熊漢楨，賀小燕，樓 彤，白秀琴

(1.湖北隆中實驗室，湖北 襄陽 441000；2.武漢理工大學a.船海與能源動力工程學院，b.水路交通控制全國重點實驗室，湖北 武漢 430063)

0 前 言

菌類、藻類等污損生物極易在船舶等海洋裝備表面附著，發(fā)生海洋生物污損[1]。以海船為例，生物污損形成后，船體表面形貌被破壞，航行阻力增加，能耗加劇[2]。目前已有多種技術(shù)手段規(guī)避生物污損，其中，采用防污涂層來減少或者抑制污損生物的附著是應用最廣泛的防污手段。傳統(tǒng)的防污涂層將其負載的防污劑如三丁基錫(TBT)[3]、氧化亞銅(Cu2O)[4]等化學防污劑溶解滲出至海洋環(huán)境中，通過改變表面的附著環(huán)境或殺死污損生物，達到防污目的。但這類防污劑會影響海洋生態(tài)環(huán)境而受到使用限制[5]。因此，尋找綠色高效的新型防污劑至關(guān)重要。

鹵代過氧化物酶[6]是生物酶的一種，對海洋污損生物具有極強抑制能力，被作為防污劑[7]與商業(yè)涂料共混，構(gòu)筑了性能優(yōu)異的防污涂層[8]。但本質(zhì)屬于蛋白質(zhì)的天然鹵代過氧化物酶的穩(wěn)定性差，在pH 值和溫度等因素劇烈變化下很容易失活[9]，限制了其在防污領(lǐng)域的應用。V2O5和稀土CeO2納米顆粒(CeO2NPs)可以模擬天然鹵代過氧化物酶，作為防污劑制備的涂層都可在海洋防污測試中堅持50 d 以上，并且效果優(yōu)于其他涂層[10]。但是V2O5納米材料具有致癌性，而CeO2NPs 無毒，不會破壞海洋非目標生物，也不會破壞海洋生物鏈，有利于保護海洋生態(tài)環(huán)境。CeO2納米顆粒中的Ce3+位點在微量H2O2存在下，會催化Br-形成鹵化物[11](如HOBr)，形成的HOBr 能滅殺污損生物[12]或干擾污損生物群體感應信號[13]，抑制生物膜的形成，在初始階段抑制生物污損發(fā)生[14]。He 等[11]報道通過水熱法合成不同縱橫比的CeO2納米粒子對革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌(E.coli)具有顯著抗菌作用。

但是，納米CeO2為降低其表面能會自發(fā)團聚，導致反應面積減少[15]，Ce3+位點也相應減少，其鹵代過氧化物類酶活性有很大的提升空間。目前，已有利用碳材料提高CeO2類酶活性。Wang 等[16]通過共沉淀法合成CeO2＠C 核殼結(jié)構(gòu)，作為一種有效的鹵代過氧化物酶模擬物，對大腸桿菌(革蘭氏陰性)、金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性)和銅綠假單胞菌等典型的海洋生物表現(xiàn)出優(yōu)秀的防污性能。在眾多的碳材料當中，二維蜂窩狀碳材料氧化石墨烯(GO)由于其表面含氧官能團的存在和π-π 鍵的堆積作用，為GO 與納米晶體提供了優(yōu)良結(jié)合位點。除此也有利用GO 負載其他納米顆粒的報道，Liu 等[17]通過簡單的熱還原法將GO 與銀納米顆粒合成AgPNs＠ rGO，進而制備雙功能硅酸鹽涂層，防止銅管腐蝕和污損結(jié)垢。不過，利用GO負載CeO2以提高其鹵代過氧化物類酶活性的相關(guān)報道較少。

