姜聖姬, 王淑安, 張恩亮, 李林芳, 高露璐, 楊如同, 王 鵬

(江蘇省中國科學院植物研究所,江蘇 南京 210014)

紫薇(Lagerstroemiaindica),又稱癢癢樹,是千屈菜科(Lythraceae)紫薇屬(Lagerstroemia)落葉灌木或小喬木,原產(chǎn)于中國,至今已有1 600多年的栽培歷史,以其在仲夏持久開花而聞名,并作為木本觀賞植物而倍受人們喜愛[1]。自20世紀80年代限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(RFLP)分子標記技術出現(xiàn)以來,DNA分子標記研究逐漸成為非?；钴S的研究方向[2]。分子遺傳圖譜記錄了基因組內(nèi)基因和特定的多態(tài)性DNA分子標記的相對位置關系,是基因定位和克隆的基礎。自從1994年Peltier等[3]首次利用分子標記、形態(tài)標記構建了矮牽牛(Petuniahybrida)的遺傳圖譜后,研究者相繼開展了觀賞植物的相關研究?；谶z傳連鎖圖譜的數(shù)量性狀座位(Quantitative trait locus, QTL)定位能有效結合基因型與表型來鑒定植株性狀,顯著提高選擇的準確性和育種的高效性,已在植物育種方面得到廣泛應用[4]。陳丹維等[5]利用擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)、簡單序列間重復(ISSR)標記構建了蠟梅(Chimonanthuspraecox)的分子遺傳圖譜,為QTL定位、基因克隆等研究奠定了基礎。Cai等[6]構建了第1張牡丹(PaeoniaSect.Moutan)高密度遺傳圖譜,并獲得了控制牡丹重要性狀的QTL。由此可見,構建紫薇遺傳連鎖圖譜的研究十分必要,不僅能夠發(fā)掘控制重要觀賞性狀的QTL,而且有利于推進紫薇屬植物基因組學的研究進程。

觀賞植物的株型可用來營造特定植物景觀,對環(huán)境的美學價值、公園景觀規(guī)劃具有較大影響,在過去的40年里,關于木本植物株型QTL的研究也越來越多[7]。Lee等[8]利用共顯性標記單核苷酸多態(tài)性(SNP)和微衛(wèi)星構建連鎖圖譜,對油棕(Elaeisguineensis)的株高進行QTL定位,鑒定出8個與株高有關的候選基因。Liu等[9]結合轉錄組與QTL分析對沙柳(Salixcheilophila)的株高、胸徑等性狀進行了初步定位,在6條染色體上鑒定出6個與株型相關的QTL位點。Du等[10]利用高密度連鎖圖譜對楊樹(Populus)株型基因進行定位,將17個QTL位點定位于11個連鎖群上。Souza等[11]在橡膠樹(Heveabrasiliensis)遺傳圖譜中對與株型相關的性狀進行定位,檢測到18個在夏季、冬季與其生長差異相關的QTL。目前,關于紫薇株型性狀的QTL定位研究鮮有報道。

目前,研究者已經(jīng)在紫薇的基因克隆、轉錄組分析及遺傳圖譜構建等方面取得重要進展。冷嘉文等[12]利用簡單重復序列(SSR)標記對30個來源于美國的紫薇品種進行遺傳多樣性分析,探討紫薇的遺傳規(guī)律,為開展紫薇種質(zhì)資源評價及新品種培育提供了理論依據(jù)。Cai等[13]對55個紫薇品種進行了指紋圖譜的構建及SSR標記的開發(fā)。賀丹等[14]利用AFLP、簡單重復序列(SSR)標記構建了尾葉紫薇(Lagerstroemiacaudata)與紫薇種間的遺傳連鎖圖譜,對株高、地徑等株型性狀進行了復合區(qū)間QTL定位。本研究旨在借助表達序列標簽微衛(wèi)星(EST-SSR)標記,以紫薇金幌(LagerstroemiaJinhuang)、紫薇堇秀(LagerstroemiaJiuxiu)的F1代分離群體為作圖群體,構建1張紫薇種內(nèi)遺傳圖譜,并對紫薇的3個株型性狀進行QTL定位與分析,從而為紫薇的分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以紫薇品種金幌(母本)、堇秀(父本)為親本,其中父本紫薇堇秀速生,花色淡紫,葉色深綠;母本金幌生長速度慢,花色紅色,葉色金色。

