劉必坤 陳向榮 吳宗濤 周小峰 凌 茂 張 樂

陜西省安康市中醫(yī)醫(yī)院 725000

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage ,SAH)是一種嚴(yán)重的臨床疾病,通常由顱內(nèi)動脈瘤破裂引起,導(dǎo)致近85%的SAH[1-2]。動脈瘤性SAH的死亡率接近50%[3],是一種死亡率和發(fā)病率較高的腦血管疾病,嚴(yán)重威脅了患者的健康。最近的研究表明,神經(jīng)炎癥是SAH后腦損傷關(guān)鍵機(jī)制之一[4-5],而NF-κB被認(rèn)為是多種炎癥反應(yīng)過程中的重要調(diào)節(jié)因子[6]。鉤藤作為一味傳統(tǒng)中藥,已被用于治療癲癇、偏頭痛、心血管疾病,研究表明鉤藤通過抑制NF-κB通路抗氧化應(yīng)激緩解偏頭痛,通過NF-κB激活[7]來減少KA誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作[8]。因此本研究推測鉤藤可能具有改善SAH后神經(jīng)功能障礙和腦損傷的作用。本研究通過觀察鉤藤對 SAH 后大鼠神經(jīng)功能,基底動脈直徑,細(xì)胞凋亡,IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)水平以及大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB-p65表達(dá)的影響,揭示鉤藤對大鼠 SAH 后早期腦損傷的緩解作用,同時探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 SPF級SD雄性大鼠80只,質(zhì)量為280～320g,由西安交通大學(xué)動物實(shí)驗中心提供。動物實(shí)驗設(shè)施由陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗中心提供,并由該校動物管理和倫理委員批準(zhǔn)。

1.2 中藥鉤藤 經(jīng)安康市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科鑒定均為正品,通過水煎醇沉法制備,得質(zhì)量濃度為5. 0g/ml 的鉤藤浸膏備用,4℃冰箱保存。

1.3 試劑 BCA蛋白定量檢測試劑盒,TUNEL試劑盒(上海鈺博生物科技有限公司),NLRP3、Caspase-1、NF-κB抗體(美國CST公司),SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(武漢谷歌生物有限公司),IL-1β、IL-6和IL-18,ELISA試劑盒(南京建成生物工程有限公司)。

1.4 儀器 POLARstar OPTIMA型酶標(biāo)儀(德國BMG公司);VE-180型電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(上海天能科技有限公司);TGL-16c型臺式離心機(jī)(中國上海安亭科技儀器廠);80i型普通光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司);KZ-11型勻漿儀(中國康濤科技有限公司);V300型掃描儀(日本Epson公司);RM2016型病理切片機(jī)(中國上海徠卡儀器有限公司)。

1.5 研究方法

1.5.1 造模、分組及給藥。SD雄性大鼠,在無菌潔凈的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)7d,自由攝取飼料和水。枕大池注血法制作大鼠SAH動物模型,制作成功的60只模型隨機(jī)分為模型組(SAH組)、鉤藤低劑量組(LD組)、鉤藤高劑量組(HD組),每組20只;假手術(shù)組(Sham組)20只大鼠注入等量生理鹽水。鉤藤組在模型成功后隨后7d早晚各1次經(jīng)胃給大鼠連續(xù)給藥。根據(jù)每1kg體質(zhì)量占有體表面積相對比值換算公式,LD、HD組分別按13g/(kg·d)、26g/(kg·d)劑量給藥。

1.5.2 大鼠神經(jīng)功能評價。第7天采用雙盲法對各組大鼠進(jìn)行Garcia神經(jīng)功能評分,分別從以下6個方面:自發(fā)活動、四肢運(yùn)動的對稱性、攀爬能力、對觸須觸碰的反應(yīng)、前爪伸展和身體觸覺反射評定大鼠神經(jīng)功能損傷程度,最終得分為6項分?jǐn)?shù)的總和。神經(jīng)功能評分3～18分。

1.5.3 HE染色檢測大鼠基底動脈直徑。每組取5只大鼠,最后一次神經(jīng)功能評分后取材,將基底部位腦組織制作石蠟切片(后面試驗備用),HE染色后中性樹膠封固,使用顯微鏡及ImageJ 7.0軟件測量大鼠基底動脈直徑。

1.5.4 大鼠腦組織含水量測定。采用濕/干法檢測大鼠的腦重量。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.5 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡情況。石蠟切片,脫蠟處理后,按TUNEL試劑盒操作說明進(jìn)行操作,于400倍顯微鏡視野下觀察各組大鼠腦細(xì)胞凋亡情況。在Image軟件上,每張切片隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀察,并進(jìn)行統(tǒng)計。