本工作利用傳統(tǒng)水熱反應制備GO 負載CeO2復合材料(GO-CeO2)，研究所制備材料的形貌特征、物相成分、表面Ce3+位點濃度等物理化學特性，并利用酚紅溴化反應對GO-CeO2樣品進行鹵代過氧化物類酶活性分析，系統(tǒng)地研究不同GO 含量的GO-CeO2的抗菌防污性能?？梢灶A期，GO 的負載增強了CeO2的鹵代過氧化物酶活性，從而提升了其抗菌防污的性能，為綠色防污領(lǐng)域提供新思路，同時為CeO2的類酶活性進行海洋防污奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料制備及性能表征

1.1 材 料

六水合硝酸鈰(Ce(NO3)3·6H2O，99.5%)、單層氧化石墨烯分散液(Graphene Oxide，GO，2 mg/mL)、苯酚紅(Phenol red，C19H14O5S，AR)購自上海麥克林生化科技有限公司(中國)，氫氧化鈉(NaOH，AR)、30%過氧化氫(30%H2O2)、無水乙醇(C2H5OH，AR)購自國藥化學試劑有限公司，市售氧化鈰(CeO2，99.5%)、溴化銨(NH4Br，99.9%)購自上海阿拉丁實業(yè)公司(中國)，Luria-Bertani(LB)瓊脂固體培養(yǎng)基，LB 液體培養(yǎng)基購自山東青島希望生物科技有限公司。

1.2 GO-CeO2樣品的制備

選取質(zhì)量分數(shù)分別為1%，2%，4%的GO 為Ce(NO3)3·6H2O 與NaOH 的反應產(chǎn)物CeO2的晶核生長提供負載層，采用水熱法制備不同GO 質(zhì)量分數(shù)的GO- CeO2復合材料(分別記為1%GO - CeO2，2%GO-CeO2，4%GO-CeO2)，合成過程見圖1。樣品1%GO-CeO2的制備過程為:(1)量取1.87 mL GO 溶液加入33.13 mL 去離子水中，超聲振蕩1 h；(2)稱量868 mg Ce(NO3)3·6H2O 溶解于5.00 mL 去離子水中，并放置于離心管；(3)超聲完成后將Ce(NO3)3·6H2O 溶液和1 600 mg NaOH 先后倒入GO 溶液中，室溫下攪拌30 min；(4)溶液轉(zhuǎn)移至高溫反應釜(100 ℃，24 h)；(5)離心后真空干燥(60 ℃，24 h)獲得1%GO-CeO2樣品。

圖1 GO-CeO2合成示意Fig.1 Schematic diagram of GO-CeO2 synthesis

2%和4%GO-CeO2復合材料的制備工藝與1%GOCeO2復合材料的相同，但2%GO-CeO2復合材料制備中GO 溶液體積為3.75 mL，去離子水為31.25 mL；4%GOCeO2復合材料制備中GO 溶液體積為7.50 mL，去離子水為27.50 mL。

1.3 GO-CeO2的物理化學性質(zhì)表征

利用透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100)觀察GOCeO2中CeO2的分布，并確定晶粒特征。利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM，SIRION)觀察樣品的表面形貌，附帶的能譜儀(EDS，Energy-dispersive X-ray Spectrometer)用于分析材料的元素成分。X 射線衍射儀(XRD，Empyrean)用于樣品的物相鑒定。X 射線光電子能譜儀(XPS，ESCALAB 250Xi)以鋁靶(Al -Kα，1 486.6 eV)作為輻射源，用于分析計算GO-CeO2中Ce4+和Ce3+位點濃度。紫外-可見分光光度計(UVVis，Lambda 750S)用于獲得紫外-可見反射光譜，光譜范圍為300～800 nm。

1.4 類酶活性分析

通過Hu 等[18]報道的方法分析GO-CeO2樣品模擬鹵代過氧化物酶活性的能力。GO-CeO2樣品通過重力沉降固定在面積為1 cm×1 cm 的比色皿底部。其中，含有1.0×10-2mol/L GO-CeO2樣品、2.8×10-5mol/L 酚紅、4.4×10-3mol/L NH4Br 和4.2×10-4mol/L H2O2。30%H2O2溶液不穩(wěn)定、易分解，因此在每次測試前加入。酚紅溴化過程中，比色皿最終體積為3 mL。通過UV-Vis 在432 nm 處以30 min 的固定時間間隔記錄數(shù)據(jù)，持續(xù)時間為90 min；之后以10 min 的固定時間間隔記錄數(shù)據(jù)，總持續(xù)時間為420 min。最后通過對數(shù)據(jù)的催化動力學分析比較復合材料的鹵代過氧化物類酶活性。

