陳蘭青，黎淑貞，甘禮社，金靜維，吳日輝，馬 航，張 焜，李冬利

(五邑大學生物科技與大健康學院，廣東 江門 529000)

簕菜Acanthopanaxtrifoliatus又名白簕，是五加科五加屬攀緣狀灌木，主要分布于我國華南、西南、華中地區(qū)。其作為藥食兩用植物，在《本草綱目》《神農(nóng)本草經(jīng)》中均有記載，所含主要活性成分為酚類、黃酮、皂苷、萜類、揮發(fā)油及多糖等，具有抗氧化、抑菌、抗炎、抗腫瘤、祛風除濕、消瘀止血止痛、清熱解毒、補中益氣、堅筋[1]、保護胃黏膜、改善認知障礙、抗抑郁及抗焦慮等多種功效[2]。以簕菜為原料的日用品相繼被開發(fā)[2]，如涼茶[3]、功能性牙膏[4]、透明香皂[5]、消炎噴霧劑[6]、化妝品[7]以及嬰幼兒皮膚保健品[8]等。Sithisarn 等[9]通過高效液相色譜法(HPLC)分析發(fā)現(xiàn)簕菜葉中含有豐富的黃酮和咖啡奎寧酸等酚類物質(zhì)，Chen 等[10]應用HPLC和超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)分析簕菜提取物的活性成分，確定了皂苷、多酚、類黃酮和特征成分含量。HPLC 法分析時間較長，方法特異性較差，靈敏度較低；UPLC-MS 法能部分克服HPLC 法的不足，選擇性增強，靈敏度提高，分離性能較好，但測定過程中需優(yōu)化待測成分離子對及碰撞能等，方法開發(fā)過程繁瑣復雜[11]。靜電場軌道阱(Orbitrap)是近年來發(fā)展起來的一種新型質(zhì)譜質(zhì)量分析器，與超高效液相色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫結(jié)合后可大大縮短樣品分析時間，提高化學成分的鑒定效率[12]，相比于UPLC-MS 法具有較高質(zhì)量分辨率及高質(zhì)量精度，可提高定性及定量分析準確度?，F(xiàn)階段的簕菜產(chǎn)品大多使用簕菜原料開發(fā)，對其活性成分并未進行充分利用。本研究首次使用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)快速全面分析簕菜有效活性成分，為實現(xiàn)簕菜產(chǎn)品升級及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量標準研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

簕菜產(chǎn)于廣東恩平，由恩平市雪荘簕菜茶廠提供。

1.2 主要儀器與試劑

Ultimate 3000 Series 超高效液相色譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，Q-Exactive 組合型四極桿/靜電場軌道阱質(zhì)譜儀[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，KQ-500VDB 型雙拼數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Milli-Q Direct 8/16 系統(tǒng)(默克密理博公司)，YP502N 電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，RHP-2000A 型搖擺不定式不銹鋼粉碎機(浙江榮浩工貿(mào)有限公司)，RE-200A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

對照品綠原酸(98.39%)、異綠原酸A(98.57%)、異綠原酸B(98.49%)、異綠原酸C(99.12%)、原兒茶酸(99.43%)、隱綠原酸(99.28%)、蘆丁(98.97%)購自成都康邦生物科技有限公司。Acantrifoic acid C、Acantrifoic acid D、Impressic acid、Acankoreanogenin A、3α-羥基羽扇-20(29)-烯-30-醇-23,28-二酸、3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸、3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23-醛-28-酸、對映-貝殼杉-15-烯-17-醛-19-酸均為作者課題組分離得到。甲醇色譜純(德國默克股份兩合公司)，甲醇、乙腈、甲酸為質(zhì)譜級[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，95%乙醇為分析純(廣州化學試劑廠)。