1.5.6 ELISA檢測大鼠腦脊液中IL-18、IL-6和IL-1β的表達(dá)水平。IL-18、IL-1β、IL-6水平的檢測步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀在450nm波長測各孔的吸光度A,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算樣本濃度。

1.5.7 蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測基底動脈血管組織NF-κB-p65、NLRP3、Caspase-1蛋白的表達(dá)水平。每組5只大鼠,取新鮮的大鼠基底動脈處腦組織,按照組織60mg加入組織勻漿液200μl的比例混合組織,充分勻漿后在冰浴放置15min。4℃條件下1 500r/min離心5min。將樣品加入電泳孔中,進(jìn)行電泳。5%的脫脂牛奶封閉1h。加入一抗NLRP3、Caspase-1、NF-κB-p65(1∶2 000),4℃孵育過夜。次日用TBST洗滌脫色,加入對應(yīng)的二抗(1∶10 000),用TBST稀釋3 000倍,室溫下孵育30min后,同上洗滌3次,觀察蛋白帶。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Garcia評分比較 建模后第7天,與Sham組[(17.15±0.87)分]比較,SAH組大鼠Garcia評分[(9.3±1.92)分]明顯下降(P<0.01);與SAH組大鼠相比較,LD、HD組大鼠的Garcia評分[(12.65±2.78)分、(14.8±1.54)分]明顯升高(P<0.01);與LD組大鼠相比較,HD大鼠的Garcia評分升高(P<0.05)。

2.2 各組大鼠腦組織含水量比較 與Sham組大鼠[(51.56±0.78)%]相比較,SAH組大鼠腦組織含水量[(80.12±1.61)%]明顯升高(P<0.001);與SAH組大鼠相比較,LD組、HD組大鼠腦組織的含水量[(65.18±1.16)%、(61.92±0.67)%]明顯降低(P<0.01);與LD組大鼠相比較,HD組大鼠腦組織的含水量明顯降低(P<0.01)。

2.3 各組大鼠腦基底動脈直徑比較 與Sham組大鼠[(309.96±5.10)μm]相比較,SAH組大鼠腦基底動脈直徑[(249.63±3.25)μm]明顯減小(P<0.001);與SAH組大鼠相比較,LD組、HD組大鼠腦基底動脈直徑[(270.49±2.76)μm、(282.91±1.97)μm]明顯增加(P<0.01);與LD大鼠相比較,HD大鼠腦基底動脈直徑明顯增加(P<0.01)。見圖1。

圖1 各組大鼠基底動脈HE染色(×100)

2.4 各組大鼠腦細(xì)胞凋亡情況 與Sham組大鼠[(4.05±0.28)%]相比較,SAH組大鼠腦細(xì)胞凋亡率[(47.70±2.51)%]升高(P<0.001);與SAH組大鼠相比較,LD組、HD組大鼠腦細(xì)胞凋亡率[(29.85±0.90)%、(20.06±1.52)%]降低(P<0.01);與LD組大鼠相比較,HD組大鼠腦細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)。見圖2。

圖2 各組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×400)

2.5 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-6和IL-18表達(dá)水平比較 與Sham組大鼠相比較,SAH組大鼠的IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與SAH組大鼠相比較,LD組、HD組的IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與LD組大鼠相比較,HD組大鼠的IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腦脊液IL-1β、IL-6和IL-18表達(dá)水平比較

2.6 各組大鼠腦組織NF-κB-p65、NLRP3、Caspase-1表達(dá)情況 與Sham組大鼠比較,SAH大鼠腦組織NF-κB-p65、Caspase-1、NLRP3表達(dá)升高(P<0.05);與SAH組大鼠比較,LD組、HD組NF-κB-p65、Caspase-1、NLRP3表達(dá)顯著降低(P<0.05);與LD組大鼠比較,HD組大鼠腦組織NF-κB-p65、Caspase-1、NLRP3表達(dá)降低(P<0.05)。見圖3和表2。

