郝浩永,王 紅,劉 縉,關(guān)正君,李文清,楊先先

(1.運(yùn)城學(xué)院 理科實(shí)驗(yàn)中心;2.運(yùn)城學(xué)院 生命科學(xué)系,山西 運(yùn)城 044000)

雙生病毒是在世界范圍內(nèi)廣泛存在的一類(lèi)植物病毒[1],可侵染多種作物引起嚴(yán)重的病害,造成重大的經(jīng)濟(jì)損失,并經(jīng)常危及糧食安全[2,3]。雙生病毒具有小的單組份(DNA-A)或雙組份(DNA-A和DNA-B)單鏈環(huán)狀基因組DNA (約2.5～5.2 nt),編碼4～8個(gè)基因。

在雙生病毒科14個(gè)屬中,有4個(gè)屬,即甜菜曲頂病毒屬(Curtovirus) (3種)、番茄偽曲頂病毒屬(Topocuvirus) (1種)、蕪菁曲頂病毒屬(Turncurtovirus) (3種)和菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus) (>420種)均含有一個(gè)小基因AC4,該基因完全疊加在AC1基因中[4]。雙組份雙生病毒DNA-A上的C4基因被稱(chēng)為AC4基因,單組份雙生病毒DNA-A上的C4基因被稱(chēng)為C4基因或AC4基因,對(duì)其他基因的稱(chēng)謂類(lèi)似[4]。AC1基因在整個(gè)雙生病毒科的基因組位置和功能上是保守的[4]。AC4基因覆蓋在AC1基因靠近5′端的部分,AC4的密碼子相對(duì)于AC1的密碼子向后移動(dòng)1個(gè)堿基,即+1位移碼[5-7]。AC4可能起源于AC1內(nèi)的重疊機(jī)制,基因重疊允許病毒增加編碼能力,隨后增加遺傳變異,同時(shí)保持小而緊湊的基因組。這可以解釋AC4基因功能變異,并有助于雙生病毒多樣化和宿主跳躍。AC4基因相當(dāng)大的變異不僅表現(xiàn)在序列上,而且也表現(xiàn)在其編碼的蛋白質(zhì)長(zhǎng)度上(58～140 aa);有趣的是,一些氨基酸殘基是保守的[8]。

在系統(tǒng)發(fā)育上,Begomovirus病毒的基因中AC4基因最易變異[8]。雖然AC4基因在少數(shù)Begomovirus中不發(fā)揮作用[9,10],但在大多數(shù)Begomovirus中具有多種生物學(xué)功能,例如病毒運(yùn)動(dòng)[11]、 RNA沉默的抑制[12-14]、癥狀誘導(dǎo)[15]、促進(jìn)過(guò)敏反應(yīng)[16]、誘導(dǎo)增生[17-19]、增加病毒積累[19]、提高耐旱性[20]、維持β衛(wèi)星分子(betasatellite)的存在[21],以及增強(qiáng)番茄對(duì)白粉病的抗性[22]等。AC4基因還表現(xiàn)出與人類(lèi)病毒“致癌基因”相似的功能[23, 24]。

有文獻(xiàn)[25]報(bào)道,中國(guó)番茄黃化曲葉病毒TYLCCNV-Y10分離物編碼的AC4蛋白和煙草曲莖病毒TbCSV-Y35分離物的AC4蛋白都是RNA沉默抑制子, 而 Y35 AC4 蛋白是一個(gè)比 Y10 AC4 蛋白更強(qiáng)的抑制子,推測(cè) TbCSV-Y35 和 TYLCCNV-Y10 致病性差異可能與二者AC4蛋白的功能差異有關(guān)。

