曾荔琦，曾嘉欣，楊蕾蕾，楊 洋1,*

(1.湖南醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，湖南 懷化 418000；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642；3.深圳市中國科學(xué)院仙湖植物園，廣東 深圳 518004)

羅漢果Siraitiagrosvenorii是葫蘆科Cucurbitaceae羅漢果屬Siraitia多年生藤本植物，又名金不換、假苦瓜、光果木鱉等，收載于1977～2020年各版本《中華人民共和國藥典》中[1]，其主要成分羅漢果苷V的甜度為蔗糖的250～350 倍[2]，而熱量僅為蔗糖的1/50[3]，糖尿病患者亦宜服用，是我國特有的珍貴藥用植物和甜料植物，也是我國衛(wèi)生部首批公布的藥食同源名貴中藥材，被譽(yù)為“東方神果”，具有較高的經(jīng)濟(jì)價值。

羅漢果性喜溫暖、濕潤環(huán)境，主要分布在華南地區(qū)的廣西、廣東、湖南、江西等省(自治區(qū))[4—5]。目前，關(guān)于羅漢果的研究主要集中在栽培[4,6]、成分[7]、藥理[8—9]、質(zhì)量標(biāo)志物[9]、代謝組學(xué)[10]等方面。譚芳香等[11]發(fā)現(xiàn)，自2010年后，關(guān)于羅漢果品種選育和種苗繁育的研究和專利申請較少。市場存在羅漢果品種良莠不齊、種苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)空缺、感病嚴(yán)重等問題[12—13]。羅漢果的繁殖方式主要有播種、扦插和組織培養(yǎng)等方法[4,14]。其中，組織培養(yǎng)繁殖成本高；長期無性扦插繁殖會導(dǎo)致羅漢果種性退化，品質(zhì)和產(chǎn)量下降；種子繁殖則具有種源豐富，成本低廉，方法簡單，繁殖系數(shù)高，能活化種性等優(yōu)勢[14]；還可通過大量實(shí)生苗選擇培育良種。目前關(guān)于羅漢果種子萌發(fā)研究較少，潘麗梅等[15]探索不同濃度激動素和赤霉素對羅漢果種子萌芽的影響。張碧玉等[16]和李鋒等[17]則集中對長灘果、拉江果、青皮果、冬瓜果等羅漢果品種的種子在不同溫度、不同貯藏方式及去皮處理?xiàng)l件下的萌發(fā)進(jìn)行相關(guān)研究。此外，研究發(fā)現(xiàn)降水和溫度是影響羅漢果生長和分布的主要環(huán)境因子[18]，其分布的南方地區(qū)多為酸性壤土[19]。但關(guān)于羅漢果種子酸脅迫和干旱脅迫等生理研究未見系統(tǒng)報道。因此，本文以廣西壯族自治區(qū)桂林市永?？h伯林2 號羅漢果種子為材料，對其形態(tài)、萌發(fā)特性，以及浸種、酸脅迫和干旱脅迫對種子萌發(fā)的影響開展研究，為羅漢果的區(qū)系分布、保護(hù)、繁殖和育種等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羅漢果伯林2 號成熟果實(shí)于2022年1月購自廣西壯族自治區(qū)桂林市永?？h。經(jīng)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院孔德鑫副教授鑒定為羅漢果伯林2 號果實(shí)，并于常溫干燥儲存，萌發(fā)實(shí)驗(yàn)前取出種子。

1.2 方法

1.2.1 種子形態(tài)指標(biāo)測定

隨機(jī)選擇10 粒飽滿的羅漢果種子，在體視顯微鏡(M205FA，Leica)下觀察其外部形態(tài)。將干燥種子從中部縱切，固定后放入樣品臺，用離子濺射儀(MC1000，Hitachi)均勻噴金30 s；在掃描電子顯微鏡(SU8100，Hitachi)下觀察并拍照。

種子長、寬和厚用數(shù)顯游標(biāo)卡尺(精度0.01 mm)測定，重復(fù)50 次，取平均值。種子千粒重采用四分法隨機(jī)取種子1000 粒，電子天平(精度0.0001 g)稱量，重復(fù)10 次，取平均值。

1.2.2 吸水率測定

將50 粒飽滿種子置于裝有蒸餾水的燒杯中，常溫吸脹，分別在處理2、4、8、16、24、48、72 h取出，用濾紙吸干表面水分后稱重，計算吸水率。設(shè)3 次重復(fù)，取平均值。

