井雅朋 黃曉明 吳桐 簡天明 史雙雙 趙亮 孫豐源 唐東潤

天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學眼視光醫(yī)院 天津醫(yī)科大學眼科研究所,天津 300384

甲狀腺相關眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)是以眶脂肪增生和眼外肌纖維化為特征的自身免疫性疾病,與Graves病(Graves disease,GD)密切相關[1]。TAO的發(fā)病機制主要涉及眼眶成纖維細胞(orbital fibroblast,OF)向脂肪細胞及肌纖維母細胞的分化[2]。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)作為T淋巴細胞、巨噬細胞等分泌的特異性細胞因子之一,與其他細胞因子,如白細胞介素6、γ干擾素等的相互作用在TAO患者眼眶組織改變過程中發(fā)揮重要作用[3]。雖然已有研究深入探討了TNF-α增加人、大鼠和小鼠3T3-L1脂肪細胞的脂解作用以及藥物對TAO脂肪細胞分化的抑制作用[4-8],但在TAO中,TNF-α致眼眶脂肪細胞的去分化作用鮮有報道。通過KEGG PATHWAY Database網(wǎng)站查詢可知脂肪細胞成脂分化過程中發(fā)揮關鍵作用的分子信號通路為ERK1/2-PPARγ-perilipin1,且已有研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可以通過影響PPARγ的表達來發(fā)揮抑制脂肪細胞分化的作用[8]。因此,推測TNF-α可能直接通過影響脂肪分化信號通路進而發(fā)揮其抑制脂肪細胞分化的作用。本研究通過觀察人OF在TNF-α誘導過程中的形態(tài)學以及功能的變化,以明確TNF-α是否促進TAO患者OF來源的脂肪細胞去分化以及其通路機制,為尋找調控TAO發(fā)病的作用靶點提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本來源 收集2019年12月至2020年8月在天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院行眼眶減壓術的TAO患者6例6眼術中眼眶脂肪組織,年齡20～50歲,平均35歲。納入標準:患者T3、T4、促甲狀腺激素等指標正常,并穩(wěn)定半年以上,病情穩(wěn)定期眼球突出影響外觀,出現(xiàn)嚴重眼表并發(fā)癥,視神經(jīng)受壓,視力急劇下降,除甲狀腺功能異常外無其他病史,病程1～2年。本研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學眼科醫(yī)院倫理委員會批準[批文號:2019KY(L)-29],所有受試者均簽署知情同意書。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution,PBS)、胎牛血清、青鏈霉素雙抗、胰蛋白酶(美國Gibco公司);胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylanxthine,IBMX)(美國MCE公司);細胞組織RNA提取試劑盒(美國EZB公司);兔抗P44/42 MAPK(ERK1/2)單克隆抗體(137F5)、兔抗Phospho-p44/42 MAPK(ERK1/2)單克隆抗體(Thr202/Tyr204)、兔抗PPARγ單克隆抗體(C26H12)、兔抗perilipin1單克隆抗體(D1D8)、兔抗波形蛋白抗體(ab128507)(美國Cell Signaling Technology公司);山羊抗兔IgG抗體(英國Abcam公司);牛血清蛋白、Fraction V(上海碧云天生物科技有限公司);2倍濃縮RT-PCR擴增混合液、逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司);BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀有限公司);油紅O染色液(細胞專用)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。7900HTFAST Q-PCR儀(美國Applied Biosystems公司);倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司);微量分光光度計(上海元析儀器有限公司)。

表1 各目的基因PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences for target genes基因正向序列(5'-3')反向序列(5'-3')PPARγGGGATCAGCTCCGTGGATCTTGCACTTTGGTACTCTT-GAAGTTERK1CCAGAGTGGCTATCAAGAAGTCCATGAGGTCCTGAACAAERK2TGCCGTGGAACAGGTTGTTGGGCTCATCACTTGGGTPERILIPIN1GGAGGACGTGGCATGATGACGGCCCTTCCATTCTGCAAGAPDHGGAGCGAGATCCCTC-CAAAATGGCTGTTGTCATACTTCTCAT-GG 注:PCR:聚合酶鏈式反應;PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;ERK:細胞外調節(jié)蛋白激酶;PERILIPIN:脂肪包被蛋白;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶 Note:PCR:polymerase chain reaction;PPARγ:Peroxisomal proliferation-activated receptor γ;ERK:extracellular regulatory protein kinase;PERILIPIN:fat-coated protein;GAPDH:phosphoglyc-eraldehyde dehydrogenase