于2011年7-8月5:30-6:30,當紫薇母本花瓣未完全展開時去雄、套袋并將采集的父本紫薇雄蕊放置于直徑90 mm的塑料培養(yǎng)皿中,于9:00-11:00用毛刷采集父本花粉并將其置于母本柱頭上進行授粉,最后套袋,避免花粉污染。每個花序留5～10朵花。10-11月陸續(xù)收集紫薇種子。2013年3月播種,用穴盤培育后,移栽至試驗田中定植。2014年春季采集金幌、堇秀紫薇雜交所得F1代實生苗200株個體的健康幼葉,于-80 ℃保存待用。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.2 DNA提取、擴增與檢測

紫薇基因組DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[15]。PCR擴增程序參考張恩亮等[16]的方法,SSR擴增產(chǎn)物的檢測:8%聚丙烯酰胺凝膠電泳,210 V電泳90 min,電泳產(chǎn)物經(jīng)銀染顯色完全后,統(tǒng)計條帶數(shù)據(jù)。

1.3 紫薇株型性狀的測量

在秋季新梢停止生長后,對181個F1代單株進行分枝數(shù)、地徑和植株高度的調(diào)查和統(tǒng)計。分枝數(shù)的統(tǒng)計:由每個單株主干最下部第1個分枝數(shù)起,至主干末端,側枝分枝不計數(shù)。地徑的測量:使用游標卡尺在離地面高1 cm處進行測量,每個單株在不同方位進行測量,共計測量3次,取均值。高度的測量:測量每個單株從地面至主枝頂端的高度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計:篩選照片中有多態(tài)性的清晰的電泳條帶,將有帶的記為“1”,無帶的記為“0”,不清楚或缺失的記為“-”。

將得到“1”和“0”組成的原始矩陣數(shù)據(jù)轉換成“CP” 類型要求的數(shù)據(jù)格式,然后將數(shù)據(jù)輸入Joimnap 3.0,用Kosambi函數(shù)計算圖譜距離,選擇對數(shù)優(yōu)勢比(LOD)=3.0～10.0的標記作為連鎖群,構建紫薇的連鎖圖譜。用繪圖軟件MapChar 5.0繪制連鎖圖。用SPSS 17.0(SPSS Inc.,Chicago,USA)軟件對株型性狀進行統(tǒng)計分析,獲得分枝數(shù)、地徑、植株高度等性狀表型值的相關系數(shù)與試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)的柱形正態(tài)分布圖。應用MapQTL 5.0作圖軟件,采用區(qū)間作圖法對株型性狀進行QTL分析和作圖(LOD>3為閾值)。

QTL命名:q+T(目標性狀)+ “-” +所在染色體(連鎖群)。如果同一染色體包含同一目標性狀的多個QTL位點,在染色體編號后用“-”+“數(shù)字”表示QTL數(shù)量,QTL全名通常以斜體表示[17]。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選與帶型分析

本研究從1 600對EST-SSR引物中篩選出337對引物,用其擴增得到清晰可辨的486.00個多態(tài)性位點。在337對多態(tài)性引物中,每對引物擴增出1.00～5.00個位點,平均擴增出1.44個位點,其中引物NBJ1050擴增的位點數(shù)最多,可以擴增出5.00個位點。

根據(jù)林木遺傳作圖群體的“雙假測交”理論,將486個多態(tài)性位點分為以下3種類型:第1種為lm×ll分離類型(母本基因型為雜合的lm,父本基因型為隱性純合的ll),共有208個位點,由116對引物擴增而來;第2種為nn×np(母本基因型為隱性純合的nn,父本基因型為雜合的np)分離類型,共有204個位點,由196對引物擴增而來;第3種為hk×hk(父母本基因型均為雜合的hk)分離類型,共有74個位點,由48對引物擴增而來。

