吳 萌,李祥平,項(xiàng) 艷

0 引言

心肌缺血造成的心肌供養(yǎng)平衡失調(diào)易引起缺血部位心肌功能、形態(tài)及代謝等方面的損傷[1]。目前,再灌注是治療心肌缺血損傷的常用措施,但其可導(dǎo)致心肌組織進(jìn)一步損傷,即引起心肌缺血再灌注損傷[2]。一般心血管器質(zhì)性病變、器官移植、心血管手術(shù)等也會(huì)引起心肌缺血再灌注損傷[3]。因此,有效保護(hù)心肌缺血后再灌注損傷具有一定的臨床價(jià)值。

黃芩素(Baicalein,Bai)是當(dāng)前研究比較廣泛的黃酮類化合物,具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等藥理作用[4]。此外,Bai能有效降低腦血管阻力,改善血液循環(huán),對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[5-6],具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。脂質(zhì)聚合物納米粒(Lipid-polymer nanoparticles,LPNs)是一種新型納米給藥系統(tǒng),相較于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體和納米粒給藥載體,LPNs具有更優(yōu)良的生物相容性和較高的載藥量,具有一定的應(yīng)用前景[7]。TAT穿膜肽是人工合成的短鏈多肽,具有易穿透細(xì)胞膜的生物特性[8]。本研究通過構(gòu)建TAT短肽修飾的載Bai脂質(zhì)聚合物納米粒(Bai-TAT-LPNs),觀察其對心肌缺血再灌注大鼠的作用及其機(jī)制,為Bai的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級雄性SD大鼠40只,體重(180±15)g,購自北京Charles River公司[生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以每籠3～4只飼養(yǎng)于屏障環(huán)境中,自由飲水?dāng)z食。環(huán)境條件:12 h光照/12 h黑暗,溫度20～25 ℃,相對濕度40%～70%。本研究通過麗水市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),批準(zhǔn)文號:20211125。

1.1.2 主要試劑 黃芩素(產(chǎn)品編號:DH0024,批號:L190321)購自成都德思特公司,以二甲基亞砜配制母液;TAT短肽購自北京澤溪源公司;TUNEL染色試劑盒購自武漢普健公司;caspase 3、Bcl-2、p-AKT、Akt抗體購自美國CST公司;GAPDH抗體和抗兔IgG-HRP二抗購自上海愛必信公司;CK、LDH、MDA和SOD試劑盒購自南京建成公司。

1.1.3 主要儀器 SpectraMax 190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司);JEOL JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本JEOL公司);BX53熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司);多導(dǎo)多道生理記錄儀(美國Mindware公司);NanoSight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(英國Malvern公司);AI600凝膠成像儀(美國GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 Bai-TAT-LPNs的制備 取50 mg合成磷脂加至0.5 ml無水乙醇中溶解,將溶液加入40 ml去離子水中攪拌制成水相備用。各稱取120 mg聚乳酸-羥基乙酸共聚物和10 mg Bai,將二者加入20 ml乙腈溶解后制成油相。隨后將油相與水相混勻,并以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙腈。用0.8 μm微孔濾膜過濾油相和水相混合物獲得LPNs。向LPNs中加入1 ml TAT,并于4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育10 h,次日除去未結(jié)合的TAT,獲得Bai-TAT-LPNs。

1.2.2 構(gòu)建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型、大鼠分組及給藥 隨機(jī)選取30只大鼠,手術(shù)分離冠狀動(dòng)脈左前降支,穿線結(jié)扎30 min,隨后松開灌注2 h,建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型。將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、Bai組和Bai-TAT-LPNs組,以未結(jié)扎的大鼠設(shè)為假手術(shù)組,每組10只。Bai組和Bai-TAT-LPNs組在缺血前4 h分別腹腔注射Bai(100 mg/kg)和Bai-TAT-LPNs(含Bai 100 mg/kg)的生理鹽水溶液,模型組和假手術(shù)組注射等量二甲基亞砜的生理鹽水。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)和生物指標(biāo)檢測 以多導(dǎo)多道生理記錄儀檢測血流動(dòng)力學(xué)變化,記錄左心室發(fā)展壓(LVDP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取心肌組織,以血生化儀檢測肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)水平,取血清檢測丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。

1.2.4 TUNEL染色檢測大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 切取冠脈左前降支結(jié)扎部位心臟組織,10%中性福爾馬林固定,參考文獻(xiàn)進(jìn)行TUNEL染色[2]。組織經(jīng)石蠟包埋制成切片,切片經(jīng)脫蠟、水化及蛋白酶K修復(fù)等步驟后,行TUNEL染色和DAPI染色,切片脫水后用抗熒光淬滅封片膠封片,于倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄各組心肌細(xì)胞凋亡情況。計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù),計(jì)算凋亡指數(shù)。

1.2.5 蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測心肌各蛋白表達(dá)變化 參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行蛋白印記實(shí)驗(yàn)[6]。切取冠脈左前降支結(jié)扎部位心臟組織0.5 g左右,冰上勻漿并以600 μl組織裂解液裂解,12 000轉(zhuǎn)/min離心20 min。吸取上清液備用,蛋白定量并制備蛋白樣品。進(jìn)行SDS-PAGE電泳,上樣量為30 μg/10 μl,將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,封閉過夜。次日孵育caspase 3抗體(1∶2 000)、Bcl-2抗體(1∶1 000)、Akt抗體(1∶2 000)、p-Akt抗體(1∶1 000)或GAPDH抗體(1∶3 000)4 h。洗膜后孵育相應(yīng)二抗(1∶5 000)1 h,以ECL發(fā)光試劑盒于凝膠成像儀進(jìn)行成像并分析。