1.5 GO-CeO2的抗菌性能

革蘭氏陰性桿菌大腸桿菌(E.coli)用于測試樣品的抗菌性能(ATCC 25922)。E.coli 在LB 瓊脂固體培養(yǎng)基中孵育，待菌落發(fā)育完全，選取單個菌落移至LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，120 r/min 培養(yǎng)24 h。隨后用質(zhì)量分數(shù)為0.9%的生理鹽水離心菌液3 次，再用生理鹽水重懸菌液[11]。為研究GO-CeO2的抗菌性能，模擬海洋環(huán)境，將重懸菌液濃度稀釋至106/mL。然后進行重量配比，使生理鹽水懸浮液中含有5.0×10-4mol/L 樣品(1%GO-CeO2、2%GO-CeO2、4%GO-CeO2，市售CeO2作為對比)、1.0×10-3mol/L NH4Br、2.5×10-7mol/L H2O2，最終體積為50 mL。之后繼續(xù)保持E.coli 孵育在該混合溶液中(37℃，120 r/min)。4 h 后，梯度稀釋(100、10-1、10-2和10-3)菌液。用Tesler 等[19]報告的方法，每個時間間隔重復涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，通過計算樣品的抗菌效率，分析GO-CeO2的抗菌性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO 負載CeO2的形貌特征

利用水熱法合成了不同含量GO 負載CeO2復合材料，圖2 是其透射電鏡形貌。從圖2 可以看出，CeO2已成功負載于GO，不同的復合材料呈現(xiàn)不同形貌:長棒(少)+短棒(多)型的1%GO-CeO2復合材料；短棒型的2%GO-CeO2復合材料；長棒(多)+短棒(少)型的4%GO-CeO2復合材料。水熱反應中，Ce(NO3)3·6H2O 中Ce3+與OH-結(jié)合產(chǎn)生不穩(wěn)定前驅(qū)體Ce(OH)3，當OH-濃度高時，Ce3+更容易轉(zhuǎn)化為Ce4+[11]，Ce4+更傾向與OH-結(jié)合。奧斯特瓦爾德熟化(Ostwald ripening)[20]參與CeO2晶核生長過程，該自發(fā)過程誘導晶核溶解-重結(jié)晶，產(chǎn)生棒型不同的CeO2納米顆粒。1%GO-CeO2的高分辨透射電鏡形貌(HR-TEM)表明，晶格條紋間距2.71×10-4μm 對應CeO2的(200)面(圖2b1)。2%GOCeO2的HR-TEM 顯示晶格條紋間距為3.12×10-4μm，對應CeO2的(111)面(圖2b2)。4%GO-CeO2的HRTEM 顯示的晶格條紋間距中3.12×10-4μm 和2.71×10-4μm 分別對應CeO2(111)面和(200)面排列，并且可以分析出特定角度的CeO2棒型晶面分布(圖2b3)。CeO2晶體負載在GO 上，不過不同GO 負載條件下，3者CeO2的棒型和空間利用率各有差異。其中，2%GOCeO2短棒型CeO2分布均一，反應面積最大，這可能為CeO2發(fā)揮類酶活性創(chuàng)造更好的反應條件。

圖2 不同含量GO 負載CeO2 復合材料的透射電鏡形貌和高分辨透射電鏡形貌Fig.2 TEM images and high-resolution TEM images of different content of GO loaded with CeO2 composite materials