2.2 紫薇分子遺傳圖譜的構建

用Joimnap 3.0對486個SSR位點進行連鎖分析,構建了1張包含429個SSR標記位點、分屬36個連鎖群的紫薇遺傳連鎖圖譜(圖1、圖2)。連鎖群的LOD為3.0～10.0,遺傳圖譜總距離為1 998.81 cM,位點間平均距離為4.63 cM。36個連鎖群的平均遺傳距離為55.5 cM,其中LG1連鎖群的遺傳距離最長,為177.6 cM,LG27連鎖群的遺傳距離最短,為19.3 cM。不同連鎖群上的標記位點數(shù)為4～37個,最多的是LG1連鎖群,有37個位點,最少的是LG17連鎖群、LG19連鎖群,均只有4個位點。36個連鎖群中標記位點間平均間隔距離最小的連鎖群是LG2,為3.2 cM,平均間隔距離最大的是LG19連鎖群,為12.5 cM。在36個連鎖群中發(fā)現(xiàn)了8個大于20 cM的間隔區(qū)域,分布在LG1(29.3 cM)、LG6(21.6 cM)、LG15(22.6 cM)、LG16(23.6 cM)、LG20(20.6 cM)、LG22(22.2 cM)、LG23(23.2 cM)和LG30(22.5 cM)上。

2.3 偏分離標記分析

經(jīng)過對486個SSR多態(tài)性位點的卡方檢測(χ2<χ20.01,1=2.71),發(fā)現(xiàn)偏分離標記位點共計124個(占比25.51%),其中位于連鎖群上的偏分離標記共86個,占偏分離標記總數(shù)的69.35%,占連鎖群上標記總數(shù)的20.05%。lm×ll型偏分離標記55個,占偏分離標記總數(shù)的44.35%,連鎖群上標記35個,占該類型偏分離標記總數(shù)的63.64%,占連鎖群上標記總數(shù)的8.16%。nn×np型偏分離標記51個,占偏分離標記總數(shù)的41.13%,其中位于連鎖群上的標記38個,占該類型標記總數(shù)的74.51%,占連鎖群上總標記數(shù)的8.86%。hk×hk型偏分離標記18個,占偏分離標記總數(shù)的14.52%,其中位于連鎖群上的標記13個,占該類型標記總數(shù)的72.22%,占連鎖群上標記數(shù)的3.03%。

2.4 紫薇株型性狀的表型值分析

對181株紫薇的株高、地徑和分枝數(shù)等性狀進行統(tǒng)計和分析。從表1、圖3可以看出,2個親本金幌與堇秀在株高、地徑及分枝數(shù)等性狀上均存在顯著差異。株高、地徑和分枝數(shù)的變異范圍分別是8.00～176.00 cm、0.10～1.70 cm和4.00～44.00個,變異系數(shù)分別為0.50、0.45和0.50,說明作圖群體中單株間存在差異。株高、地徑及分枝數(shù)的偏度均>0且<1,均為正偏離,說明3個株型性狀的分布偏向母本金幌。

左側數(shù)據(jù)為遺傳圖距,右側編號為SSR位點。圖1 紫薇的簡單重復序列(SSR)遺傳圖譜(1)Fig.1 Genetic maps of Lagerstroemia indica based on simple sequence repeats (SSR) (1)

左側數(shù)據(jù)為遺傳圖距,右側編號為SSR位點。圖2 紫薇的簡單重復序列(SSR)遺傳圖譜(2)Fig.2 Genetic maps of Lagerstroemia indica based on simple sequence repeats (SSR) (2)

A:株高;B:地徑;C:分枝數(shù);P1:金幌;P2:堇秀;*表示P1與P2在0.05水平上有顯著差異。圖3 株高、地徑和分枝數(shù)的頻率分布Fig.3 Frequency distribution of plant high, ground diameter and branch number