1.2 方法

1.2.1人OF的原代培養(yǎng) 將TAO患者眼眶脂肪結締組織浸泡在PBS中充分洗滌,去除肉眼可見的血管組織,切取純凈脂肪組織,剪成0.5～1 mm3大小均勻的顆粒,加入適量PBS,離心半徑10 cm,1 000 r/min離心10 min。取上層純脂肪顆粒,輕輕地鋪在干燥的25 cm2培養(yǎng)瓶底壁上,放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內靜置40 min,待脂肪顆粒黏附牢固后緩慢加入含20%血清的DMEM培養(yǎng)液1～2 ml,常規(guī)CO2孵箱內培養(yǎng)4 d;更換培養(yǎng)液至5 ml,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng),取生長良好的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2體外培養(yǎng)OF的免疫熒光鑒定 取生長狀態(tài)良好的細胞,用0.25%胰蛋白酶液消化,制成單細胞懸液,接種到預先放置6 mm×22 mm蓋玻片的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿(直徑35 mm)中,置5% CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d;待細胞接近單層融合,取出蓋玻片,浸入PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)洗2次,4%多聚甲醛室溫固定40 min。將細胞玻片放入蓋片染色缸,置于PBS中振蕩洗滌5 min,取出吹干,滴加抗波形蛋白抗體(1∶500稀釋),置濕盒內避光37 ℃孵育60 min或4 ℃冰箱中過夜;置于PBS中振蕩洗滌3次,每次5 min,吹干,滴加熒光素標記二抗(1∶100稀釋),在濕盒中37 ℃保溫60 min;置于PBS中振蕩洗滌2次,每次5 min,然后用蒸餾水振蕩洗滌1次;50%緩沖甘油封片,暗室熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3體外培養(yǎng)OF的成脂分化及鑒定 取生長狀態(tài)良好的OF,胰蛋白酶消化后調整細胞密度為5×104/ml并接種于6孔板中,每孔2 ml,放入細胞培養(yǎng)箱內常規(guī)培養(yǎng)。待細胞生長基本融合后,換用誘導分化培養(yǎng)液1(含0.25 mmol/L IBMX、10 μg/ml胰島素、1 μmol/L地塞米松的不完全培養(yǎng)液)進行成脂誘導培養(yǎng),每3 d換液1次;換液2次后,用誘導分化培養(yǎng)液2(含10 μg/ml胰島素、1 μmol/L地塞米松的不完全培養(yǎng)液)繼續(xù)誘導至第14天,倒置相差顯微鏡下觀察細胞的分化成脂情況。移除細胞培養(yǎng)基,用PBS洗2次,參照油紅O染色液(細胞專用)試劑盒步驟加入油紅O染色固定液固定30 min;蒸餾水洗2次,加入60%異丙醇浸洗5 min;棄去異丙醇后加入新配制好的油紅O染色液浸染20 min;流水清洗2～5次,直到無多余染色液,加入Mayer蘇木素染色液,復染核1～2 min;流水清洗2～5次,加入油紅O染色緩沖液室溫孵育1 min后棄去;加入蒸餾水覆蓋細胞并在倒置顯微鏡下觀察,中性脂肪呈橘紅色或橙紅色,磷脂呈粉紅色,細胞核呈藍色。

1.2.4OF成脂后的去分化誘導 使用簡單隨機分組法,將成脂分化第14天細胞隨機分為4個組,培養(yǎng)液分別換成含0、0.1、1.0、10.0 μg/L TNF-α的完全培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng);分別于誘導第0、6、10、18、24、28天倒置顯微鏡下固定視野觀察細胞質內含脂滴細胞的變化情況,并于脂肪細胞去分化第20天再次行油紅O染色,顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測PPARγ、ERK1、ERK2及perilipin1 mRNA的表達 取原代OF細胞、分化第14天及去分化第20天細胞,分別提取細胞總mRNA。使用微量分光光度計測量所提取總RNA的濃度,逆轉錄制備cDNA;以cDNA為模板,行熒光定量PCR檢測,擴增體系為10 μl。PCR反應條件:95 ℃預變性 10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸15 s,共40個循環(huán)。各目的基因引物設計見表1,由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。實驗重復操作3次,以GAPDH為內參照,采用2-ΔΔCt法計算各目的基因的相對表達量。

