孫 琦 王洪博 高 瑋 孫 豪

1.石家莊市人民醫(yī)院藥學部 (河北 石家莊, 050000) 2.河北省胸科醫(yī)院 3.河北省中醫(yī)院藥學部 4.石家莊市裕華區(qū)疾病預防控制中心

肝細胞癌起病隱匿,因此很多患者喪失了外科手術的治療機會,而目前并沒有療效顯著的化療藥物和有效的治療方式,因此探索肝癌治療的新途徑和明確其發(fā)病機制對肝癌治療和預防及減少患者死亡率具有重大意義[1]。中藥知母的主要成分是知母皂苷。近年來研究發(fā)現(xiàn)知母皂苷AⅢ(TA-Ⅲ)具有抗腫瘤作用,包括肺癌、神經(jīng)母細胞瘤、白血病、黑色素瘤等多種腫瘤[2,3]?？梢?TA-Ⅲ的抗腫瘤作用具有多樣性和安全性。但關于知母皂苷對肝癌的相關作用鮮有報道,TA-Ⅲ是否對肝癌細胞有抗腫瘤效果及其分子生物學機制尚不清楚。Akirin2基因是近年來發(fā)現(xiàn)的基因家族,又被稱作FBI1,與14-3-3β蛋白相互作用,Akirin2基因在各種癌細胞系中過表達,包括膠質(zhì)母細胞瘤細胞和嗜鉻細胞瘤細胞等[4],研究指出Akirin2基因可通過激活IL-6/STAT3/VEGFA信號通路促進膽管癌中的血管生成[5],但Akirin2是否在肝癌中表達還尚不清楚。既往研究指出知母菝葜皂苷元可促進肝癌細胞的凋亡[6]。但目前關于TA-Ⅲ與肝癌間的作用機制尚不明確。因此,我們探究TA-Ⅲ是否可以影響Akirin2表達,為肝癌的臨床治療和機制研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取在2015年1月至2017年1月于我院103例接受根治性手術的原發(fā)性肝細胞癌患者作為研究對象。納入標準:①符合原發(fā)性肝癌診療指南(2022版)中肝細胞癌診斷標準[1];②術前患者未接受放化療及免疫治療;③患者均知情同意。術中取癌組織和距離癌灶大于5 cm的癌旁組織。本研究已通過倫理批準,電話隨訪每3個月1次,隨訪結果進行生存率分析,總生存期=接受手術至死亡日期(或最后一次隨訪時)。

1.2 試劑和儀器 TA-Ⅲ(純度>98%)購自中國藥品生物制品檢定所,上海碧云天生物科技有限公司購買RIPA緩沖液,培養(yǎng)基和FBS(胎牛血清)購買于美國Gibco公司,HepG2、SMMC-7721、BEL-7402 和L02細胞購買于上海中國科學院細胞庫,MTT和BCA試劑盒分別購自美國Sigma和Thermo公司,德國Eppendorf公司購買離心機和PCR儀,流式細胞儀購買于美國Beckman公司,美國invitrogen公司購買TRIzol試劑盒和轉染試劑盒Lip 2000。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染 按常規(guī)操作進行。

1.4 細胞處理和分組 實驗將TA-Ⅲ分為 0、5、10、20和40 mol/L 5組分別對HepG2細胞進行48 h處理。另外根據(jù)Akirin2轉染方式不同分為Akirin2過表達組(Akirin2 mimics轉染至HepG2細胞)和Akirin2 inhibitor組(Akirin2 inhibitor轉染至HepG2細胞)、TA-Ⅲ+Akirin2過表達組、紫杉醇組(80 μg/ml處理HepG2細胞)。

1.5 RT-qPCR檢測mRNA的表達 基因檢測,通過轉錄和反轉錄組織和細胞中提取的總RNA,GAPDH為內(nèi)參,相對表達量=2-ΔΔCt,引物列表見表1。

表1 本實驗引物

1.6 免疫組織化學染色及MTT法檢測細胞增殖 按常規(guī)操作進行。

1.7 平板克隆形成實驗檢測肝癌細胞克隆形成 制備單細胞懸液,進行平板克隆形成實驗,根據(jù)MTT法實驗結果根據(jù)濃度不同將TA-Ⅲ 隨機分為10、20、40 mol/L處理,對照組給予等量PBS處理,將處理過的細胞以每孔1 000個的濃度接種在六孔板中,培養(yǎng)2～3周后,肉眼可見克隆時,培養(yǎng)結束,用吉姆薩液染色固定好的細胞30 min,顯微鏡下觀察克隆情況。

1.8 流式細胞術檢測細胞凋亡及Western blot檢測蛋白表達按常規(guī)操作進行。

1.9 MTT、Western blot和流式檢測Akirin2轉染和TA-Ⅲ對過表達Akirin2的HepG2細胞的增殖、克隆、凋亡的影響 RT-qPCR檢測轉染效率,使用轉染成功后的HepG2細胞進行MTT、平板克隆、WB和流式檢測Akirin2過表達組、Akirin2 inhibitor組以及TA-Ⅲ+Akirin2過表達組對細胞的增殖、克隆和凋亡的影響。

