劉守柱 張希鵬 郝軒卉 任憲鑾 王世賢 聶玉恒 吳蕊

關(guān)鍵詞：萊氏綠僵菌；轉(zhuǎn)錄組分析；致病形態(tài)；非致病形態(tài)；形態(tài)轉(zhuǎn)變；離體培養(yǎng)

萊氏綠僵菌[Metarhizium rileyi（Farlow）Kep-ler]（Hypocreales：Clavicipitaceae）原名萊氏野村菌（Nomuraea rileyi），是一種重要的昆蟲生防真菌，可在田間自然發(fā)生并對60多種鱗翅目害蟲，尤其是夜蛾科害蟲，如甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）及近年入侵我國的草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等有明顯的致病作用，是一種具有廣闊應(yīng)用前景的生防真菌。雖然萊氏綠僵菌在害蟲生物防治領(lǐng)域有突出的優(yōu)點，但較慢的致死速度是制約其大規(guī)模利用的瓶頸。例如，用1x108個孢子/mL的萊氏綠僵菌孢子懸液處理斜紋夜蛾3齡幼蟲，半致死時間（LT50）為5.5～6.6d；處理4、5齡幼蟲時，LT50分別延長至9.8、11.0d。

萊氏綠僵菌的致病機制是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，可以簡單歸納為孢子在昆蟲體壁上的粘附、萌發(fā)、體壁穿透等體外侵染過程，以及侵入寄主血腔后的增殖、變形、分泌毒素、組織破壞等體內(nèi)發(fā)育過程。體外過程決定侵染成功率，體內(nèi)過程決定致死速度。研究表明，萊氏綠僵菌成功侵入昆蟲血腔后，菌體在發(fā)育初期以小而短的酵母狀形態(tài)存在，稱為蟲菌體（hyphal body，Hb），以芽殖的方式大量增殖，此時寄主正常進食、蛻皮和生長；當(dāng)菌體數(shù)量達到一定密度閾值后，酵母狀的Hb不再進行芽殖，而是向兩端生長，形成細長的菌絲，并分泌毒素殺死寄主。萊氏綠僵菌的體內(nèi)發(fā)育過程表明該菌是一種二型性真菌（di-morphism fungus），蟲菌體是非致病形態(tài)，不會影響寄主的生長，只有當(dāng)其轉(zhuǎn)變?yōu)榫z后，才能表現(xiàn)出殺蟲效果，是致病形態(tài)。這種二型性轉(zhuǎn)變是萊氏綠僵菌發(fā)揮殺蟲作用的決定因素。

萊氏綠僵菌的二型性轉(zhuǎn)變受基因調(diào)節(jié)。為了明確哪些基因參與或調(diào)節(jié)其二型性轉(zhuǎn)變過程，本研究分別提取離體培養(yǎng)的萊氏綠僵菌的非致病形態(tài)和致病形態(tài)菌體，進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，以挖掘與二型性轉(zhuǎn)變有關(guān)聯(lián)的基因和調(diào)節(jié)通路，為深入理解萊氏綠僵菌的致死機制及提高致死速度提供有益的借鑒。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試菌株為聊城大學(xué)昆蟲病理實驗室長期保存的萊氏綠僵菌Nr 5772菌株，用SMAY培養(yǎng)基（1%麥芽糖，1%蛋白胨，1%酵母提取物．1.2%瓊脂粉）繼代培養(yǎng)后保存于4℃冰箱中。試驗前將其接種到寄主體內(nèi)進行復(fù)壯，然后從感病死亡的蟲體上重新分離菌株，培養(yǎng)于SMAY平板中待用。

1.2樣品制備

為了最大限度地模仿昆蟲體內(nèi)環(huán)境，采用昆蟲血清培養(yǎng)基Sf-900TMⅡ作為培養(yǎng)基質(zhì)，接種新鮮、無菌的萊氏綠僵菌分生孢子，25℃、180r/min振蕩培養(yǎng)。按以下方法分別制備非致病形態(tài)和致病形態(tài)樣品各3份，每份樣品菌體數(shù)量>108個。

非致病形態(tài)樣品制備：振蕩培養(yǎng)48h后，取少量培養(yǎng)液鏡檢所含蟲菌體的形態(tài)和數(shù)量，若菌體依然是酵母狀且數(shù)量較多（密度在107～108個/mL之間），則吸取10mL培養(yǎng)液，5000r/min離心10min，棄去上清，再用無菌水重新懸浮、離心、棄上清，如此清洗2次，最后棄去上清，沉淀物即為待測樣品，液氮速凍后-80℃冰箱保存。若培養(yǎng)液已有菌體呈現(xiàn)菌絲形態(tài)，則該培養(yǎng)液不用于非致病形態(tài)樣品制備。