1.2.6Western blot檢測PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白的表達

取原代、分化第14天及去分化第20天的細胞用預冷PBS沖洗3次,根據(jù)每孔細胞數(shù)量加入50～100 μl蛋白裂解液,冰上靜置約10 min后用細胞刮刀收集細胞于1.5 ml EP管中,吹打20次,冰上靜置20 min,重復2次后4 ℃條件下12 000 r/min離心15 min,收集上清液于新EP管中。測定總蛋白濃度后加入50 μl 5倍蛋白上樣緩沖液,100 ℃煮沸10 min,取20 μl蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,將蛋白轉印至PVDF膜;取出膜置于封閉液(其中PPARγ、T-ERK1/2、perilipin1、GAPDH使用5%脫脂奶粉封閉,P-ERK1/2使用5%牛血清白蛋白封閉)中,室溫搖床上輕搖2 h;將ERK1/2、P-ERK1/2、PPARγ、perilipin1和GAPDH單克隆抗體加入封閉液中,稀釋比例均為1∶1 000,4 ℃孵育過夜;PBS洗膜3次后用山羊抗兔IgG室溫搖床上輕搖1 h;再次洗膜3次后進行增強化學發(fā)光法顯色。采用ImageJ軟件分析條帶灰度值,以GAPDH為內參照,計算各目的蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 原代培養(yǎng)人OF的形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡下觀察,原代培養(yǎng)第4天可見少量細胞從眼眶脂肪結締組織塊邊緣長出(圖1A);培養(yǎng)第14天可見細胞長滿培養(yǎng)瓶底部,細胞呈梭形或多角形細胞,增生融合,呈旋渦狀排列(圖1B)。免疫熒光結果顯示,細胞波形蛋白染色陽性,表明培養(yǎng)細胞屬于成纖維細胞(圖1C)。

圖1 人OF的形態(tài)觀察及免疫熒光鑒定 A:原代培養(yǎng)至第4天,倒置顯微鏡下可見組織塊邊緣少量梭形或多角形細胞,貼壁生長(×200,標尺=200 μm) B:原代培養(yǎng)培養(yǎng)至第14天,倒置顯微鏡下可見細胞融合,呈旋渦狀排列(×100,標尺=500 μm) C:原代培養(yǎng)細胞波形蛋白的免疫熒光染色呈陽性(異硫氰酸熒光素 ×200,標尺=200 μm)

2.2 OF的成脂分化及鑒定

光學顯微鏡下觀察可見,誘導分化后24 h,OF表現(xiàn)為細胞回縮,細胞間隙增大,增生逐漸停止,細胞形態(tài)漸變?yōu)闄E圓形或圓形,細胞體積逐漸增大;誘導分化第6天,細胞內出現(xiàn)微細脂滴樣結構;誘導分化第10天,可見較多細胞的細胞質中出現(xiàn)細小、排列緊密的脂滴樣結構,光學顯微鏡下呈透亮的脂肪滴樣,小脂滴聚集融合成較大脂滴,可見含有脂滴樣結構的細胞數(shù)量增加;誘導分化第14天,可見部分細胞分化為成熟脂肪細胞,而剩余未分化的細胞形態(tài)為圓形或橢圓形,細胞質內未出現(xiàn)明顯脂滴(圖2A)。分化第14天,細胞油紅O染色顯示,部分細胞的細胞質中出現(xiàn)大小不等紅色脂肪滴,部分脂滴分泌出細胞外(圖2B)。

圖2 體外培養(yǎng)OF細胞成脂分化及油紅O染色鑒定(×400,標尺=100 μm) A:誘導分化第14天,部分細胞的細胞質中含有脂滴樣結構(實線箭頭),另一部分細胞呈圓形或橢圓形,細胞質中無脂滴樣結構(虛線箭頭) B:分化第14天油紅O染色顯示,部分細胞的胞質中可見大小不等的紅色著染脂肪滴,脂肪滴包裹細胞核,并將細胞核推擠到胞質的一側,部分脂滴分泌出細胞外

2.3 OF成脂后的去分化誘導及鑒定

0 μg/L TNF-α組去分化誘導后6、10、20 d細胞質中脂滴大小未見明顯變化。相比于0 μg/L TNF-α組,0.1 μg/L TNF-α組、1.0 μg/L TNF-α組、10.0 μg/L TNF-α組去分化誘導對應時間點細胞質中脂滴減小,數(shù)量減少,其中10.0 μg/L TNF-α組脂肪細胞去分化效果最明顯,去分化20 d細胞質內脂滴基本消失,細胞生長融合(圖3)。10.0 μg/L TNF-α組去分化20 d細胞質中未見明顯油紅O染料著染(圖4)。