2.2 成分、結(jié)構(gòu)及表面Ce3+位點濃度

圖3 為GO-CeO2的EDS 能譜和XRD 譜。

圖3 GO-CeO2 EDS 譜和XRD 譜Fig.3 EDS patterns and XRD patterns of GO-CeO2

從圖3a 可知GO-CeO2具有明顯的C 峰，O 峰和Ce峰。從圖3b 可看出明顯的CeO2特征峰(JCPDS 43-1002)，主要2θ值為28.55°，33.08°，47.47°，56.33°，對應晶格的晶面從左往右依次是(111)，(200)，(220)，(311)。

圖4 為GO-CeO2的XPS 全譜。從圖4 可知，所有的樣品都存在C、O、Ce 元素。1%GO-CeO2，2%GOCeO2，4%GO-CeO2的元素含量見表1。

表1 GO-CeO2中C，O，Ce 的原子分數(shù) %Table 1 Atomic fraction of C，O，Ce in GO-CeO2 %

圖4 GO-CeO2 XPS 譜Fig.4 XPS spectra of GO-CeO2

圖5 為GO-CeO2的C，O，Ce XPS 精細譜。

圖5 1%GO-CeO2，2%GO-CeO2，4%GO-CeO2XPS 的C，O，Ce 精細譜Fig.5 C，O，Ce fine spectra of 1%GO-CeO2，2%GO-CeO2，4%GO-CeO2

從圖5 可知，C 精細譜(圖5a)的峰分峰后歸屬于C-C(284.8 eV)，C-O(286.2 eV)，C ＝O(288.4 eV)，COOH/COOR(289.8 eV)，π-π*(291.6 eV)[21，22]，含氧官能團和π-π*鍵證實了GO-CeO2中GO 的存在。GO-CeO2中Ce 精細譜(圖5c)中，v0(883.0 eV)[11]，v′(888.3 eV)[23]，u0(901.3 eV)，u′(907.1 eV)[24]峰歸屬于Ce3+價態(tài)，v(885.1 eV)[25]，v′′(890.8 eV)，v′′′(899.2 eV)[26]，u(903.2 eV)[25]，u′′(909.7 eV)，u′′′(917.9 eV)[27]歸屬于Ce4+價態(tài)。進一步利用公式(1)和(2)計算Ce3+和Ce4+位點濃度:

式中，Ay是峰“y”的積分面積(y指代v0、v、v′、v′′、v′′′、u0、u、u′、u′′、u′′′)，如圖5a 所示。由公式(1)和(2)計算出的3 種GO-CeO2中Ce3+、Ce4+的含量(見表2)可知，2%GO-CeO2中Ce3+濃度最高，達到38.08%。GO-CeO2中Ce 元素存在3 價和4 價，氧化物為保持電中性，一些晶格氧會從螢石結(jié)構(gòu)逃逸。O 精細譜中5 個峰(圖5b)歸屬于晶格氧OA(529.6 eV)[28]，缺陷/吸附氧OB(530.2 eV)[29]，O ＝C(531.2 eV)，O-C(532.5 eV)[21]，羥基水/碳酸鹽(534.4 eV)[30]。由CeO2化學式可知Ce與O 的比值應為1 ∶2，由表2 中OA與OB濃度計算對比后發(fā)現(xiàn)達不到該結(jié)果，因此證實了CeO2中氧空位的存在，進一步證實Ce3+濃度與CeO2中氧空位濃度相關(guān)。

表2 GO-CeO2中Ce3+，Ce4+，OA，OB含量 %Table 2 Ce3+，Ce4+，OA，OB content in GO-CeO2 %

GO -CeO2吸附邊緣表明其具有不同能帶間隙(Eg)。利用吸收系數(shù)和能帶間隙的函數(shù)關(guān)系計算Eg估計值:

式中，CeO2處于直接躍遷狀態(tài)，n為2，A是常數(shù)，α是光吸收系數(shù)，hυ是光子能量。圖6 為GO-CeO2的紫外-可見吸收光譜和能帶間隙。從圖6b 可知，Eg分別為2.86 eV(1%GO-CeO2)，2.76 eV(2%GO-CeO2)，2.91 eV(4%GO-CeO2)，均小于塊狀CeO2的3.19 eV[31]。CeO2晶格中氧空位的存在造成能帶間隙降低，表示GO-CeO2具有氧空位和Ce3+缺陷，與XPS 分析結(jié)果相互印證。除此，2%GO-CeO2還具有最多的Ce3+缺陷。CeO2缺陷對其鹵代過氧化物酶活性有積極影響[11]，預估2%GO-CeO2鹵代過氧化物的類酶活性最強。

圖6 GO-CeO2的紫外-可見吸收光譜和能帶間隙Fig.6 UV-Vis Spectra and Eg of GO-CeO2

2.3 類酶活性

波長于432 nm 處，UV-Vis 檢測酚紅消耗的光密度(optical density，簡稱od)值變化如圖7 所示。

圖7 GO-CeO2酚紅隨時間的變化值(1.0×10-2 mol/L GO-CeO2、2.8×10-5 mol/L 酚紅、4.4×10-3 mol/L NH4Br 和4.2×10-4 mol/L H2O2在3 mL 比色皿中)Fig.7 Changes of phenol red in GO-CeO2 with time(1.0×10-2 mol/L GO-CeO2，2.8×10-5 mol/L phenol red，4.4×10-3 mol/L NH4Br and 4.2×10-4 mol/L H2O2 in 3 mL cuvette)

GO-CeO2在溴源(NH4Br)和H2O2存在情況下模擬鹵代過氧化物酶，會發(fā)生溴化反應，該反應消耗酚紅。毋庸置疑，GO-CeO2樣品中不僅CeO2溴化反應消耗酚紅，而且GO 的染料吸附同樣消耗酚紅。將100 min 前3 種GO-CeO2的斜率和速率分別命名為K1%GO-CeO2、K2%GO-CeO2、K4%GO-CeO2、v1%GO-CeO2、v2%GO-CeO2、v4%GO-CeO2。根據(jù)GO-CeO2制備步驟中的數(shù)量關(guān)系，不同GO-CeO2中GO 用量比值為1 ∶2 ∶4。假設(shè)一份GO 對酚紅的吸附速率為vGO，斜率為KGO，不同GO-CeO2中CeO2消耗酚紅的斜率與速率分別是K1，K2，K4，v1，v2，v4。斜率代表單位時間內(nèi)的od 值變化趨勢。可得:

由圖7 知，公式(4)～(6)中數(shù)值K皆小于0。以上對應速率關(guān)系為:

公式(7)～(9)中數(shù)值v皆大于0。對前100 min進行曲線擬合，得到相關(guān)參數(shù)(表3)。

表3 GO-CeO2相關(guān)擬合曲線參數(shù)Table 3 Correlation fitting curve parameters in GO-CeO2

公式(5)減去2 倍的公式(4)得:

因此

公式(6)減去2 倍的公式(5)得

因此

綜合公式(10)～(13)推理得到

由斜率推測出速率對比

公式(15)證實GO-CeO2中CeO2消耗酚紅的速率1%GO-CeO2略高于2%GO-CeO2的，遠高于4%GOCeO2的。之前的成分分析表明，2%GO-CeO2具有最多Ce3+和氧空位，結(jié)合標準誤差，可推導2%GO-CeO2的消耗酚紅速率最大，其鹵代過氧化物類酶活性最大，即抗菌防污性能最強；1%GO - CeO2的類酶活性接近于2%GO-CeO2的。