表2 各組大鼠腦組織NF-κB-p65、Caspase-1、NLRP3表達(dá)水平比較

圖3 各組基底動脈血管組織NF-κB-p65、NLRP3、Caspase-1蛋白表達(dá)水平Western blotting圖

3 討論

SAH是一種致命的腦血管疾病,占所有卒中類型的5%～10%,是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。EBI是SAH術(shù)后患者高死亡率和致殘率的重要因素。EBI是一個復(fù)雜的病理過程,與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、血腦屏障(BBB)功能障礙等多種病理機(jī)制有關(guān)[9-10]。越來越多的證據(jù)表明,動脈瘤SAH后的EBI涉及炎癥級聯(lián)反應(yīng),特別是血管痙攣[6]。

目前研究提供了一些關(guān)于SAH后EBI的分子機(jī)制的新發(fā)現(xiàn)。首先,RARa、Mafb和Msr1的表達(dá)在小膠質(zhì)細(xì)胞中共定位,并在SAH后增加。其次,Am80激活的RARa顯著減輕了SAH后神經(jīng)功能缺損、血腦屏障的通透性,并改善了腦水腫。第三,RARa的激活顯著減少了體內(nèi)和體外SAH模型中神經(jīng)元損傷。第四,Am80處理抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的過度激活,促進(jìn)了m1～m2的表型極化。第五,用AGN196996抑制RARa逆轉(zhuǎn)了Am80的保護(hù)作用;這增強(qiáng)了下游炎癥細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的表達(dá)。第六,Msr1 siRNA和LY294002通過抑制p-Akt的表達(dá),提高p-NF-κB的表達(dá)水平,消除了Am80的抗神經(jīng)炎作用;這些作用與Msr1、p-Akt的下調(diào)和p-NF-κB-p65的上調(diào)有關(guān)。SAH后與EBI相關(guān)的眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中,NF-κB通路近年來備受關(guān)注。NF-κB是細(xì)胞中重要的核轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞對應(yīng)激、細(xì)胞因子、自由基、細(xì)菌或病毒抗原等刺激的反應(yīng)。它暗示了動脈瘤SAH中的DNA轉(zhuǎn)錄和免疫反應(yīng)[11]。當(dāng)NF-κB信號通路被激活時,NF-κB復(fù)合體的p65亞基易位到細(xì)胞核中,與DNA結(jié)合,并啟動炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[12],據(jù)報道,促炎性因子TNF-α、IL-1β、COX和MMP-9、NLRP3基因的表達(dá)受NF-κB的調(diào)控[13]。而最近研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體與IL-1β和IL18的釋放有關(guān),這加劇了SAH后的炎癥反應(yīng),促進(jìn)了EBI的發(fā)生[14]。此外NFkB信號通路部分還參與了腦血管痙攣COX-1的上調(diào)[15]。

鉤藤已用于嬰兒驚厥、心血管疾病、頭痛、頭暈、高血壓、中風(fēng)[16-17]的治療中。研究表明,鉤藤可通過降低NF-κβ激活[7]來減少KA誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作,同時鉤藤中的成分Rhy通過抑制神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-kB、ERK和p38 MAPKs,顯著降低了lps誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì),如NO、TNF和IL-1β。此外,Rhy抑制了神經(jīng)細(xì)胞的興奮性和舒張血管[18]。在脂多糖刺激小鼠中,Rhy通過心臟浸潤巨噬細(xì)胞降低TNF免疫反應(yīng)性,并通過抑制NF-κB信號通路[19]促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。Rhy可以降低大鼠癲癇發(fā)作模型中的超氧陰離子、JNK磷酸化和NF-κB激活水平。它還可以減少腦組織中的促炎細(xì)胞因子,如TNF-α和IL-6。Rhy可以通過阻斷NMDA、毒蕈堿M1和5-HT2受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性,在減弱神經(jīng)元損傷方面發(fā)揮保護(hù)作用。Rhy通過抗炎、抗氧化、抗凋亡等途徑對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有保護(hù)作用。

因此,鉤藤是否可以通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來減輕SAH后EBI仍有待深入研究,本研究結(jié)果表明鉤藤組相比于假手術(shù)組大鼠腦基底動脈直徑明顯增加,細(xì)胞凋亡減少,腦組織的含水量明顯降低,IL-1β、IL-6和IL-18的表達(dá)水平以及大鼠腦組織NLRP3、Caspase-1、NF-κB-p65表達(dá)降低,且鉤藤劑量越高,效果越明顯。

綜上所述,鉤藤能夠減輕SAH后發(fā)生EBI的大鼠腦組織的炎癥反應(yīng),減輕腦水腫和細(xì)胞凋亡,擴(kuò)張基底動脈,從而改善神經(jīng)功能?？赡苁峭ㄟ^抑制NF-κB信號通路,降低NLRP3炎性小體表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。