吸水率(%)＝[(吸水后重量–吸水前重量)/吸水前重量]×100%

1.2.3 萌發(fā)率與萌發(fā)勢測定

隨機(jī)選擇健康飽滿的種子40 粒，70%乙醇噴灑消毒。設(shè)置一組用無菌水浸泡24 h，一組不浸泡處理。用滅菌后的細(xì)砂培養(yǎng)，并保持培養(yǎng)盒無流動水且濕潤狀態(tài)。于常規(guī)條件下(溫度25 ℃、相對濕度60%、12 h 光照/12 h 黑暗，下同)培養(yǎng)。以種殼裂開，子葉突出種皮作為種子萌發(fā)的標(biāo)志，連續(xù)5 d 無萌發(fā)視為萌發(fā)結(jié)束。設(shè)3 次重復(fù)，取平均值。

發(fā)芽率(%)＝(發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)＝(日發(fā)芽種子數(shù)達(dá)峰值時的發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.4 種子酸脅迫處理

使用鹽酸模擬種子萌發(fā)酸脅迫。隨機(jī)選擇健康飽滿的種子40 粒，分別噴淋pH 為4、5、6 的鹽酸溶液，對照組噴淋無菌水(pH 7)，于常規(guī)條件下培養(yǎng)。設(shè)3 次重復(fù)，統(tǒng)計發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

1.2.5 種子干旱脅迫處理

使用PEG-6000 模擬種子萌發(fā)干旱脅迫。選擇健康飽滿的種子40 粒，分別噴淋5%、10%和15% PEG-6000 溶液，對照組噴淋無菌水，于常規(guī)條件下培養(yǎng)。設(shè)3 次重復(fù)，統(tǒng)計發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 22.0 軟件和EXCEL 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅漢果種子形態(tài)特征

羅漢果伯林2號種子千粒重為178.71±6.99 g；外形呈類圓形，扁平狀，長17.00±1.04 mm，寬14.34±0.84 mm，厚3.44±0.30 mm。種子邊緣較厚，呈淡黃色；中間向內(nèi)微凹陷呈棕黃色(圖1 A)；內(nèi)含米白色種仁，呈紡錘形(圖1 C)。種子上下種殼在淡黃色區(qū)域的側(cè)面不閉合，具縫隙(圖1 B)。

圖1 羅漢果種子的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Siraitia grosvenorii seed

圖2 羅漢果種子吸水率變化Fig.2 Variation trend of water absorption of Siraitia grosvenorii seed

羅漢果伯林2號種子掃描電鏡如圖1 D～G。種皮中間棕黃色區(qū)域較為平整(圖1 D1)，放大后可見細(xì)微的網(wǎng)狀凸紋(圖1 D2～D3)。邊緣淡黃色區(qū)域呈放射狀溝紋(圖1 A，圖1 E1～E3)。從種子剖面可見，種子扁平面的表皮為一列柵狀細(xì)胞，下層為數(shù)層厚壁纖維和石細(xì)胞。其中，種子中間近種仁區(qū)域細(xì)胞排列為環(huán)狀，且緊密(圖1 F1～F3)。邊緣區(qū)域的下層為排列疏松的海綿狀細(xì)胞，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間隙大，離種皮越遠(yuǎn)，細(xì)胞越大(圖1 G1～G3)，且在中心區(qū)域有較大空隙(圖1 G1)。

2.2 羅漢果種子吸水率

羅漢果伯林2號種子浸泡8 h 內(nèi)的吸水率迅速增加，尤其是前2 h，吸水率高達(dá)59.67%，當(dāng)浸種8 h時，吸水率達(dá)105.03%。在8～24 h 之間，吸水率逐漸減慢，其24 h 吸水率為134.30%。24 h 后，種子吸水率無明顯增加，吸水達(dá)到飽和狀態(tài)。

2.3 種子萌發(fā)特性

由表1 可知，浸種和未浸種的羅漢果伯林2號種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢無顯著差異。浸種24 h 的羅漢果種子發(fā)芽初始時間較未浸種的提前8 d，發(fā)芽末期時間提前7 d?？梢娊N不會影響羅漢果伯林2號種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，但可提前其發(fā)芽的始末時間。

表1 浸種對羅漢果種子萌發(fā)的影響Table 1 Effects of soak on seed germination of Siraitia grosvenorii