通常雙生病毒IR區(qū)的變異最大[26-29]。我們?cè)谇捌谘芯恐衃30],將Begomovirus病毒分離物SXYC-X4(GenBank登錄號(hào):KY499720)與其他25種病毒分離物的DNA-A及ORFs的序列比對(duì),發(fā)現(xiàn)AC4蛋白氨基酸序列變異(32.9%～97.9%)大于IR區(qū)(61.5%～99.7%)及其他ORFs氨基酸序列的變異。在系統(tǒng)發(fā)育上,SXYC-X4與TbCSV-India(KF551584)的進(jìn)化關(guān)系在DNA-A全序列水平較遠(yuǎn),在IR區(qū)水平稍近,在AC4氨基酸序列水平最近。由此推測(cè),自然界中番茄黃化曲葉病毒(TomatoYellowLeafCurlVirus,TYLCV)與煙草曲莖病毒(TobaccoCurlyShootVirus,TbCSV)在AC4基因處可能已經(jīng)發(fā)生了廣泛的重組,TYLCV有可能會(huì)獲得更強(qiáng)的致病性。

SXYC-X4AC4基因預(yù)期編碼一個(gè)約10 KD的蛋白質(zhì),其功能目前尚不明確。我們克隆了AC4基因,構(gòu)建了AC4基因的原核表達(dá)載體,進(jìn)一步優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)條件,研究結(jié)果為下一步大量制備并分離純化AC4蛋白、制備抗血清及研究SXYC-X4AC4基因的功能奠定基礎(chǔ),同時(shí)對(duì)解析雙生病毒的致病機(jī)制及開(kāi)發(fā)綠色防控技術(shù)也具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

確認(rèn)已感染雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)番茄黃化曲葉病毒(TYLCV)的番茄病株,于2016年8月采自運(yùn)城學(xué)院新校區(qū),主要癥狀為新葉黃化、卷曲,節(jié)間縮短等[30]。參照文獻(xiàn)[31],提取病株葉片基因組DNA作為病毒毒源,-20℃保存。以健康番茄葉片作為對(duì)照材料。

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3),原核表達(dá)載體pGEX-4T-1為運(yùn)城學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;DNA Marker為合肥博美生物有限公司產(chǎn)品;克隆載體pGM-T為北京天根生物公司產(chǎn)品;蛋白質(zhì)Marker、EX Taq、限制性?xún)?nèi)切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品;T4 DNA Ligase為GenView公司產(chǎn)品;引物合成委托生工生物工程(上海)有限公司完成;其余藥品為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 AC4基因的克隆

根據(jù)TYLCV分離物SXYC-X4(GenBank登錄號(hào):KY499720)序列,合成一對(duì)特異性引物TYAC4-F(5’-GAATTCACGAGAATGGGGAAC-3’,方框中ATG為起始密碼子,下劃線處為EcoR I酶切位點(diǎn),)和TYAC4-R(5’-GTCGACTATAGTCCTTTGGGG-3’,與AC4基因終止密碼子下游10～25 bp處互補(bǔ),下劃線處為Sal I酶切位點(diǎn))。以番茄病株基因組DNA為模板,利用EX Taq對(duì)AC4基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為:模板1 μL,EX Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL,10×Buffer 5 μL,上下游引物(10 μM)各1 μL,dNTP Mixture(2.5 μM Each)10 μL,加入ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 60 s,47℃ 45 s,72℃ 45 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、純化后,依說(shuō)明書(shū)連接至克隆載體pGM-T,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,在LB固體培養(yǎng)基(含100 μg/L氨芐西林)上37℃培養(yǎng)12—16h進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,挑取白色單克隆菌落培養(yǎng),堿裂解法提取質(zhì)粒DNA,經(jīng)EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒正確后,由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序?？寺〕晒Φ妮d體命名為pGM-AC4。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組克隆載體pGM-AC4與pGEX-4T-1分別用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切,回收目的片段后用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化DH5α,挑取部分單克隆培養(yǎng),用測(cè)序引物GEX5(5’-GCAAGCCACGTTTGGTG-3’)和GEX3(5’- GAGCTGCATGTGTCAGAGG -3’) 做菌液PCR篩選陽(yáng)性重組子。PCR反應(yīng)體系同1.2。PCR反應(yīng)條件為:94℃ 5 min;94℃ 60 s,50℃ 45 s,72℃ 45 s,35個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。將菌液PCR篩選為陽(yáng)性重組質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序,分析是否有移碼突變。序列正確的重組表達(dá)載體命名為pGEX-4T-AC4。