圖3 不同濃度TNF-α完全培養(yǎng)基誘導TAO眼眶成熟脂肪細胞去分化過程 (×200,標尺=100 μm) 0 μg/L TNF-α組去分化誘導后細胞質中脂滴大小未見明顯變化。0.1 μg/L TNF-α、1.0 μg/L TNF-α、10.0 μg/L TNF-α組去分化誘導細胞質中脂滴減小,數(shù)量減少,其中10.0 μg/L TNF-α組脂肪細胞去分化效果最明顯,在去分化20 d細胞質內脂滴基本消失,細胞生長融合 TNF:腫瘤壞死因子

圖4 眼眶成熟脂肪細胞去分化20 d油紅O染色(×200,標尺=200 μm) 未見明顯油紅O染料著染

2.4 各組PPARγ、ERK1、ERK2及perilipin1 mRNA的表達比較

原代組、分化14 d組和去分化20 d組細胞中PPARγ、ERK1、ERK2、perilipin1 mRNA相對表達量總體比較,差異均有統(tǒng)計學意義(F=574.099、15.378、148.330、370.435,均P<0.01)。分化14 d組細胞中PPARγ、ERK1、ERK2和perilipin1 mRNA相對表達量均高于原代組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05);去分化20 d組細胞中PPARγ、ERK2、perilipin1 mRNA相對表達量均明顯低于分化14 d組,perilipin1 mRNA相對表達量明顯高于原代組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(表2)。

2.5 各組PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白的表達比較

分化14 d組P-ERK1/2、PPARγ和perilipin1蛋白電泳條帶灰度值較原代組明顯增強;去分化20 d組P-ERK1/2、PPARγ和perilipin1蛋白電泳條帶灰度值明顯減弱,低于分化14 d組(圖5)。各組PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白相對表達量總體比較,差異均有統(tǒng)計學意義(F=368.600、108.500、325.700,均P<0.001),其中分化14 d組各蛋白相對表達量均明顯高于原代組和去分化20 d組,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.001)(表3)。

圖5 Western blot檢測各組蛋白表達 分化14 d組perilipin1、PPARγ、P-ERK1/2蛋白條帶灰度均明顯強于原代組和去分化20 d組 P-ERK:磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶;T-ERK:總細胞外調節(jié)蛋白激酶;PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;perilipin:脂肪包被蛋白;GAPDH:磷酸甘油醛脫氫酶

3 討論

OF是TAO免疫應答中主要的自身免疫靶細胞和效應細胞,在TAO的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[9-10]。近年來,關于不同細胞因子及藥物對OF增生、分泌、分化影響的研究已較為廣泛而深入[11-14]。目前,人OF的體外培養(yǎng)方法主要為組織塊法和酶消化法,由于組織塊法具有操作簡便、需要的組織標本量少等特點,故本研究中采取組織塊法培養(yǎng)人OF來進行分化及去分化的研究。

表2 原代組、分化14 d組、去分化20 d組細胞中PPARγ、ERK1、ERK2、perilipin1 mRNA相對表達量比較(x±s)Table 2 Comparison of expression levels of PPARγ,ERK1,ERK2 andperilipin1 mRNA among primary group,14-day differentiationgroup and 20-day dedifferentiation group (x±s)組別樣本量PPAR-γERK1ERK2perilipin1原代組31.00±0.091.05±0.191.00±0.101.05±0.07分化14 d組34.26±0.09a2.01±0.09a3.23±0.10a8.69±0.33a去分化20 d組31.06±0.03b1.73±0.041.15±0.11b6.27±0.09abF值574.09915.378148.330370.435P值<0.0010.0260.001<0.001 注:與原代組比較,aP<0.05;與分化14 d組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;ERK:細胞外調節(jié)蛋白激酶;perilipin:脂肪包被蛋白 Note:Compared with primary group,aP<0.05;compared with 14-day differentiation group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) PPARγ:peroxisomal proliferation-activated receptor γ;ERK:extracel-lular regulatory protein kinase;perilipin:fat-coated protein

表3 原代組、分化14 d組及去分化20 d組PPARγ、P-ERK1/2、perilipin1蛋白表達比較(x±s)Table 3 Comparison of expression of PPARγ,P-ERK1/2and perilipin1 proteins among primary group,14-daydifferentiation group and 20-day dedifferentiation group (x±s)組別樣本量PPARγP-ERK1/2perilipin1原代組30.37±0.020.29±0.020.00±0.00分化14 d組31.07±0.03a1.00±0.03a1.13±0.02a去分化20 d組30.20±0.02b0.38±0.06b0.00±0.00F值368.600108.500325.700P值<0.001<0.001<0.001 注:與原代組比較,aP<0.001;與分化14 d組比較,bP<0.001(單因素方差分析,LSD-t檢驗) PPARγ:過氧化物酶體增生物激活受體γ;P-ERK:磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶;perilipin:脂肪包被蛋白 Note:Compared with primary group,aP<0.001;compared with 14-day dif-ferentiation group,bP<0.001 (One-way ANOVA,LSD-t test) PPARγ:peroxisomal proliferation-activated receptor γ;P-ERK:phosphorylated extra-cellular regulatory protein kinase;perilipin:fat-coated protein