2.4 酸脅迫對種子萌發(fā)的影響

圖3 顯示，隨著pH 降低，羅漢果伯林2號種子的發(fā)芽勢呈先升高后下降趨勢，發(fā)芽率在pH<6時顯著下降。對照組種子發(fā)芽率為46.67%，發(fā)芽勢為13.33%；當(dāng)pH=6 時，萌發(fā)率上升至53.33%，發(fā)芽勢上升至20.00%，但其萌發(fā)率與對照組無顯著差異；當(dāng)pH 降至5 和4 時，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢依次分別降低至40.00%、13.33%和20.00%、6.67%?？梢娙跛嵝詶l件(pH=6)不影響羅漢果伯林2號種子的萌發(fā)，但當(dāng)pH<6 時，則會抑制羅漢果種子萌發(fā)。

圖3 酸脅迫下羅漢果種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢Fig.3 Germination percentage and germination potential of Siraitia grosvenorii seeds under acid stress

圖4 可見，與對照組A1 和A2 相比，隨著pH降低，羅漢果伯林2 號幼苗的植株高度、葉片大小和根系等長勢均與對照組A1 和A2 無顯著差異；除萌發(fā)數(shù)量的差異外，均未出現(xiàn)生長畸變等現(xiàn)象。

圖4 酸脅迫對羅漢果幼苗的影響Fig.4 Effects of acid stress on Siraitia grosvenorii seedlings

對照組初始萌芽時間在第12 天，pH=6 處理組初始萌芽時間為第15 天，pH=5 和pH=4 處理組初始萌芽時間分別為第17 天和第18 天(圖5)。在不同pH 酸脅迫處理下，羅漢果伯林2號種子的發(fā)芽啟動時間分別延后3～6 d，但差異不顯著。因此，酸脅迫對羅漢果伯林2號種子萌發(fā)啟動時間沒有影響。

圖5 酸脅迫和干旱脅迫下羅漢果種子萌發(fā)進(jìn)程Fig.5 Germination process of Siraitia grosvenorii seeds under acid stress and drought stress

2.5 干旱脅迫對種子萌發(fā)的影響

由圖6 可見，隨著PEG-6000 濃度增加，羅漢果伯林2號種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均呈先不變后下降的趨勢。在5% PEG-6000 濃度處理下種子發(fā)芽率為46.67%，與對照組種子發(fā)芽率一致，且與10%和15% PEG-6000 處理組呈顯著差異，10%和15% PEG-6000 處理組的發(fā)芽率分別降低至26.67%和13.33%。在5%和10% PEG-6000 下種子發(fā)芽勢均為13.33%，而 15% PEG-6000 處理下發(fā)芽勢降至6.67%，可見較嚴(yán)重的干旱脅迫(PEG-6000 濃度高于10%)可抑制羅漢果伯林2號種子萌發(fā)。

圖6 干旱脅迫下羅漢果種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢Fig.6 Germination percentage and germination potential of Siraitia grosvenorii seeds under drought stress

隨著PEG-6000 濃度增高，羅漢果伯林2 號幼苗的長勢亦受到顯著影響(圖7)。其中5% PEG-6000濃度處理下萌發(fā)的幼苗植株高度、葉片大小和根系等長勢情況均與空白對照組幼苗基本一致，無顯著性差異。而10% PEG-6000 濃度處理下萌發(fā)的幼苗植株較5%處理組出現(xiàn)明顯矮化、生長遲緩等現(xiàn)象。在15% PEG-6000 處理下萌發(fā)的幼苗，其生長狀況受到顯著抑制，并伴隨根系弱化甚至無根、真葉畸變等現(xiàn)象?？梢娪蒔EG-6000 建立的干旱脅迫能顯著影響羅漢果伯林2 號幼苗的長勢，甚至導(dǎo)致植株畸變。

圖7 干旱脅迫對羅漢果幼苗的影響Fig.7 Effects of drought stress on Siraitia grosvenorii seedlings germination

在不同PEG-6000 濃度處理下，羅漢果伯林2號種子的發(fā)芽啟動時間存在顯著后移現(xiàn)象(圖5)。空白組初始萌芽時間在第12 天，5% PEG-6000 處理組初始萌芽時間為第18 天，而10%和15% PEG-6000處理組的初始萌芽時間分別推遲到第31 天和第34天?？梢娪蒔EG-6000 建立的干旱脅迫能顯著推遲羅漢果伯林2號種子的萌芽啟動時間。