1.3 方法

1.3.1 標準品溶液制備

分別精密稱取1.00 mg 綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、原兒茶酸、隱綠原酸、蘆丁、Acantrifoic acid C、Acantrifoic acid D、Impressic acid、Acankoreanogenin A、3α-羥基羽扇-20(29)-烯-30-醇-23,28-二酸、3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸、3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23-醛-28-酸、對映-貝殼杉-15-烯-17-醛-19-酸，用1 mL 質(zhì)譜級甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度均為1.00 mg·mL–1標準品貯備液。精密吸取各標準品溶液200 μL 稀釋至50 μg·mL–1，過0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)過濾膜后備用。

1.3.2 樣品溶液制備

將新鮮簕菜莖葉樣品日曬干燥，粉碎，過60 目篩，用電子天平精密稱取100 g 于錐形瓶中，加入1000 mL 95%乙醇室溫下浸提1 d，共提取3 次。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮得到簕菜醇提物32.8 g，保存于4 ℃。用十萬分之一電子天平精密稱取5.00 mg 簕菜醇提物，超聲輔助溶解于1 mL 質(zhì)譜級甲醇，得到5 mg·mL–1醇提物樣品溶液，過濾后用于分析。

1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD C18柱(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)，流動相為0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B)。梯度洗脫：0.0～2.0 min，5% B；2.0～42.0 min，95% B；42.0～46.9 min，95% B；46.9～47.0 min，95% B～5% B；47.0～50.0 min，5% B。柱溫40 ℃，流速0.4 mL·min–1，進樣量2.00 μL。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式為負離子全掃描；干燥氣和霧化氣為氮氣(N2)，碰撞氣氬氣(Ar)，正離子模式干燥氣溫度350 ℃。Dd-MS2觸發(fā)閾值(AGC target)為2e5，一級質(zhì)譜掃描分辨率[以半峰全寬(FWHM)計]為70000 FWHM；二級分辨率為17500 FWHM；掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)100～1500；碰撞能量梯度為20 eV、40 eV、60 eV。

1.3.4 成分分析與鑒定

采用UPLC-Q-Orbitrap-MS 在負離子模式下檢測、采集數(shù)據(jù)，得到總離子流圖。根據(jù)譜圖中的分子離子峰與其對應的碎片離子峰，通過與標準品的出峰時間和質(zhì)譜信息進行比對，并結(jié)合Compound Discoverer 2.1 數(shù)據(jù)分析軟件、mzVault 和mzCloud數(shù)據(jù)庫進行篩選，對簕菜化學成分進行快速定性分析。對于數(shù)據(jù)庫中沒有出現(xiàn)的對應物質(zhì)的離子峰，則運用Chemspider、人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)比對譜圖信息，利用SciFinder、CNKI、PubMed 等數(shù)據(jù)庫查閱文獻并驗證結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合分子離子、碎片離子信息確認具體化學成分。在處理過程中將理論分子量和實際分子量的誤差值設(shè)定為5 ppm，對樣品進行化學定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測結(jié)果

標準品的譜圖數(shù)據(jù)如表1。

表1 標準品數(shù)據(jù)Table 1 Information of standard components

利用Compound Discoverer 2.1 數(shù)據(jù)分析軟件對簕菜樣品的總離子流圖進行峰提取和分析(圖1)，使用mzVault 和mzCloud 數(shù)據(jù)庫進行篩選，根據(jù)簕菜樣品和標準品譜圖中的保留時間(RT)和分子離子峰的質(zhì)荷比及其對應的碎片離子峰的質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻，共鑒定出29 個化合物，其中19 個多酚類化合物，10 個萜類化合物(表2)。化合物的結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

圖1 簕菜提取物的總離子流圖Fig.1 TIC chromatograms of Acanthopanax trifoliatus extract

圖2 化合物1～29 的結(jié)構(gòu)式Fig.2 Structures of compounds 1～29

表2 簕菜化學成分信息Table 2 Characterization of chemical components of Acanthopanax trifoliatus