2 結果

2.1 肝癌組織中Akirin2表達水平 見圖1、2。

圖1 Akirin2 mRNA在肝癌和癌旁組織的表達

圖2 Akirin2在肝癌組織和癌旁組織蛋白相對表達(1、3、5、7、9、11、13為肝癌組織;2、4、6、8、10、12、14為癌旁組織)

2.2 Akirin2蛋白在肝癌組織中表達與患者總體生存率的關系 在免疫組化檢測中,Akirin2在肝癌組織中顯著高表達(P<0.05,圖3)。我們將95例隨訪后的患者根據(jù)Akirin2染色評分分為高和低表達2組。結果顯示,Akirin2高表達患者生存時間要低于低表達患者(P<0.05,圖4)。

圖3 免疫組化檢測Akirin2在患者肝癌和癌旁組織中的表達(HE,400×)

圖4 Akirin2不同表達方式與患者生存率的相關性

2.3 Akirin2在不同肝癌細胞中的表達 為明確Akirin2蛋白在不同肝癌細胞中的表達,我們通過RT-qPCR和Western blot分別檢測正常肝細胞L02細胞、3種肝癌細胞(SMMC-7721、BEL-7402、HepG2)中的mRNA和蛋白表達。結果顯示,3種癌細胞中的Akirin2 mRNA和蛋白表達均顯著高于正常肝細胞。

3種肝癌細胞比較,HepG2細胞Akirin2 mRNA和蛋白表達更顯著(圖5,P<0.05),因此我們選擇HepG2細胞進行后續(xù)實驗。

圖5 各組細胞中Akirin2的表達(**P<0.05)

2.4 Akirin2對肝癌細胞增殖的影響 轉染后的HepG2細胞的Akirin2 mRNA表達見表2。MTT法和平板克隆形成實驗結果顯示,Akirin2 inhibitor組會導致細胞生長和克隆能力顯著降低,相反,Akirin2在HepG2細胞中的過表達則顯著增加增殖和集落形成能力(P<0.05,圖6)。

圖6 MTT法(A)和平板克隆實驗(B)檢測細胞活力(**P<0.05)

表2 轉染后的HepG2細胞的Akirin2 mRNA表達

2.5 Akirin2對肝HepG2細胞凋亡的影響 Akirin2過表達可顯著降低凋亡,而Akirin2 inhibitor則可顯著促進細胞凋亡(圖7)。Western blot檢測Akirin2對cleaved-caspase3、caspase-PARP蛋白表達,結果顯示,Akirin2抑制后cleaved-caspase3、caspase-PARP蛋白升高;Akirin2過表達后cleaved-caspase3、caspase-PARP蛋白降低(圖8)。

圖7 流式細胞檢測細胞凋亡

圖8 Western blot檢測Akirin2抑制和過表達對細胞凋亡相關蛋白的影響

2.6 TA-Ⅲ抑制HepG2細胞增殖 分別用0、5、10、20、40 mol/L濃度的TA-Ⅲ和80 μg/mL的紫杉醇干預HepG2細胞增殖情況,干預時間分別為24 h和48 h。結果顯示與空白對照組比較,TA-Ⅲ處理組的HepG2細胞增殖活力顯著被抑制,細胞增殖活性抑制與干預濃度、時間成正比(圖9,P<0.05),且40 mol/L濃度的TA-Ⅲ和80 μg/ml的紫杉醇干預結果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.7 TA-Ⅲ誘導HepG2細胞凋亡 分別用0、5、10、20、40 μmol/L濃度的TA-Ⅲ和80 μg/ml的紫杉醇干預HepG2細胞增殖情況。結果顯示,TA-Ⅲ細胞凋亡與干預濃度、時間成正比,HepG2細胞凋亡顯著增多趨勢,TA-Ⅲ 40 mol/L時效果最佳(P<0.05,圖10)。且TA-Ⅲ各組的HepG2細胞凋亡率和凋亡蛋白表達隨濃度升高而增加(圖11)。

圖10 流式細胞術檢測TA-Ⅲ影響肝癌細胞的凋亡情況

圖11 Western blot檢測TA-Ⅲ對凋亡蛋白影響

2.8 TA-Ⅲ下調(diào)HepG2細胞Akirin2的表達 Western blot的結果顯示,與空白對照組比較,TA-Ⅲ(10、20、40 mol/L)組的HepG2細胞中的Akirin2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05,圖12)。

