岳 昊, 吳 碩, 王 競*, 李 澤 龍, 顧 晨

(1.大連理工大學(xué) 環(huán)境學(xué)院, 遼寧 大連 116024;2.中國電建集團(tuán)華東勘測設(shè)計(jì)研究院有限公司, 浙江 杭州 311122 )

0 引 言

由Gauthier等[11]在1995年從交替單胞菌中分離得到的假交替單胞菌(Pseudoalteromonas),是在全球海洋生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的革蘭氏陰性菌．在本課題組之前的研究中,Gu等[12]證明了Pseudoalteromonassp.GCY可通過產(chǎn)生的胞外ROS完成四溴雙酚A的好氧共代謝降解;Li等[7]揭示了Pseudoalteromonassp.GCY降解布洛芬首先由胞外ROS啟動(dòng),然后中間產(chǎn)物被細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)一步降解．然而Pseudoalteromonassp.GCY的參考基因組還不清晰,且影響假交替單胞菌胞外ROS產(chǎn)生的因素也未知．

從大連近海表層沉積物中分離得到一株能產(chǎn)胞外ROS的Pseudoalteromonassp.GCY．采用Illumina測序技術(shù)對Pseudoalteromonassp.GCY基因組進(jìn)行測序,并對其產(chǎn)ROS特性進(jìn)行研究,以提供Pseudoalteromonassp.GCY(以下簡稱菌株GCY)的基因組信息,明晰影響產(chǎn)ROS的因素．研究結(jié)果將在分子水平上加深對生物源ROS產(chǎn)生以及影響機(jī)制的理解．

1 材料與方法

1.1 菌株的分離與鑒定

近海表層沉積物采集自中國遼寧省大連市黑石礁(38°52′34″N,121°33′58″E)．連續(xù)培養(yǎng)120 d后,沉積物中的菌群被富集．將富集得到的菌群在人工海水制備的固體BP培養(yǎng)基中25 ℃下培養(yǎng)2 d,然后在培養(yǎng)基上進(jìn)行重復(fù)劃線,以純化菌株GCY[12]．固體BP培養(yǎng)基成分如下：牛肉膏1 mg/L,蛋白胨2 mg/L,四溴雙酚A 50 mg/L,瓊脂20 mg/L．利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡(FEI Nova NanoSEM 450)觀察菌株GCY的形態(tài)．

挑取固體BP培養(yǎng)基中的單個(gè)菌落,溶于10 μL無菌水中,80 ℃水浴變性15 min．以離心上清液為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增．TaKaRa 16S rDNA細(xì)菌鑒別PCR試劑盒用于擴(kuò)增菌株GCY的16S rRNA基因,測序的正向引物和反向引物分別為RV-M和M13-47．?dāng)U增反應(yīng)條件：94 ℃變性5 min,隨后以94 ℃、60 s,55 ℃、60 s,72 ℃、1.5 min為一輪,反應(yīng)30輪,最終在72 ℃下延伸5 min．切割凝膠測序,回收PCR產(chǎn)物,即獲得菌株GCY的16S rRNA基因序列．DNA測序部分由寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司大連分公司完成．Blastn程序用于分析菌株GCY序列與已知的16S rRNA基因序列的同源性．除特別說明外,本文提及的所有軟件均使用默認(rèn)參數(shù)．OrthoANI用于計(jì)算兩個(gè)16S rRNA基因序列之間的平均核苷酸同源性．Clustal X用于比較相關(guān)序列．使用MEGA11,基于16S rRNA基因,利用鄰近算法推斷菌株GCY的系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.2 全基因組測序和注釋

利用Illumina NovaSeq PE150短讀平臺(tái)和PacBio RSII長讀平臺(tái)對菌株GCY的全基因組進(jìn)行測序．PacBio RSII長讀取用于基因組組裝,Illumina NovaSeq PE150短讀取用于scaffold組裝．對低質(zhì)量的reads進(jìn)行過濾(<500 bp),獲得干凈數(shù)據(jù)．對照Gene Ontology(GO)數(shù)據(jù)庫、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫、Clusters of Orthologous Groups(COG)數(shù)據(jù)庫和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫對基因功能進(jìn)行注釋．對照綜合抗生素耐藥性數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD)注釋抗性基因．采用SignalP工具預(yù)測該蛋白序列是否為分泌蛋白．