2 結(jié)果

2.1 Bai-TAT-LPNs的表征 如圖1所示,構(gòu)建的Bai-TAT-LPNs在透射電鏡下呈均一的球形,平均粒徑為(127±2.6) nm,粒徑分布較窄。

圖1 Bai-TAT-LPNs表面形態(tài)

2.2 Bai-TAT-LPNs改善模型大鼠心臟功能指標(biāo) 生理記錄儀結(jié)果如表1所示,相較于假手術(shù)組,模型組LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標(biāo)均顯著降低(P<0.01);與模型組相比,Bai組和Bai-TAT-LPNs組大鼠上述3個(gè)指標(biāo)均明顯升高(P<0.05);而Bai-TAT-LPNs組對上述3個(gè)指標(biāo)的改善優(yōu)于Bai組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)(n=10)

2.3 Bai-TAT-LPNs改善模型大鼠心肌能量代謝和氧化損傷 如表2所示,相較于假手術(shù)組,模型組大鼠血清LDH、CK、MDA明顯高于假手術(shù)組,而SOD明顯低于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);相較于模型組,Bai組和Bai-TAT-LPNs組LDH、CK、MDA明顯降低,SOD顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);相較于Bai組,Bai-TAT-LPNs組LDH、CK、MDA顯著降低,SOD明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD水平變化(n=10)

2.4 Bai-TAT-LPNs改善模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡 如圖2,TUNEL染色結(jié)果顯示,假手術(shù)組、模型組、Bai組、Bai-TAT-LPNs組凋亡細(xì)胞百分比分別為1.01%±0.12%、20.36%±1.98%、13.55%±1.36%、5.25%±0.50%。模型組心肌細(xì)胞凋亡百分比高于假手術(shù)組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而Bai組和Bai-TAT-LPNs組心肌細(xì)胞凋亡百分比低于模型組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);Bai組與Bai-TAT-LPNs組相比,后者心肌細(xì)胞凋亡明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況(20×)

2.5 Bai-TAT-LPNs抑制cleaved-caspase 3、Bcl-2和p-Akt蛋白表達(dá)變化 如圖3,蛋白印記結(jié)果顯示,相較于假手術(shù)組,模型組cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)明顯上調(diào),Bcl-2和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,Bai組和Bai-TAT-LPNs組cleaved-caspase 3、Bcl-2和p-Akt/Akt蛋白表達(dá)變化被抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中Bai-TAT-LPNs組的抑制效果更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

3 討論

再灌注雖然可治療心肌缺血損傷,但也可導(dǎo)致心肌組織進(jìn)一步受損,即引起心肌缺血再灌注損傷[9-10]。通常,心肌缺血再灌注伴隨著心臟功能變化、代謝異常以及心肌細(xì)胞凋亡[2,11-13]。本研究構(gòu)建的心肌缺血再灌注模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加,LVDP、+dp/dtmax和-dp/dtmax指標(biāo)明顯下降,并伴隨著血清LDH、CK顯著升高,提示心肌缺血再灌注損傷模型大鼠構(gòu)建成功。

本研究構(gòu)建TAT短肽修飾的Bai-TAT-LPNs,檢測表征發(fā)現(xiàn)其可用于實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),Bai和Bai-TAT-LPNs均能抑制模型大鼠心肌細(xì)胞凋亡,以及上述心臟功能和心肌能量代謝指標(biāo)變化,且Bai-TAT-LPNs作用更明顯。提示Bai-TAT-LPNs對心肌缺血再灌注損傷具有顯著的療效。通常心肌缺血再灌注可引起細(xì)胞氧化自由基升高。文獻(xiàn)報(bào)道,心肌缺血再灌注過程通常會(huì)產(chǎn)生大量的氧自由基及其降解產(chǎn)物,而當(dāng)內(nèi)源性自由基清除物無法清除過多的氧自由基時(shí),即可誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化,造成氧化損傷[14-17]。在本研究中,模型大鼠血清氧自由基降解產(chǎn)物MDA增加,而內(nèi)源性自由基清除物SOD減少,這與文獻(xiàn)報(bào)道相類似。Bai和Bai-TAT-LPNs治療可抑制MDA和SOD的變化,且Bai-TAT-LPNs的治療作用更強(qiáng),提示Bai-TAT-LPNs能顯著減輕心肌缺血再灌注引起的氧化損傷。蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子,可參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡以及糖代謝等生物學(xué)過程。已有研究證明,激活A(yù)kt信號可對心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用[18-20]。在本研究中,心肌缺血再灌注損傷模型大鼠p-Akt/Akt下調(diào),而Bai和Bai-TAT-LPNs均能抑制其表達(dá)下調(diào),且Bai-TAT-LPNs作用更顯著。提示Bai-TAT-LPNs可通過激活心肌細(xì)胞Akt磷酸化來抵抗心肌缺血再灌注損傷。

LPNs具有更優(yōu)良的生物相容性、較高的載藥量和生物可降解等優(yōu)勢[7]。而TAT穿膜肽具有較強(qiáng)的穿透細(xì)胞膜能力[8]。本研究構(gòu)建的Bai-TAT-LPNs對心肌缺血再灌注損傷,較Bai具有更好的療效,這可能與上述作用有關(guān)?？傊?Bai-TAT-LPNs可改善大鼠心肌缺血再灌注損傷,且效果優(yōu)于Bai,該作用可能與增強(qiáng)穿膜作用、減輕氧化損傷和激活A(yù)kt信號有關(guān)。