2.5 株型的QTL定位

用MapQTL 5.0軟件的區(qū)間作圖模塊對株型性狀進行QTL分析,檢測到4個控制紫薇植株高度的QTL位點,分別將其命名為qPH-1-1、qPH-6-2、qPH-22-3和qPH-29-4(圖4、表2)。其中,qPH-1-1位于LG1連鎖群上,在NBJ951-360與NBJ104-118之間,加性效應值為-1.72,來自母本金幌,可解釋表型變異的4.32%;qPH-6-2位于LG6連鎖群上,在NBJ1133-220和NBJ1137-235之間,加性效應值為0.23,來自父本堇秀,可解釋表型變異的56.93%;qPH-22-3位于LG22號連鎖群上,位于NBJ202-100和NBJ42-120之間,加性效應值為1.49,來自父本堇秀,可解釋表型變異的55.61%;qPH-29-4位于LG29號連鎖群上,在標記NBJ957-160和標記NBJ1133-315之間,加性效應值為-9.99,來自母本金幌,可解釋表型變異的29.82%。

表1 株高、地徑和分枝數(shù)的表型

本研究共檢測到2個控制地徑的QTL位點,分別命名為qPD-1-1、qPD-22-2,分別位于LG1、LG22連鎖群上(圖3、表2)。qPD-1-1在標記NBJ14-240和標記NBJ440-240之間,加性效應值為-1.33,來自母本金幌,可解釋表型變異的56.43%;qPD-22-2位于標記NBJ1212-260和標記NBJ151-100之間,加性效應值為-1.72,來自母本金幌,可解釋表型變異的59.02%。

本研究還發(fā)現(xiàn)了控制分枝數(shù)的1個QTL位點,命名為qBN-22-1,位于LG22連鎖群上,在標記NBJ133-205和標記NBJ782-310之間,加效應值為-2.32,來自母本金幌,可解釋表型變異的54.60%(表2)。

表2 株高、地徑和分枝數(shù)3個性狀的數(shù)量性狀座位(QTL)分析

圖4 株型的數(shù)量性狀座位(QTL)定位Fig.4 Quantitative trait locus (QTL) mapping of plant architecture

3 討 論

3.1 分子標記的選擇

目前常見的分子標記大致分為4類:基于雜交的分子標記、基于PCR技術的分子標記、雜交和PCR技術相結合的分子標記及單核苷酸多態(tài)性標記[18-20]。簡單重復序列(SSR)標記具有操作簡便且數(shù)量豐富的特點,能夠揭示較高的多態(tài)性,同時具有多等位基因特性,能夠提供較高的信息量,不受外界環(huán)境干擾,檢測高效快速,被廣泛應用于作物、林木等植物的遺傳圖譜構建[20-21]。本研究以181株F1代分離群體為作圖群體,利用SSR標記進行作圖分析,構建了1張包含429個SSR位點的紫薇遺傳連鎖圖譜,覆蓋紫薇基因組總長度的1 998.81 cM。該連鎖圖譜框架結構己初步形成,并可為后續(xù)相關基因及QTL定位提供基礎。