1.3 ROS產(chǎn)生特性

1.4 比較基因組

為進(jìn)一步了解環(huán)境中生物源ROS的分布,首先在假交替單胞菌屬內(nèi)進(jìn)行比較基因組分析,最終以與菌株GCY基因組高度相似的Pseudoalteromonasflavipulchrastrain JG1和Pseudoalteromonaspiscicidastrain JCM 20779為代表．利用Orthovenn對3個(gè)菌株的蛋白質(zhì)序列比較聚類,構(gòu)建基因家族．使用Mauve計(jì)算和繪制3個(gè)菌株基因組之間保守和高度同源基因組區(qū)域的共線性．對照整合微生物基因組(Integrated Microbial Genomes,IMG)數(shù)據(jù)庫檢索上述3個(gè)菌株的ROS產(chǎn)生和消除相關(guān)基因．此外,利用AnnoTree(http：//annotree.uwaterloo.ca/)檢測胞外ROS產(chǎn)生相關(guān)酶在環(huán)境微生物中的分布．

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株GCY鑒定與系統(tǒng)發(fā)育

菌株GCY在瓊脂平板上的菌落與典型的假交替單胞菌相似,呈橘黃色不透明光滑的圓形．該菌是革蘭氏陰性、兼性好氧、異養(yǎng)的動(dòng)桿菌．場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察表明,菌株GCY的平均尺寸為0.4～2.0 μm．16S rRNA測序結(jié)果顯示,菌株GCY的16S rRNA序列全長1 447 bp(GenBank accession number KY 583737.1)．16S rRNA同源性分析結(jié)果顯示,菌株GCY與Pseudoalteromonaspiscicidastrain NBRC 103038和Pseudoalteromonaspiscicidastrain IAM 12932的關(guān)系最為密切．基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果如圖1所示,菌株GCY與Pseudoalteromonaspiscicidastrain NBRC 103038形成進(jìn)化枝．平均核苷酸同源性為100%,這表明它們可能屬于同一種．

圖1 菌株GCY的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株GCY基因組特性

經(jīng)過Illumina和PacBio測序得到了菌株GCY基因組的結(jié)構(gòu)(圖2)．完整的基因組由Chr1和Chr2兩個(gè)染色體環(huán)組成,圖中由外到內(nèi)分別為重復(fù)密度,COG、KEGG、GO基因注釋結(jié)果,ncRNAs,基因組GC含量,基因組GC偏倚值．結(jié)果表明,完整基因組由兩條環(huán)狀染色體組成,大小為5.47 Mb,平均GC含量為43.39%．全部基因總長為4.84 Mb,占基因組總長的88.5%．預(yù)測到4 626個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、106個(gè)tRNA基因、28個(gè)rRNA基因和4個(gè)sRNA基因(表1)．氨基酸運(yùn)輸和代謝(E)、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生(J)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(T)和轉(zhuǎn)錄(K)是最豐富的COG類別．此外,在菌株GCY基因組序列中預(yù)測到了500個(gè)分泌蛋白．

表1 菌株GCY基因組特性

2.3 基于全基因組的分析

在菌株GCY基因組中還注釋到32個(gè)編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的基因,如ftsI、ftsW、murG和rfaQ等,這些基因可能參與了菌株GCY胞外聚合物質(zhì)(extracellular polymeric substances,EPS)的形成[18]．產(chǎn)生EPS的菌株在假交替單胞菌屬中很常見[19]．研究表明,EPS可以增強(qiáng)細(xì)菌對氧化應(yīng)激的耐受性,從而減輕膜損傷[20]．

此外還在菌株GCY基因組中發(fā)現(xiàn)了adeG、mexI、mexT、mfd、msbA、PmrE、TaeA和TriC等抗生素抗性基因．在過去的幾年里,抗生素在海洋環(huán)境中被廣泛發(fā)現(xiàn),以往的研究表明,抗生素可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激[21-22]．通過CARD分析,推測菌株GCY的耐藥性主要來源于外排泵機(jī)制．這種機(jī)制在革蘭氏陰性菌中普遍存在,涉及的基因包括adeG、TriC、mexT和mexI等．這些基因編碼的酶可以泵送多種抗生素,賦予菌株GCY抗生素耐藥性[23-24],同時(shí)減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激．