3 討論

種子是植物有性繁殖的最高形式，是植物生命周期的起始。種子萌發(fā)是植物能否正常生長的最關(guān)鍵階段之一[20]，除自身特性以外，種子萌發(fā)與生長受到溫度、干旱、酸堿度、光照和鹽度等各種環(huán)境因素的影響[21—22]。

從伯林2號種子吸水率曲線來看，羅漢果種子具有良好的吸水性，但其橫切面掃描電鏡圖顯示，羅漢果的種仁被由厚壁纖維和石細(xì)胞等組成的堅(jiān)硬種殼包裹在種子中間微凹區(qū)內(nèi)。顯然，快速上升的吸水量是由于水通過種殼邊緣的裂縫快速進(jìn)入種殼邊緣厚壁纖維間的縫隙和死亡的海綿細(xì)胞中造成的。因此推測，羅漢果種子邊緣的大面積區(qū)域(淡黃色區(qū)域)不僅在動物啃食和消化中起到保護(hù)種仁的作用，還有助于種子迅速吸水與儲水，進(jìn)而為種子的萌發(fā)和初期生長提供充足的水分。同時，大量儲水加速種殼軟化，從而加快羅漢果種子的發(fā)芽始末時間，但并未影響發(fā)芽率和發(fā)芽勢，這與秦芳等[23]對栝樓Trichosantheskirilowii種子的研究結(jié)果一致。

研究表明，降雨、溫度、土壤酸堿度及鹽度等是影響植物生長和分布的主要環(huán)境因子[22,24]。在不同pH 的酸脅迫處理下，羅漢果種子的發(fā)芽率呈下降趨勢，當(dāng)處于pH=6 的弱酸性條件下時，其發(fā)芽率和發(fā)芽勢均表現(xiàn)最好。這與曾其國等[19]對廣西桂林羅漢果原產(chǎn)地A 層土壤pH 檢測為5.76，且我國南方地區(qū)多為紅壤、磚紅壤、棕壤等酸性土壤研究結(jié)果相印證。在對羅漢果種子萌發(fā)率的研究中，李鋒等[14]發(fā)現(xiàn)25～28 ℃的萌發(fā)率(76.47%)遠(yuǎn)高于20 ℃(14.00%)和34～35 ℃(12.86%)條件下的萌發(fā)率。本研究發(fā)現(xiàn)，PEG-6000 模擬的干旱脅迫顯著抑制羅漢果伯林2號種子的萌發(fā)和幼苗的長勢，并推遲種子的萌芽啟動時間。說明溫度和降水亦是影響羅漢果種子萌發(fā)和幼苗生長的重要環(huán)境因子，這與Wei 等[18]認(rèn)為溫度和降水是影響羅漢果分布和生長的主要環(huán)境因子相互印證。干旱脅迫降低植物的吸水能力和水勢，從而對植物各種生理過程產(chǎn)生負(fù)面影響[22]。研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下可溶性糖的轉(zhuǎn)運(yùn)減少會影響植物細(xì)胞內(nèi)可溶性碳水化合物的積累，進(jìn)而影響植物的生長和發(fā)育[25]。本研究從浸種、酸脅迫和干旱脅迫等多方面探索羅漢果伯林2號種子的萌發(fā)情況，為后期相關(guān)種子的研究和生產(chǎn)中羅漢果種子的萌發(fā)提供參考。

4 結(jié)論

(1)羅漢果伯林2號種子吸水吸脹主要集中在浸種24 h 內(nèi)，尤其是前8 h；吸收的水分主要儲存在種殼邊緣厚壁纖維間的大量縫隙和死亡的海綿細(xì)胞中。

(2)浸種可使羅漢果伯林2號種子萌芽的始末時間提前7～8 d，但不會改變其發(fā)芽率和發(fā)芽勢。

(3)在酸脅迫處理中，羅漢果伯林2號種子在pH=6 時發(fā)芽率和發(fā)芽勢均表現(xiàn)最佳；隨著pH 降低，發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著降低，且發(fā)芽初始時間推遲3～6 d；酸脅迫對幼苗長勢無顯著影響。

(4)在PEG-6000 建立的干旱脅迫處理中，較高濃度PEG-6000 顯著影響羅漢果伯林2號種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢，以及幼苗的長勢，且濃度越高，對種子的萌發(fā)和幼苗生長影響越大。不同程度的干旱脅迫致使其發(fā)芽初始時間推遲6～22 d。