zhuǎn)Y1HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布在SD/-Leu/AbA 篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行酵母單雜交驗(yàn)證（抗性篩選板的AbA 添加量不低于1.2.6 篩選的ABA 濃度），觀察酵母生長情況，參照劉振寧等[31] 的方法驗(yàn)證誘餌質(zhì)粒與蛋白的互作。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏仁酵母初級cDNA 文庫構(gòu)建

RNA 的完整度與穩(wěn)定性是構(gòu)建cDNA 文庫的關(guān)鍵。提取杏仁不同發(fā)育時(shí)期的RNA，取2 μL 進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果（圖1A）具有RNA 的兩條特征條帶。將所有10 個(gè)樣品等比例混合后檢測總RNA 的OD260 nm/OD280 nm 值為2.11，RIN 值（RNA integrity number）為9.0。將總RNA 進(jìn)行分離純化和反轉(zhuǎn)錄分別獲得mRNA（圖1B）和雙鏈cDNA（圖1C），電泳結(jié)果均呈現(xiàn)彌散條帶，且ds cDNA 主要片段大于1 000 bp。以上結(jié)果表明，所提取的總RNA和反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA質(zhì)量良好，可用于后續(xù)酵母文庫構(gòu)建。

2.2 杏仁酵母初級cDNA 文庫質(zhì)量評估

統(tǒng)計(jì)初級文庫涂布在平板上長出的單克隆數(shù)為1 300 個(gè)（圖2A），初級文庫庫容量= 平板上的克隆數(shù)/50 μL×100×1 000 μL=1 300/50 μL×100×1 000 μL=2.6×106 CFU/mL，4 mL 總庫容=2.6×106×4=1.04×107 CFU，大于106（標(biāo)準(zhǔn)文庫的質(zhì)量）。對隨機(jī)挑取的24 個(gè)單克隆進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果表明，文庫重組率達(dá)100%，插入的片段也都為大于1 000 bp 的有效片段（圖2B）。

2.3 杏仁酵母核體系次級文庫的構(gòu)建及質(zhì)量評估

統(tǒng)計(jì)次級文庫涂布在平板上長出的單克隆數(shù)為1 500 個(gè)（圖3A），次級文庫庫容量= 平板上的克隆數(shù)/50 μL×100×1 000 μL=1 500/50 μL×100×1 000 μL=3.0×106 CFU/mL?？値烊?3.0×106×4=1.2×107 CFU。從次級文庫中隨機(jī)挑取的24 個(gè)單克隆進(jìn)行PCR 檢測，均獲得了清晰條帶，次級文庫重組率達(dá)100%，插入的片段范圍800 ～2 000 bp 有效片段所占比例較大（圖3B）。由此可見，本研究構(gòu)建的杏仁cDNA 文庫質(zhì)量較高，可用于酵母文庫的篩選，為進(jìn)一步開展杏仁中苦杏仁苷合成關(guān)鍵基因的挖掘及杏仁甜苦分子調(diào)控機(jī)制的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

2.4PaCYP79 基因啟動(dòng)子的克隆及序列分析

啟動(dòng)子分析表明，PaCYP79 啟動(dòng)子序列中含有多個(gè)植物的組成型核心啟動(dòng)子順式作用元件，如TATA-box 和CAAT-box；還含有ABA、赤霉素、茉莉酸等多種植物激素的響應(yīng)元件， 如ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif、TGACG-motif； 光響應(yīng)元件Box 4、MRE、G-box、ATCT-motif、L-box、TCT-motif、AE-box、TCCC-motif；響應(yīng)環(huán)境脅迫的元件TC-rich repeats、LTR、MBS、ARE；參與分生組織發(fā)育的CAT-box 及種子特異調(diào)控的RYelement等順式作用元件（表1）。

2.5 誘餌載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化酵母及鑒定

將PaCYP79 基因啟動(dòng)子的序列（1686 bp）連接到誘餌載體pAbAi 上，利用Sac I 和Xho I 雙酶切驗(yàn)證誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 構(gòu)建成功，目的片段為1.7 kb（圖4A）。用BstBI 單酶切誘餌載體，轉(zhuǎn)化Y1HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂平板培養(yǎng)3 天后，挑取生長健康的單菌落，經(jīng)PCR 擴(kuò)增目的片段，預(yù)期陽性克隆目的條帶大小應(yīng)為397+1686 bp。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖4B），誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 轉(zhuǎn)化酵母Y1HGold 菌株后的陽性克隆目的條帶大小約為2 000 bp，與預(yù)期片段大小相近，進(jìn)一步測序驗(yàn)證，確定誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 成功轉(zhuǎn)入到酵母菌株中。