1.4 誘導(dǎo)表達(dá)

利用熱激法,將重組表達(dá)載體pGEX-4T-AC4轉(zhuǎn)化BL21(DE3)并進(jìn)行涂板培養(yǎng),挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中(含100 μg/L氨芐西林),37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm≈0.6,加入IPTG至終濃度為0.50 mol/L,于28 ℃下誘導(dǎo)4 h(200 rpm),取1 mL菌液加入1.5 mL EP管中,離心1 min(12000 rpm),棄上清,重復(fù)三次,富集菌體。用200 μL滅菌蒸餾水重懸,再加入200 μL 2×SDS凝膠上樣緩沖液,沸水中裂解5 min,溫度降至室溫后,12000 rpm離心5 min,上清液立即進(jìn)行SDS-PAGE,檢測(cè)GST-AC4可溶性融合蛋白,或-20℃保存?zhèn)溆谩：琾GEX-4T-1的BL21(DE3)菌液作為對(duì)照做相同處理。

1.5 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

為獲得最佳的誘導(dǎo)條件,分別對(duì)IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化,使用SDS-PAGE檢測(cè)。

IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化。細(xì)菌培養(yǎng)及處理方法同1.4,IPTG終濃度梯度設(shè)為0、0.10、0.25、0.50、1.0、2.0 mmol/L,28℃振蕩培養(yǎng)4 h(200 rpm)。

誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化。細(xì)菌培養(yǎng)及處理方法同1.4,時(shí)間梯度設(shè)為0、2、3、4、5、6 h,IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L,28℃振蕩培養(yǎng)(200 rpm)。

誘導(dǎo)溫度優(yōu)化。細(xì)菌培養(yǎng)及處理方法同1.4,溫度梯度設(shè)為25℃、28℃、32℃、35℃、37℃,IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5 mmol/L,200 rpm振蕩培養(yǎng)4 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果

以病株樣品和健康番茄基因組DNA為模板,利用引物TYAC4-F和TYAC4-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從病株中擴(kuò)增出大小約為330 bp的條帶,與預(yù)期大小一致,而健康植株中未擴(kuò)增出,初步確認(rèn)擴(kuò)增出的條帶為番茄黃化曲葉病毒AC4基因(圖1)。

M:DNA marker; 1—2:健康番茄樣品; 3:感病番茄樣品。圖1 用引物TYAC4-F和TYAC4-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果

2.2 AC4基因測(cè)序結(jié)果

經(jīng)測(cè)序,克隆到的AC4基因長(zhǎng)294 bp,重組克隆載體暫命名為pGM-AC4。通過(guò)BLAST比對(duì)分析,克隆到的AC4基因與番茄黃化曲葉病毒分離物SXYC-X4的AC4基因序列完全一致。

2.3 AC4基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及檢測(cè)

經(jīng)菌液PCR檢測(cè),部分重組原核表達(dá)載體能擴(kuò)增出大小約為500 bp的條帶,而空載體僅能擴(kuò)增出約170 bp的條帶,與預(yù)期大小一致(圖2),表明AC4基因片段已插入到載體pGEX-4T-1。重組成功的原核表達(dá)載體暫命名為pGEX-4T-AC4。經(jīng)測(cè)序比對(duì),pGEX-4T-AC4的序列未發(fā)生變異,讀碼框正確,可以進(jìn)行下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.4 pGEX-4T-AC4的誘導(dǎo)表達(dá)