致病形態(tài)樣品制備：振蕩培養(yǎng)60h后，取少量培養(yǎng)液進行鏡檢，當(dāng)大多數(shù)菌體已由酵母狀變成兩端尖尖的線狀菌體，但還有少量酵母狀的菌體時，說明萊氏綠僵菌正在進行形態(tài)轉(zhuǎn)變，則吸取10mL培養(yǎng)液，用2層50um的纖維素濾膜過濾，然后用無菌水清洗2次，洗脫吸附在濾膜上的絲狀菌體，5000r/min離心10min，所得沉淀即為待測樣品，液氮速凍后-80℃冰箱保存待用。

1.3轉(zhuǎn)錄組測序

將制得的兩種形態(tài)樣品送至深圳微科盟生物技術(shù)有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序，3次生物學(xué)重復(fù)。

采用TRIzol法提取總RNA，然后用Oligo（dT）磁珠富集、純化帶有polyA尾的mRNA；以該mRNA為模版，以隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中合成cDNA第一條鏈：隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymeraseI體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第二條鏈。純化后的雙鏈cDNA經(jīng)過PCR擴增最終獲得文庫，庫檢合格后，進行Illumina高通量測序。

1.4測序數(shù)據(jù)過濾及質(zhì)量評估

采用Trimmomatic軟件去除測序原始數(shù)據(jù)（raw reads）中的測序接頭及測序質(zhì)量較低的reads，獲得干凈測序數(shù)據(jù)（clean reads）；為保證數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量及可靠性，進一步計算堿基質(zhì)量值Q20．Q30以及GC含量進行質(zhì)量評估，評估合格后用于后續(xù)分析。

1.5轉(zhuǎn)錄本拼接及質(zhì)量評估

采用Trinity對合格的clean reads進行拼接．獲得轉(zhuǎn)錄本序列，然后進行Corset層次聚類分析，聚合冗余轉(zhuǎn)錄本，在每個聚類中選出最長的轉(zhuǎn)錄本作為該聚類的代表序列，定義為Unigene序列。使用單拷貝直系同源基因，采用BUSCO軟件對轉(zhuǎn)錄本進行質(zhì)量評估，評價拼接結(jié)果的準確性和完整性。評估合格的轉(zhuǎn)錄本用于后續(xù)分析。

1.6Unigene功能注釋

通過7個數(shù)據(jù)庫比對獲得Unigene的生物學(xué)功臺旨信息，包括NR（NCBI

Non-Redundant ProteinSequence Database）、NT（NCBI

Nucleotide

Se-quence Database）、KOG（Clusters of OrthologousGroups for Eukaryotic Complete Genomes）、SWISS-PROT、UniProt（Universal Protein Knowledgebase）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Ge-nomes）、GO（Gene Ontology）數(shù)據(jù)庫。

1.7差異表達基因分析

采用DESeq2軟件，根據(jù)每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobaseper million，F(xiàn)PKM）對測序深度進行校正，以一個基因在兩組樣品中的表達量差異達到兩倍以上[llog2（Fold Change）>1]且校正P值（adjust Pvalue，P）<0.05為差異基因標準，篩選萊氏綠僵菌在形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中上調(diào)和下調(diào)表達的基因，繪制火山圖，并根據(jù)功能注釋結(jié)果進行GO富集和KEGG富集分析。

2結(jié)果與分析

2.1萊氏綠僵菌非致病形態(tài)和致病形態(tài)的鑒別

經(jīng)過顯微鏡觀察，萊氏綠僵菌在非致病形態(tài)和致病形態(tài)之間有非常明顯的區(qū)別（圖1）。非致病形態(tài)菌體酵母狀，菌體短，側(cè)面或頂端多有拇指狀的芽突，以出芽的形式進行增殖；致病形態(tài)菌體長，兩端尖細，游離或聚集成簇，數(shù)量不再增加。

2.2萊氏綠僵菌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及質(zhì)量評估

由表1可見，測序后各樣本的原始堿基數(shù)量均在6G以上，組成42M以上的原始序列，過濾后得到的干凈堿基數(shù)量高于5.5G，形成的干凈序列>37M，數(shù)據(jù)有效率>86%；Q20值均為100%，Q30值≥99.86%，錯誤率均為0.03%，遠低于0.1%的閾值，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的分析。