2.6 抑制誘餌酵母自激活的AbA 濃度篩選

AbA 抗性測定結(jié)果顯示， 誘餌酵母菌株Y1HGold 在含有0、100、150、200 ng·mL-1AbA的SD/-Ura 平板上生長良好（圖5），而在含有濃度為300 ng·mL-1AbA 及以上的SD/-Ura 平板上停止生長（圖6），說明AbA 濃度在300 ng·mL-1以上即可用于酵母單雜交篩選，本實(shí)驗(yàn)中選取300 ng·mL-1 用于后續(xù)的酵母單雜交篩選實(shí)驗(yàn)。

2.7PaCYP79 啟動(dòng)子片段與杏仁cDNA 文庫的酵母單雜交篩選及互作驗(yàn)證

將構(gòu)建好的杏仁cDNA 酵母文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化誘餌菌株Y1HGlod [pAbAi-PaCYP79p] 稀釋1 000 倍后的菌液涂布在SD/-Leu 平板上，統(tǒng)計(jì)單克隆數(shù)量為35，篩選克隆總數(shù)=35/100 μL×1 000×6 mL=2.1×106 CFU，文庫轉(zhuǎn)化效率CFU/μg= 文庫總克隆數(shù)/ 酵母文庫質(zhì)量（10 μg）=2.1×105 CFU/μg。表明杏仁cDNA 酵母文庫的轉(zhuǎn)化效率符合文庫篩選要求（大于1×105 CFU/μg）。

酵母轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含300 ng·mL-1 AbA 的SD/-Leu的培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 ～ 5 d，初篩獲得43 個(gè)陽性單克隆菌落，將pAbAi-PaCYP79p 初篩獲得的陽性單克隆菌落再次轉(zhuǎn)移到SD/-Leu/AbA（400 ng/mL）篩選平板上，進(jìn)行二次篩選，共獲得41 個(gè)候選陽性單克隆菌落（圖7A）。提取質(zhì)粒測序得到對應(yīng)的序列，并結(jié)合NCBI 和uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對和蛋白功能注釋，排除文庫構(gòu)建時(shí)由于核酸移碼突變造成的假陽性克隆，合并重復(fù)序列，鑒定得到10 個(gè)候選的可編碼不同的蛋白基因序列，具體信息見表2。提取10 個(gè)候選陽性克隆的酵母質(zhì)粒DNA與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 共轉(zhuǎn)Y1HGold 酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布在SD/-Leu/AbA（500 ng/mL）篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行酵母單雜交驗(yàn)證，這10 個(gè)候選基因與誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 共轉(zhuǎn)Y1HGold酵母菌均可在SD/-Leu/AbA（500 ng/mL） 平板上正常生長（圖7B），說明這些蛋白可以激活PaCYP79 啟動(dòng)子。

3 討 論

構(gòu)建高質(zhì)量的杏仁cDNA 文庫，是后續(xù)利用酵母文庫篩選互作蛋白的重要前提[32]。本試驗(yàn)中用于酵母文庫構(gòu)建的RNA 樣品取自‘串枝紅‘駱駝黃杏仁不同發(fā)育時(shí)期的種皮和子葉，包含了盡量多的轉(zhuǎn)錄本信息。提取的杏仁發(fā)育時(shí)期總RNA 的RIN 值9.0，經(jīng)mRNA 分離純化后，反轉(zhuǎn)錄獲得雙鏈cDNA 條帶呈彌散分布，符合文庫構(gòu)建對其純度和完整性的要求。本研究中用于篩選的酵母次級文庫容量為1.2×107 CFU，插入片段均在1 000 bp 以上，重組率為100%，覆蓋度和完整性良好，可用于后續(xù)苦杏仁苷合成路徑調(diào)控基因的篩選研究。

利用誘餌載體pAbAi-PaCYP79p 對構(gòu)建好的杏仁cDNA 酵母文庫進(jìn)行單雜交篩選，獲得10 個(gè)可能與苦杏仁苷合成路徑關(guān)鍵基因PaCYP79 啟動(dòng)子互作的候選蛋白。對這10 個(gè)蛋白的基因序列在NCBI 和uniprot 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對和蛋白功能注釋，結(jié)果顯示，其中5 個(gè)比對到有功能注釋的蛋白，另外5 個(gè)功能未知的新蛋白。其中包括淀粉樣蛋白聚集和蛋白毒性的正調(diào)控相關(guān)的small EDRKrichfactor 2（SERF2）蛋白[33-34]，與種子發(fā)育和萌發(fā)調(diào)控相關(guān)的蛋白seed biotin-containing proteinSBP65[35]，與參與控制纖維素微原纖維定向沉積調(diào)控的類運(yùn)動(dòng)蛋白kinesin-like protein KIN-4C[36]，60S核糖體蛋白L19-2（60S ribosomal protein L19-2），聚腺苷結(jié)合蛋白2 亞型X1（polyadenylate-bindingprotein 2 isoform X1），以及5 個(gè)未知功能的蛋白。酵母單雜交進(jìn)一步證實(shí)這10 個(gè)蛋白能與PaCYP79啟動(dòng)子結(jié)合，為深入研究杏仁苦杏仁苷合成與調(diào)控的通路奠定基礎(chǔ)。