圖12 Western blot檢測不同濃度TA-Ⅲ對肝癌細胞中Akirin2表達影響

2.9 Akirin2影響TA-Ⅲ對肝癌細胞的抑制作用 為了進一步檢測TA-Ⅲ對HepG2及Akirin2蛋白的影響,將HepG2細胞隨機分為NC組、Akirin2過表達組、TA-Ⅲ(40 μmol/L)組、TA-Ⅲ+Akirin2過表達組。結果顯示,與TA-Ⅲ組比較,TA-Ⅲ+Akirin2過表達組HepG2細胞活力升高(P<0.05,圖13A),細胞凋亡率(P<0.05,圖13B)、cleaved-caspase3蛋白、caspase-PARP表達量降低(圖13C)。

圖13 A:MTT法檢測細胞活力(**P<0.05);B:Western blot檢測HepG2細胞凋亡相關蛋白的表達;C: 流式細胞術檢測HepG2細胞凋亡

3 討論

肝癌的發(fā)病機制涉及到多種致癌因素,包括激活原癌基因、信號通路的改變及多種因子的誘導和改變等[7,8],但目前仍處于探索階段。Akirins已被確定為一組高度進化保守的核因子。至少有兩個Akirin家族成員,名為Akirin1和Akirin2,而Akirin2是14-3-3β的功能伴侶,在多種癌細胞系過表達[9,10],有研究顯示在大鼠乳腺癌、肺癌及膠質(zhì)瘤細胞中Akirin2基因具有致癌功能[11-13]。Akirin2敲減基因細胞在小鼠模型中表現(xiàn)出腫瘤生長緩慢和較少的腫瘤轉移[14],這些結果均表明,Akirin2基因可能是多種癌癥的癌基因。因此有必要探究其與肝癌是否存在聯(lián)系。我們在臨床肝癌患者癌組織中發(fā)現(xiàn),Akirin2呈現(xiàn)高表達,且Akirin2高表達患者生存率和生存時間都較低表達患者低,這提示Akirin2可能與肝癌存在密切聯(lián)系。因此我們將進一步研究二者的關系。

我們通過體外實驗研究發(fā)現(xiàn),Akirin2轉染顯著改變了HepG2肝癌細胞增殖和凋亡情況。而癌癥在很大程度上被視為一系列無限制增殖的疾病,在各種類型的侵襲性腫瘤中,高增殖指數(shù)通常伴隨著高凋亡指數(shù)[15]。細胞凋亡可激活caspases信號通路。而cleaved-caspase、cleaved-PARP是測量腫瘤細胞凋亡的重要標記物。長期以來,避免細胞凋亡的能力一直被認為是惡性和惡性前期細胞的重要后天特征。因此,抗凋亡途徑已被確定為惡性疾病的重要途徑[16]。我們繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Akirin2過表達顯著增加了HepG2肝癌細胞增殖、抑制了細胞凋亡,Akirin2過表達顯著降低了cleaved-caspase、cleaved-PARP蛋白的表達,Akirin2抑制顯著增高了cleaved-caspase、cleaved-PARP蛋白的表達,這些結果表明Akirin2可能參與了caspase激活途徑的肝癌細胞凋亡,進而影響了肝癌的發(fā)生和發(fā)展。

知母作為祖國醫(yī)學傳統(tǒng)中藥,具有滋陰降火、潤燥滑腸的作用,常用于陰虛內(nèi)熱證,具有抗炎和解熱的作用[17,18]。TA-Ⅲ是知母的重要有效成分,可抑制腫瘤細胞增殖,被認為可誘導自噬和隨后的線粒體依賴性凋亡細胞死亡,其病理機制是引起活性氧(ROS)的產(chǎn)生增加和相關的線粒體功能障礙[19,20],其介導的細胞死亡可能涉及mTOR通路的破壞。而調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡已成為抗癌研究的重要藥物靶點。本研究發(fā)現(xiàn)TA-Ⅲ抑制HepG2肝癌細胞增殖,誘導其凋亡,并呈現(xiàn)濃度、時間依賴性。這表明TA-Ⅲ具有良好的抗腫瘤作用,同時我們還發(fā)現(xiàn)肝癌細胞給予TA-Ⅲ后,Akirin2蛋白表達顯著下降,而我們之前的結果已經(jīng)證明Akirin2蛋白高表達會增加細胞增殖、減少其凋亡。這提示Akirin2蛋白有可能是TA-Ⅲ誘導HepG2肝癌細胞凋亡的潛在靶點。因此我們再繼續(xù)研究證明這一結論發(fā)現(xiàn),當Akirin2過表達后,TA-Ⅲ對HepG2肝癌細胞的增殖情況、細胞凋亡率、cleaved-caspase、cleaved-PARP蛋白的表達部分被逆轉,這些結果進一步表明,Akirin2可能參與TA-Ⅲ抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡的作用的過程,并提示下調(diào)Akirin2可能是治療肝癌的可行性策略。

綜上所述,在肝癌中Akirin2呈現(xiàn)高表達水平,TA-Ⅲ可抑制肝癌細胞增殖并促進凋亡,這可能是TA-Ⅲ通過抑制Akirin2表達進而誘導細胞凋亡,希望這一發(fā)現(xiàn)能為肝細胞癌的治療和機制研究提供線索。