綜上所述,在菌株GCY基因組中鑒別到使其兼具產(chǎn)胞外ROS能力與應(yīng)對氧化脅迫能力的相關(guān)基因．

2.4 ROS產(chǎn)生特性分析

2.5 比較基因組分析

為進(jìn)一步了解環(huán)境中生物源ROS的分布,首先在假交替單胞菌屬內(nèi),通過比較基因組分析了菌株GCY與其他菌株的基因組特征．以與菌株GCY基因組高度相似的Pseudoalteromonasflavipulchrastrain JG1和Pseudoalteromonaspiscicidastrain JCM 20779為代表進(jìn)行基因組特征分析(圖4,表2)．如圖4所示,3個(gè)菌株核心基因組為3 737個(gè)基因,占每個(gè)基因組的90.0%～ 92.2%;菌株GCY(4 151個(gè)基因)中分別有94.3%(3 915個(gè)基因)和95.5%(3 963個(gè)基因)在菌株JG1和菌株JCM 20779中具有同源性(圖4(a)),共線性分析結(jié)果與菌株GCY、JG1和JCM 20779的密切親緣關(guān)系一致(圖4(b)),被色塊覆蓋的序列區(qū)域在基因組中完全共線和同源．中心線以下的塊表示按反向補(bǔ)碼(逆)方向?qū)R的區(qū)域．重新排列用彩色線條表示．據(jù)此推測,菌株JG1和菌株JCM 20779的基因組中也存在與胞外ROS產(chǎn)生和消除相關(guān)的基因．這表明與菌株GCY相似的菌株也具有產(chǎn)胞外ROS的潛力．同時(shí),對3個(gè)菌株基因組中ROS相關(guān)功能基因進(jìn)行檢索驗(yàn)證了這一推測：3個(gè)菌株基因組中都存在編碼LAAO、Na+-轉(zhuǎn)運(yùn)NADH-醌氧化還原酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的基因．有研究發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌屬的其他種也能產(chǎn)生L-氨基酸氧化酶[25-26]和過氧化氫酶．以上分析表明具有產(chǎn)胞外ROS能力的微生物在假交替單胞菌屬內(nèi)廣泛存在．

圖3 ROS的產(chǎn)生特性

(a) 3個(gè)菌株的COGs維恩圖

(b) 全基因組比對

表2 菌株GCY、JG1和JCM 20779的基因組比較

進(jìn)一步利用AnnoTree(http：//annotree.uwaterloo.ca/)檢測LAAO和Na+-轉(zhuǎn)運(yùn)NADH-醌氧化還原酶在環(huán)境微生物中的分布．圖5展示了具有編碼LAAO(圖5(a))和Na+-轉(zhuǎn)運(yùn)NADH-醌氧化還原酶(圖5(b))基因的微生物,除了海洋生物種群外,一些存在于淡水和土壤中的微生物也具有這種能力,例如廣泛分布于土壤、淡水的假單胞菌已被證明產(chǎn)胞外ROS并因此被用于降解四溴雙酚A[27]．此外,研究表明與ROS產(chǎn)生相關(guān)的基因通過可移動(dòng)遺傳元件在物種間的頻繁水平轉(zhuǎn)移有助于它們在環(huán)境中廣泛傳播[28],且胞外ROS對微生物益害并存[29],因此,有理由推測具備產(chǎn)胞外ROS能力的微生物可能在環(huán)境中廣泛存在．

(a) LAAO

(b) Na+-轉(zhuǎn)運(yùn)NADH-醌氧化還原酶

3 結(jié) 語

本研究提供了具有產(chǎn)胞外ROS能力的Pseudoalteromonassp.GCY的生物學(xué)信息,鑒別了該菌株胞外ROS產(chǎn)生相關(guān)功能基因包括lodA、lodB和nqrA-F,抗氧化應(yīng)激相關(guān)功能基因包括sod和kat等．在此基礎(chǔ)上通過實(shí)驗(yàn)探明了氨基酸和Na+濃度是影響菌株胞外ROS產(chǎn)量的關(guān)鍵因素：在一定范圍內(nèi),氨基酸和Na+濃度的增大有利于胞外ROS產(chǎn)量的增加．研究還探明了胞外ROS產(chǎn)生相關(guān)基因廣泛存在于環(huán)境中的假交替單胞菌乃至各種微生物中,拓寬了對生物源ROS存在范圍的認(rèn)識(shí)．綜上,本研究結(jié)果在分子水平上加深了對生物源ROS產(chǎn)生的理解,這為開發(fā)利用生物源ROS提供了更多啟示．此外,鑒于ROS參與環(huán)境中多種物質(zhì)轉(zhuǎn)化,推測生物源ROS可能在無光區(qū)的生物元素地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮了重要作用．