對SERF2 蛋白的研究與應(yīng)用主要集中在醫(yī)學(xué)方面。SERF2 蛋白最初被分離出來是用于亨廷頓病、帕金森病和阿爾茨海默病等疾病的研究，純化的SERF2 蛋白在體外加速了這些疾病中相關(guān)的淀粉樣蛋白的形成[33]。同時(shí)，SERF2 是一種高度保守的蛋白質(zhì)，在體外修飾淀粉樣纖維組裝并促進(jìn)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，在調(diào)節(jié)與年齡相關(guān)的蛋白質(zhì)毒性中具有一定作用[34]。苦杏仁苷在適宜的濃度范圍對于抗腫瘤、抗器官纖維化、抗動(dòng)脈粥樣硬化等方面能發(fā)揮顯著作用，但是過量食用則會由于苦杏仁苷分解產(chǎn)生的氫氰酸（HCN）而中毒[37-38]。PaCYP79 是苦杏仁苷合成路徑上的起始位置重要限速酶，屬于細(xì)胞色素P450 家族基因。該基因家族編碼的單加氧酶，可參與體內(nèi)藥物代謝的氧化還原反應(yīng)，在毒性物質(zhì)和致癌物質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要作用[39]。因此SERF2 蛋白有可能與細(xì)胞色素P450 家族基因相互作用，共同參與苦杏仁苷合成代謝的相關(guān)路徑。

SBP65 基因編碼65 kDa 的種子生物素化LEA蛋白（胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白），且ABA 在種子胚胎發(fā)育的特定階段對SBP65 的表達(dá)起特異性調(diào)控作用[35]。SBP65 蛋白在豌豆種子發(fā)育后期大量積累，并在其突變體（vip-1）中的表達(dá)量和蛋白含量水平都很低[32]。SBP65 是LEA 大家族中的一員。而LEA 蛋白在提高種子耐儲性、增強(qiáng)植物響應(yīng)干旱、低溫等逆境脅迫的抗性中發(fā)揮重要作用[40-41]。擬南芥、玉米、小麥、苜蓿種子中許多與種子耐貯性相關(guān)的LEA 蛋白已被鑒定，如擬南芥LEA14，AtLEA3 蛋白，玉米的LEA 蛋白（EMB564），小麥和苜蓿種子的Em 蛋白等[42-45]。此外玉米種子發(fā)育過程中的LEA 類蛋白—胚胎蛋白DC-8 在高活力的種子中大量積累，并在種子發(fā)育后期的胚胎形成過程中受ABA 的調(diào)控[46]。扁桃中CYP79 的表達(dá)隨著種仁發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)規(guī)律性變化，且在甜、苦仁間的種皮、子葉、胚乳等組織中表現(xiàn)組織表達(dá)特異性，并與苦杏仁苷的含量緊密相關(guān)[47]。對杏PaCYP79 啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，其啟動(dòng)子上存在種子特異調(diào)控的順式作用元件（RY-element）和ABA 響應(yīng)元件（ABRE），有可能作為SBP65 蛋白發(fā)揮互作的作用位點(diǎn)。

類驅(qū)動(dòng)蛋白KIN-4C 在開花植物中參與沿皮層微管運(yùn)輸含有非纖維素成分的物質(zhì)[36]。而KIN-4C的同源蛋白KIN-4A 在赤霉素（GA）生物合成途徑中起轉(zhuǎn)錄激活作用[48]。該蛋白可特異性結(jié)合到貝殼杉烯氧化酶2（ent-kaurene oxidase，KO2）啟動(dòng)子的DNA 序列上，通過調(diào)節(jié)GA 生物合成途徑來調(diào)控OsKO2 基因表達(dá)并介導(dǎo)細(xì)胞伸長[48]。貝殼杉烯氧化酶ent-kaurene oxidase（KO）作為細(xì)胞色素P450（CYP）701 家族成員，是所有高等植物中參與赤霉素（GA）生物合成所必需的酶[49]。但是細(xì)胞色素P450（CYP701）不同家族成員在功能上存在差異，如水稻中有5 個(gè)CYP701A 亞家族成員，只有一個(gè)（OsKO2/CYP701A6）是GA 生物合成所必需的[50-51]。PaCYP79 啟動(dòng)子上也具有赤霉素響應(yīng)元件GARE-motif，受GA 的調(diào)控，同時(shí)與CYP701A6 同為細(xì)胞色素P450 蛋白，可能存在相似結(jié)構(gòu)，與類運(yùn)動(dòng)蛋白KIN-4C 相結(jié)合發(fā)揮功能。