2.3轉(zhuǎn)錄本拼接及質(zhì)量評估

兩組樣品的clean reads經(jīng)過拼接后共得到142263個轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)過Corset聚類分析后歸人90528個不同的類中，進一步聚合冗余轉(zhuǎn)錄本后，共得到89498個Unigene。利用BUSCO軟件，與真核生物直系同源基因庫比對，完整的雙拷貝基因比對成功率為93%，完整的單拷貝基因比對成功率為7%，沒有基因片段和比對不成功的基因，說明轉(zhuǎn)錄本拼接準確、完整（圖2）。

2.4Unigene功能注釋

大部分（84.45%） Unigene在1個及以上數(shù)據(jù)庫中得到注釋，只有15.55%的基因沒有得到注釋（表2）。在7個數(shù)據(jù)庫中，注釋到NR數(shù)據(jù)庫的Unigene最多，占78.69%；注釋到GO數(shù)據(jù)庫的Unigene數(shù)量最少，占41.59%；同時在7個數(shù)據(jù)庫中得到注釋的Unigene占比20.72%。

2.4.1GO功能注釋

在GO數(shù)據(jù)庫中得到注釋的Unigene，功能主要集中在生物學(xué)過程（biologi-cal process．BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個子類（圖3）。在BP子類中，與細胞過程（cellularprocess）、基因表達調(diào)控（regulation of gene expres-sion）、蛋白質(zhì)定位（protein localization）相關(guān)的基因最多；在CC子類中，與細胞質(zhì)（cytoplasm）、胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器（intracellular membrane-boundedorganelle）、細胞核（nucleus）有關(guān)的基因最多；在MF子類中，注釋到催化活性（catalytic activity）、水解酶活性（hydrolase activity）、轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity）的基因最多。

2.4.2KOG注釋結(jié)果KOG注釋成功的基因在25個組別中的分布狀況如圖4所示。其中，與主要功能預(yù)測（general function prediction only）有關(guān)的基因注釋最多，其次是與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白（posttranslational modification．pro-tein turnover，chaperones）有關(guān)的基因，以及與翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（translation，ribosomalstructure and biogenesis）有關(guān)的基因。

2.4.3KEGG注釋注釋到KEGG的基因分屬于細胞過程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（En-vironmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、代謝（Metabo-lism）、生物系統(tǒng)（Organismal Systems）5個子類（圖5）。其中，注釋到代謝子類的基因最多，與之相關(guān)的代謝通路（metabolic pathways）占比最高，達到10.95%，次生代謝物的生物合成（biosynthe-sis of secondary metabolites）次之，占比4.56%，說明此時萊氏綠僵菌的代謝活動旺盛：其次是遺傳信息處理子類，與核糖體和RNA轉(zhuǎn)運有關(guān)的基因占優(yōu)；在細胞過程子類中，與細胞內(nèi)吞、細胞周期、細胞自噬、減數(shù)分裂相關(guān)的基因最多，與群體感應(yīng)相關(guān)的基因也位于前列，說明萊氏綠僵菌的二型性轉(zhuǎn)變與群體感應(yīng)調(diào)節(jié)有關(guān)：在環(huán)境信息處理子類中，與MAPK信號途徑、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、雙元系統(tǒng)有關(guān)的基因位于前列．cAMP、Ras、AMPK等信號途徑也有較高的表達：在生物系統(tǒng)子類中，與Thermogenesis有關(guān)的基因表達量較高。

2.5差異表達基因分析

用DEseq2軟件對獲得的測序數(shù)據(jù)進行標準化后，以llog2（ Fold Change）l>1且P<0.05為標準篩選差異表達基因。結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，在89498條基因中，差異表達基因占7.58%，其中，上調(diào)表達的有3113個，下調(diào)表達的有3671個。根據(jù)注釋結(jié)果，對得到的差異表達基因進行GO富集和KEGG富集分析，未能富集到有效的差異基因。

3討論與結(jié)論

昆蟲病原真菌雖然有很好的靶標特異性和環(huán)境安全性，但由于該類生物制劑在田間使用時效果不穩(wěn)定、病程長、致死慢，無法及時有效地控制害蟲暴發(fā)危害，制約其大面積應(yīng)用。據(jù)統(tǒng)計，2018年我國生物農(nóng)藥產(chǎn)量2.9萬t，其中微生物農(nóng)藥占34%，生物農(nóng)藥總體防治覆蓋率約為10%，微生物制劑的使用更少，遠遠落后于化學(xué)農(nóng)藥的使用率。而提高微生物制劑殺蟲效果的最簡便方法就是與化學(xué)農(nóng)藥聯(lián)合使用：如劉守柱等研究表明高效氯氰菊酯在亞致死劑量時可以提高萊氏綠僵菌對斜紋夜蛾的毒力，但聯(lián)合使用會削弱微生物制劑綠色、安全的環(huán)保優(yōu)勢。