研究結果表明,依據(jù)Thy-1抗原(CD90)表達的不同,可將OF分為可轉化為肌纖維母細胞的Thy-1+成纖維細胞和可轉化為脂肪細胞的Thy-1-成纖維細胞[15]。在本實驗中,通過使用胰島素、地塞米松和IBMX對原代培養(yǎng)的OF進行成脂誘導,發(fā)現(xiàn)誘導至第14天時部分細胞分化為脂肪細胞,而另一部分細胞僅表現(xiàn)為形態(tài)上變圓,細胞質內未出現(xiàn)脂滴樣結構,最終未能被誘導為脂肪細胞。該結果提示TAO患者眼眶中同時存在Thy-1+和Thy-1-的OF。

去分化是指一個終末分化的細胞退回到其所在細胞譜系中一個低分化狀態(tài)的過程,去分化的細胞可以進入細胞周期、分裂增生,也可以再分化為成熟細胞[16]。經(jīng)成熟脂肪細胞去分化后所得到的細胞被稱為去分化脂肪細胞,其具有多向分化潛能,經(jīng)過體外誘導后可向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、內皮細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞等分化[17-18];去分化脂肪細胞還可作為組織工程和干細胞移植的優(yōu)良干細胞來源,在治療缺血性心臟病、骨缺損疾病、腎臟疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等多種臨床疾病方面有較好應用前景[19-21]。在本實驗中,使用TNF-α可誘導OF分化的脂肪細胞出現(xiàn)去分化現(xiàn)象,即細胞逐漸由圓形變?yōu)殚L梭形,細胞內的脂滴逐漸減小,含有脂滴的細胞也逐漸減少。

TNF-α作為T淋巴細胞、巨噬細胞等分泌的細胞因子之一,參與TAO眼眶炎癥、纖維化及脂肪增生等多個病理過程,并與其他細胞因子相互作用,共同影響TAO的發(fā)生和發(fā)展[3]。有研究發(fā)現(xiàn),TNF-α可下調動脈粥樣硬化血管內皮下脂肪細胞表面標志物和相關功能基因,如PPARγ的表達[22-23];其還可影響脂肪細胞分化,表現(xiàn)為破壞前脂肪細胞的分化,同時誘導成熟脂肪細胞發(fā)生去分化,加速脂肪細胞、前脂肪細胞的凋亡[24-26]。在本實驗中,實時熒光定量PCR及Western blot結果顯示,在誘導成脂分化過程中ERK1/2、PPARγ、perilipin1 mRNA和蛋白表達量均增加,而隨著TNF-α干預時間的延長,相關脂肪分化通路基因和蛋白表達量逐漸減少,推測TNF-α可能通過下調脂肪分化信號通路中PPARγ、ERK1/2及perilipin1基因的表達影響眼眶成熟脂肪細胞的分化,從而對脂肪細胞產生去分化的作用。

綜上所述,本研究表明TNF-α具有抑制TAO眼眶脂肪細胞分化的潛能,可促使TAO眼眶脂肪細胞發(fā)生去分化現(xiàn)象,其機制可能與下調ERK1/2-PPARγ-perilipin1信號通路有關。本研究為后期進一步探索TAO眼眶脂肪異常增生的機制以及優(yōu)化治療手段提供了新的思路和實驗基礎。本實驗僅對脂肪細胞分化通路中PPARγ、P-ERK1/2和perilipin1這3個基因和蛋白的表達情況進行探索,未來需對該通路其他基因和蛋白的表達情況進行較全面的研究,以進一步明確TNF-α致脂肪細胞去分化的通路機制;同時,針對TNF-α誘導去分化形成的成纖維樣細胞功能及生物學行為變化,以及TNF-α是否通過影響其他通路蛋白的表達間接影響脂肪細胞的分化等問題均有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明井雅朋:參與實驗設計、研究實施、文章起草及修改;黃曉明、吳桐:參與本實驗設計及研究實施;簡天明、史雙雙、趙亮:參與研究實施及統(tǒng)計分析;孫豐源、唐東潤:實驗設計、對本文的知識性內容作批評性審閱