酵母單雜交是利用基因啟動(dòng)子與蛋白之間的相互作用來研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要實(shí)驗(yàn)技術(shù)，也是篩選鑒定與啟動(dòng)子特異調(diào)控序列相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的有效手段[52]。因此，除了具有高質(zhì)量的重要發(fā)育階段的杏仁cDNA 文庫外，構(gòu)建含有特異調(diào)控DNA 片段的誘餌載體也是篩選轉(zhuǎn)錄因子的重要影響因素[53]。為了獲得較多的互作蛋白，本研究中所用的酵母單雜交試驗(yàn)的誘餌質(zhì)粒包含了PaCYP79 起始密碼子ATG 上游的1 674 bp 序列。PaCYP79 啟動(dòng)子序列中含有較豐富的元件，不僅包含有ABA、赤霉素等多種植物激素響應(yīng)元件、光響應(yīng)、環(huán)境脅迫響應(yīng)的元件，還包含有植物的組成型核心啟動(dòng)子順式作用元件，以及參與分生組織發(fā)育及種子特異調(diào)控等的順式作用元件。此外，還有可能發(fā)生互作的未知片段。因此除了篩選到與PaCYP79 互作的可能參與苦杏仁苷合成路徑的SERF2，SBP65，KIN-4C 調(diào)控因子外，還篩選到調(diào)節(jié)基礎(chǔ)功能的蛋白60S 核糖體蛋白L19-2和聚腺苷結(jié)合蛋白2 亞型X1。60S 核糖體蛋白L19-2（60S ribosomal protein L19-2）是大核糖體亞基的組成部分。核糖體是一種大型核蛋白復(fù)合體，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。聚腺苷結(jié)合蛋白2 亞型X1（polyadenylate-binding protein 2 isoformX1）參與RNA 結(jié)合與多核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶活性的正調(diào)控。兩者在基因轉(zhuǎn)錄和蛋白形成過程中發(fā)揮基礎(chǔ)調(diào)節(jié)功能。

本研究以較長片段而非特異序列的啟動(dòng)子序列為誘餌，利用酵母單雜交技術(shù)在杏仁cDNA 酵母文庫中篩選并驗(yàn)證到了10 個(gè)與PaCYP79 啟動(dòng)子互作的蛋白，因此獲得的候選蛋白的特異性還有待驗(yàn)證。與植物相比，利用酵母雜交系統(tǒng)進(jìn)行DNA 特異序列與轉(zhuǎn)錄因子的互作驗(yàn)證，可能缺乏高等生物在轉(zhuǎn)錄過程所特有的修飾反應(yīng)，其在植物細(xì)胞中DNA 特異序列與轉(zhuǎn)錄因子互作的真實(shí)性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。另外由于酵母雜交自身技術(shù)也有可能在實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)少數(shù)假陽性和假陰性的現(xiàn)象。針對以上問題，下一步可利用熒光素酶報(bào)告基因分析及EMSA 凝膠遷移分析等方法進(jìn)一步驗(yàn)證SERF2 蛋白，SBP65 蛋白及KIN-4C 蛋白對PaCYP79 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的真實(shí)性，結(jié)合啟動(dòng)子序列短截或突變等實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證其特異互作區(qū)段和關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。對篩選到的其他功能未知的蛋白進(jìn)行基因功能鑒定，發(fā)掘可能參與苦杏仁苷代謝的新基因，以期完善PaCYP79 的功能解析，為深入解析苦杏仁苷合成路徑分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供參考。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了高質(zhì)量的杏仁cDNA 酵母文庫，并利用酵母單雜交技術(shù)在酵母文庫中篩選并驗(yàn)證了10 個(gè)與PaCYP79 啟動(dòng)子互作的蛋白。這些互作蛋白的篩選為深入研究杏仁中苦杏仁苷的合成與調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

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[ 本文編校：趙 坤]