采用熱激法,將pGEX-4T-AC4和空載體pGEX-4T-1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。經(jīng)0.50 mol/L的IPTG在28℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h(200 rpm),SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn),pGEX-4T-AC4表達(dá)出大小約為36 KD的蛋白,與預(yù)測(cè)大小一致,未經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的樣品則沒(méi)有該蛋白,含pGEX-4T-1的菌株在誘導(dǎo)后出現(xiàn)大小約為26 KD的蛋白。BL21(DE3)空菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)前后無(wú)明顯差異,說(shuō)明pGEX-4T-AC4成功表達(dá)GST-AC4融合蛋白(圖3)。

2.5 最優(yōu)誘導(dǎo)條件的篩選

菌體經(jīng)過(guò)0.10～2.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后均有目的蛋白表達(dá),未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體幾乎無(wú)目的蛋白表達(dá)(圖4)。通過(guò)Tanon Image凝膠分析軟件測(cè)定(下同),隨著IPTG濃度的增加,GST-AC4融合蛋白的表達(dá)量呈先增加后穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)IPTG濃度為0.50 mmol/L時(shí),該蛋白表達(dá)量最高,繼續(xù)增加IPTG濃度后GST-AC4表達(dá)量基本不再增加。從經(jīng)濟(jì)角度考慮,0.50 mmol/L是IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。

加入0.50 mmol/L IPTG后誘導(dǎo)不同時(shí)間的重組載體表達(dá)結(jié)果如圖5所示,經(jīng)過(guò)2 h、3 h、4 h、5 h、6 h誘導(dǎo)后的菌體均有目的蛋白表達(dá)。通過(guò)凝膠分析軟件測(cè)定,結(jié)果顯示,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,GST-AC4融合蛋白的表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí),該蛋白表達(dá)量最高,繼續(xù)增加誘導(dǎo)時(shí)間后表達(dá)量逐步降低,即誘導(dǎo)3 h是最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

M:Premixed Protein Marker(Broad);1—6:誘導(dǎo)時(shí)間分別為0 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h。圖5 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GST-AC4融合蛋白表達(dá)的影響

加入0.50 mmol/L 的IPTG后在不同溫度下誘導(dǎo)GST-AC4融合蛋白表達(dá)結(jié)果如圖6所示,分別在25℃、28℃、32℃、35℃、37℃下誘導(dǎo)3 h后的菌體均有目的蛋白表達(dá)。通過(guò)凝膠分析軟件測(cè)定,結(jié)果顯示,隨著誘導(dǎo)溫度的增加, GST-AC4融合蛋白的表達(dá)量呈先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為32℃時(shí),該蛋白表達(dá)量最高,繼續(xù)提高誘導(dǎo)溫度后表達(dá)量逐步降低,即32℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

3 結(jié)果與討論

病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白在寄主體內(nèi)的含量通常很低,一般很難從寄主體內(nèi)提純這些蛋白。本文利用基因工程手段,克隆了雙生病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因AC4,構(gòu)建了原核表達(dá)載體,在BL21(DE3)菌株中成功表達(dá)了GST-AC4融合蛋白,進(jìn)一步優(yōu)化了誘導(dǎo)表達(dá)條件, 為大量制備AC4蛋白及研究AC4功能奠定基礎(chǔ)。

前期研究中[30],我們是分段擴(kuò)增病毒DNA-A片段并將PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的,本實(shí)驗(yàn)只能以病株總DNA為模板擴(kuò)增AC4基因,重復(fù)性不太好,非特異性片段也經(jīng)常出現(xiàn),增加了工作難度。在后期優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件時(shí)(圖4、圖5、圖6),效果不如最初(圖3),再重復(fù)優(yōu)化前的實(shí)驗(yàn)時(shí),效果仍不理想,需進(jìn)一步查找原因并改進(jìn)。

本實(shí)驗(yàn)使用原核表達(dá)載體pGEX-4T-1表達(dá)的GST-AC4融合蛋白,其活性還需進(jìn)一步研究。下一步計(jì)劃構(gòu)建AC4基因的真核表達(dá)載體,在畢赤酵母中表達(dá)AC4蛋白,比較在不同體系中表達(dá)的蛋白的差異。