2.2 成分鑒定與分析

化合物3、5、7、10、13、14、16、21～22、24～29 通過與對照品對比確認，其余化合物主要通過與未知物鑒定新型數(shù)據(jù)庫mzCloud 及賽默飛中藥成分高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫mzVault 中化合物的質(zhì)譜信息進行比對確定。

共鑒定出19 個多酚類化合物，為化合物1～17、19、20，其中黃酮類化合物5 個，為化合物10～12、19 和20。

以化合物3 原兒茶酸為例，根據(jù)保留時間2.02 min，[M-H]–準分子離子峰的m/z為153.01845，通過丟失CO2，形成m/z109.02836 的二級特征碎片，推斷分子式為C7H6O4[13]，原兒茶酸標準品的保留時間為1.99 min，最終經(jīng)與標準品質(zhì)譜對比確定化合物3 為原兒茶酸。

峰號5 的化合物的保留時間是4.87 min，[M-H]–準分子離子峰的m/z為353.08792，推斷分子式為C16H18O9[14]，其二級特征碎片有m/z307.08246、215.00972、191.05551。綠原酸標準品的保留時間為4.86 min，通過與標準品質(zhì)譜圖對比，可以確定化合物5 是綠原酸。

峰號7 的化合物的[M-H]–準分子離子峰m/z為353.08765，保留時間為5.32 min，推斷分子式為C16H18O9[14]，其中二級特征碎片有m/z173.04460、135.04575、93.03449。隱綠原酸標準品的保留時間為5.30 min，通過與標準品質(zhì)譜對比，確定化合物7是隱綠原酸。

峰號10 的化合物保留時間是8.72 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為609.14600，二級特征碎片有m/z515.39667、300.02686、178.97690，推斷分子式為C27H30O16[15]，通過與標準品質(zhì)譜進行比對，蘆丁標準品的保留時間為8.70 min，鑒定化合物10 是蘆丁，屬于黃酮類化合物。

峰號13 的化合物的保留時間是9.81 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為515.11926，二級特征碎片有m/z461.11426、419.23367、353.09219，推斷分子式為C25H24O12[14]。異綠原酸B 標準品的保留時間為9.79 min，通過與對照品對比，鑒定化合物13 為異綠原酸B。

峰號14 的化合物的保留時間是9.94 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為515.11926，二級特征碎片有m/z447.09833、257.06024、191.05840，推斷分子式為C25H24O12[14]。異綠原酸A 標準品的保留時間為9.91 min，通過與標準品對比，可以鑒定化合物14 是異綠原酸A。

峰號16 的化合物的保留時間是10.74 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為515.11926，二級特征碎片有m/z353.09085、257.05859、135.04587，推斷分子式為C25H24O12[14]。異綠原酸C 標準品的保留時間為10.74 min，通過與標準品對比，鑒定出化合物16是異綠原酸C。

化合物19 和20 的準分子離子峰分別為m/z301.03555 和285.04050[M-H]–，通過與Thermo 內(nèi)置的數(shù)據(jù)庫mzCloud 以及mzVault 對比，結(jié)合文獻[16]，分別鑒定為槲皮素和木犀草素。

共鑒定出萜類化合物10 個，為化合物18、21～29。

峰號21 的化合物的保留時間是17.86 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為501.32352，二級特征碎片有m/z457.33087、439.32050、421.30978，推斷分子式為C30H46O6[17]。本課題組分離鑒定的3α-羥基羽扇-20(29)-烯-30-醇-23,28-二酸對照品的保留時間為17.84 min，經(jīng)過對比確定化合物21 是3α-羥基羽扇-20(29)-烯-30-醇-23,28-二酸，屬于三萜類化合物。

峰號22 的化合物的保留時間是18.29 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為503.33583，二級特征碎片有m/z485.32584、467.31537、393.31476，推斷分子式為C30H46O6[17]。本課題組分離的3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸對照品保留時間為18.30 min，通過對比，鑒定出化合物22 是3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23,28-二酸，屬于三萜類化合物。