2.4 抗菌防污性能

在混合有5.0×10-4mol/L GO - CeO2、1.0×10-3mol/L NH4Br、2.5×10-7mol/L H2O2的50 mL (106/mL)E.coli 生理鹽水懸浮液中，取4 h 后細菌懸浮液，進行抗菌性能分析，其結(jié)果見圖8，沒有添加GO-CeO2樣品，并且其他條件與實驗組一致的細菌數(shù)目為空白對照組(Control)。從圖8 可以看出，Control 組，市售CeO2組，GO 組，1%GO-CeO2組，2%GO-CeO2組，4%GOCeO2組的細菌數(shù)目取均值后分別為9.47×104，8.50×103，6.50×103，3.55×103，1.45×103，4×103cfu/mL(圖8a)。以空白組數(shù)據(jù)為基準，市售CeO2組，GO 組，1%GO-CeO2組，2%GO-CeO2組，4%GO-CeO2組的細菌抑制率分別為91.02%，93.13%，96.25%，98.47%，95.60%(圖8b)。GO 本身具有防污能力，微生物與GO持續(xù)接觸會導致細胞膜完整性破壞以及細胞成分氧化[32]，GO 可殺死93.13%的細菌。雖然GO 的抗菌性達到93.13%，但是該結(jié)果下的 GO 用量遠遠多于GO-CeO2。GO 的負載優(yōu)化了CeO2的鹵代過氧化物類酶活性，進而提高了其抗菌防污性能。2%GO-CeO2的細菌抑制率在其基礎(chǔ)上進一步提高至98.47%。

圖8 5.0×10-4 M GO、市售CeO2，GO-CeO2的50 mL細菌生理鹽水懸濁液(1.0×10-3 mol/L NH4Br，2.5×10-7 mol/L H2O2)4 h 后的cfu 和抑菌率Fig.8 Cfu and antibacterial rate of 5.0×10-4 mol/L GO，commercially available CeO2，GO-CeO2 in 50 mL bacterial saline suspension(1.0×10-3 mol/L NH4Br，2.5×10-7 mol/L H2O2) after 4 h

在一定條件下GO-CeO2中Ce3+位點和Ce4+位點會互相轉(zhuǎn)化。Ce 原子直接與碳納米管中的碳原子配位[33]，推測GO 中的碳原子也與CeO2中Ce 配位。Ce3+位點在H2O2存在情況下，會與H2O2鍵合。這種狀態(tài)不穩(wěn)定，產(chǎn)生羥基自由基(OH·)和氫氧根離子(OH-)的同時Ce3+位點轉(zhuǎn)化為Ce4+位點。因為OH·與溴離子(Br-)反應生成溴自由基(Br·)與OH-，而OH-質(zhì)子化生成H2O。次溴酸(HOBr)破壞細胞壁，產(chǎn)生的孔洞致使細菌內(nèi)容物泄露而死亡[34]；還干擾污損生物群體感應信號[13]，抑制生物膜形成。在H2O2與溴源(Br-)同時具備條件下，HOBr 持續(xù)擴散，發(fā)揮穩(wěn)定高效的抗菌作用。

以GO 作為負載層促進GO-CeO2鹵代過氧化物類酶活性。2%GO-CeO2表現(xiàn)出高鹵代過氧化物類酶活性，具有最好的抗菌效果，為制備新型防污劑提供了新思路。綜上，本工作闡明了GO-CeO2復合材料的形貌，鹵代過氧化物類酶活性以及防污性能之間的關(guān)系，證明通過水熱法將CeO2負載到GO 來提高綠色防污性能的可行性。

3 結(jié) 論

(1)為提高納米CeO2的抗菌效率，以GO 為負載層，為CeO2晶核創(chuàng)造更好的生長條件，成功地制備了3種不同濃度GO 負載的納米CeO2顆粒樣品(1%GOCeO2、2%GO-CeO2和4%GO-CeO2)。

(2)相關(guān)測試結(jié)果表明，2%GO-CeO2中短棒型CeO2分布均一，Ce3+濃度最高，其帶隙能量最小為2.76 eV，具有高效鹵代過氧化物類酶活性，對大腸桿菌的抑菌率為98.47%，具有優(yōu)異的抗菌性能。

(3)與商品化的CeO2相比，GO-CeO2復合材料具有更強的鹵代過氧化物類酶活性，為CeO2綠色高效新型防污劑的應用提供了新參考，同時為利用CeO2的類酶活性進行海洋防污奠定了理論基礎(chǔ)。