不同種類的昆蟲病原菌可能有不同的致死機制。萊氏綠僵菌已經(jīng)被證明是二型性真菌，存在致病和非致病兩種形態(tài)，其中非致病形態(tài)持續(xù)時間較長，但一旦轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏⌒螒B(tài)就可以很快把寄主殺死．因此，加快其向致病形態(tài)的轉(zhuǎn)變是縮短該病原菌潛伏期以提高致死速度的關(guān)鍵。Boucias等研究指出，萊氏綠僵菌的這種二型性轉(zhuǎn)變可能是受群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）調(diào)節(jié)和控制的，但尚無直接證據(jù)支持。本研究通過KEGG注釋發(fā)現(xiàn)，萊氏綠僵菌形態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中，與QS通路有關(guān)的基因表達量較高，為萊氏綠僵菌的QS調(diào)節(jié)機制提供了分子方面的初步證據(jù)。雖然在進一步的差異表達基因富集分析中并未發(fā)現(xiàn)集中在QS信號通路上的差異表達基因，但我們?nèi)栽诓町惐磉_基因庫中篩選到了與QS有關(guān)的上調(diào)和下調(diào)基因，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。

自誘導(dǎo)分子（autoinducers）是啟動QS系統(tǒng)的開關(guān)，不同的菌體中具有不同的誘導(dǎo)分子．并且不同的誘導(dǎo)分子誘導(dǎo)的方向不同。本研究對萊氏綠僵菌的兩種不同形態(tài)進行了轉(zhuǎn)錄組測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在其二型性轉(zhuǎn)變過程中有多個生理過程發(fā)生了明顯變化，尤其是與代謝有關(guān)的基因高表達，說明此時代謝活動旺盛，可能會產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，而這些代謝產(chǎn)物中的某些成分可能會充當(dāng)自誘導(dǎo)分子，誘導(dǎo)QS系統(tǒng)的調(diào)節(jié)活動。在眾多的代謝產(chǎn)物中，金合歡醇（farnesol）是一種公認的QS誘導(dǎo)分子，但它的主要功能是誘導(dǎo)菌體處于酵母狀態(tài)，與萊氏綠僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變方向相反；4-羥基苯乙醇（tyrosol）是另外一種常見的誘導(dǎo)分子，誘導(dǎo)產(chǎn)生菌絲形態(tài)的菌體，與萊氏綠僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變方向正相關(guān)。金合歡醇和4-羥基苯乙醇亦有可能協(xié)同調(diào)節(jié)真菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變。

本研究還發(fā)現(xiàn)MAPK等與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)的基因表達也處于前列，說明形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中細胞間的信息交流頻繁，可能是胞外的信號傳導(dǎo)入細胞內(nèi)，引起細胞增殖方式改變，由出芽增殖改變?yōu)闃O性生長，從而引起形態(tài)的改變。Ras蛋白是激活MAPK途徑的重要分子，對真菌的致病力有非常重要的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)Ras基因表達量較高，因其功能主要是調(diào)節(jié)真菌產(chǎn)孢和菌絲生長，間接證明萊氏綠僵菌的致病力確實與菌體形態(tài)有關(guān)，即菌絲是致病形態(tài)。萊氏綠僵菌菌絲的形成與Ras超家族中的RacA和Cdc-42蛋白有關(guān)，它們在萊氏綠僵菌微菌核形成過程中調(diào)控菌絲的極性生長．因而也很有可能參與寄生過程中萊氏綠僵菌的形態(tài)轉(zhuǎn)變。

由于缺乏可參考的萊氏綠僵菌全基因組注釋圖譜，本研究雖然篩選到了6000多個差異表達基因，但無法比對到萊氏綠僵菌的基因組中，導(dǎo)致GO和KEGG富集分析均無結(jié)果，說明在萊氏綠僵菌基因組研究方面依然較為薄弱。此外，本研究所用材料是在離體狀況下制備而來，與昆蟲體內(nèi)的真實狀況存在差異，今后將繼續(xù)進行活體轉(zhuǎn)錄組分析，以進一步探討萊氏綠僵菌的二型性轉(zhuǎn)變機制。