峰號24 的化合物的保留時間是19.15 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為517.32093，二級特征碎片有m/z473.32599、455.31543、340.68268，推斷分子式為 C30H46O5[17]。由本課題組分離鑒定的Acantrifoic acid C 對照品的保留時間為19.13 min，通過比對，確定化合物24 是Acantrifoic acid C，為三萜類化合物。

峰號25 的化合物的保留時間是20.67 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為501.32242，二級特征碎片有m/z501.32077、473.32596、455.31537、409.30978，推斷分子式為C30H46O6[17]。本課題組分離鑒定的Acantrifoic acid D 對照品的保留時間為20.68 min，通過對比確定化合物25 是Acantrifoic acid D，屬于三萜類化合物。

峰號26 的化合物保留時間20.96 min，[M-H]–準分子離子峰m/z為485.32736，其二級特征碎片m/z469.33105、433.30978、290.26868，推斷分子式為C30H46O5[17]。對比本課題組分離的3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23-醛-28-酸對照品保留時間為20.92 min，且特征離子碎片相符，確定化合物26是3α,11α-二羥基羽扇-20(29)-烯-23-醛-28-酸，屬于三萜類化合物。

峰號27 的化合物保留時間22.92 min，[M-H]–準分子離子峰的m/z為315.19675，推斷分子式為C20H29O3[17]，其中二級特征碎片m/z217.20535、253.19476、163.11157。與本課題組分離的對映-貝殼杉-15-烯-17-醛-19-酸對照品的保留時間22.91 min非常接近，與對照品的特征離子碎片相符，確定化合物27 是對映-貝殼杉-15-烯-17-醛-19-酸，屬于二萜類化合物。

峰號28 的化合物保留時間是23.46 min，[M-H]–準分子離子峰的m/z為471.34732，二級特征碎片m/z424.90891、325.18365、265.14749，推斷分子式為C30H47O4[17]。本課題組分離的Impressic acid 對照品保留時間為23.47 min，兩者對比特征離子碎片與保留時間均相符，故確定化合物28是Impressic acid，為三萜類化合物。

峰號29 的化合物保留時間是24.38 min，[M-H]–準分子離子峰的m/z為485.32739，二級特征碎片m/z467.31723、311.16907、174.95558，推斷分子式為 C30H46O5[17]，對比本課題組分離的純物質(zhì)Acankoreanogenin A 對照品，保留時間和特征離子碎片均相符，確定化合物29 是Acankoreanogenin A，屬于三萜類化合物。

3 結(jié)論

簕菜化學成分豐富，種類繁多，其中黃酮、咖啡酸單寧、多糖、皂苷、萜類、揮發(fā)油是其藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[18]。本研究基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術(shù)，建立了一種簡便、高效、準確、靈敏的廣東恩平產(chǎn)簕菜有效活性成分的分析方法，共鑒定29 個多酚類和萜類化合物，主要為縮酚酸類化合物、黃酮類化合物、三萜類化合物和二萜類化合物。簕菜提取物中含有較多的綠原酸、異綠原酸A 和異綠原酸C 等多酚類活性物質(zhì)，具有較好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖等活性[1]；作者前期研究表明，簕菜的三萜化合物具有抗腫瘤[19]和抗炎活性[20]，但由于這些萜類化合物無明顯的紫外吸收，前期研究中很少被檢測到。本研究通過UPLC-Q-Orbitrap HRMS 對簕菜中多酚類和萜類有效成分同時進行快速分析鑒定，為開發(fā)簕菜中抗氧化、抗腫瘤和抗炎等活性化學物質(zhì)奠定基礎(chǔ)，為簕菜產(chǎn)品建立質(zhì)量標準和簕菜資源的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。此外，簕菜仍有較多化合物未鑒定出來，后續(xù)可嘗試優(yōu)化提取條件或者將醇提物用不同有機溶劑萃取后對石油醚層、乙酸乙酯層、正丁醇層等部位進行分析，以便更加全面地分析簕菜所含活性成分。