3.2 偏分離標記與遺傳圖譜

在DNA標記連鎖圖譜的制作過程中,常常會遇到大量DNA標記偏離孟德爾分離比例的現(xiàn)象。番茄[22]、水稻[23]、棉花[24]等作物均有關于偏分離標記在特定連鎖群上集中分布或偏向于某一親本的描述。在桃[25]、杧果[26]等多年生果樹的遺傳圖譜作圖過程中也普遍存在DNA標記的偏分離現(xiàn)象。Bradshaw等[27]研究發(fā)現(xiàn),偏分離的標記和正常分離的標記幾乎具有相同的作圖效率。在本研究中,偏分離標記位點共計124個,占多態(tài)性位點總數(shù)的25.51%,其中連鎖群上的偏分離標記共計86個,占偏分離標記總數(shù)的69.35%,占總連鎖群上標記數(shù)的20.05%,分別低于水稻、棉花等作物的偏分離標記水平[28-29]。標記偏分離的原因可能是多方面的,如親本遺傳差異較大、分離群體偏小、致死基因的存在及親本雜交過程中存在染色體結構重排、缺失、插入和突變等[30-35]。此外,值得注意的是,紫薇圖譜中86個偏分離標記出現(xiàn)在12個連鎖群的端部,與水稻[36]、番茄[37]、咖啡[38]等作物的研究結果相似。本研究還對部分黃化F1代植株長勢、地徑和植株高度3個性狀進行QTL的定位與分析,推測有部分黃化F1代植株在幼年時期因葉片黃化而死亡,這可能導致SSR標記出現(xiàn)偏分離的現(xiàn)象。

3.3 QTL在連鎖群上的分布特點

株高、分枝數(shù)、地徑等性狀是紫薇株型的重要指標。在相同環(huán)境條件下,紫薇金葉品種金幌與野生型品種堇秀在株高、地徑等性狀上存在顯著差異,其F1代群體中在不同個體之間同樣存在較大差異,這種非環(huán)境因素造成的差異必然存在分子水平的調(diào)控機制。因此,對株高、地徑等性狀進行QTL定位研究有利于了解其在分子水平的調(diào)控機制。

前人研究發(fā)現(xiàn),株高相關的QTL位點具有較高的環(huán)境穩(wěn)定性,來自父母本的等位基因均可能起到增效作用[39-41]。在本研究中,筆者鑒定了4個與株高相關的QTL位點,效應值為-9.99～1.49,其中qPH-1-1、qPH-29-4來自母本金幌,表型貢獻率分別為4.32%、29.82%,qPH-6-2、qPH-22-3來自父本堇秀,表型貢獻率分別為56.93%、55.61%。上述結果表明,紫薇中存在控制株高的主效QTL位點。

地徑相關的QTL定位研究主要集中在木本植物中,如在楊樹[42]、香榧[43]等木本植物中均檢測到與地徑相關的QTL位點。在本研究中,我們共檢測到2個與地徑相關的QTL位點,分別為qPD-1-1、qPD-22-2,分別位于LG1、LG22連鎖群上,加性效應值分別為-1.33、-1.72,均來自母本金幌,分別可解釋表型變異的4.32%、59.02%。上述結果說明,紫薇中存在控制地徑的主效QTL位點。

張福敏[42]檢測到2個與楊樹萌枝數(shù)相關的QTL,均位于父本銀白楊圖譜上,分別為NS-1、NS-2,均位于al-2連鎖群上,NS-1可解釋8.25%的表型變異,2個QTL共解釋了16.38%的表型變異。在本研究中,筆者檢測到1個紫薇分枝數(shù)QTL位點(qBN-22-1),位于LG22連鎖群上,加性效應值為2.32,來自母本金幌,可解釋表型變異的54.60%,較高的表型貢獻率表明該位點可能是控制分枝數(shù)的主效QTL位點。

3.4 紫薇中存在功能相關基因的緊密連鎖效應

在檢測數(shù)量性狀QTL的過程中,QTL在分布上有區(qū)域化趨勢,表現(xiàn)出一因多效或緊密連鎖效應[44]。Kenis等[45]發(fā)現(xiàn),與蘋果果實性狀相關的QTL集中在第10、16連鎖群上。這一現(xiàn)象在梨[46]、玉米[47]、水稻[48]和冰草[44]等植物上均有報道。上述證據(jù)表現(xiàn)出一因多效或緊密連鎖效應,也可以從遺傳上解釋不同性狀間存在的相關性,進一步說明具有相關功能的基因成簇分布。對紫薇分枝數(shù)、地徑與植株高度3個與生長相關的性狀進行QTL定位與分析發(fā)現(xiàn),3個性狀中檢測到的7個QTL位點集中分布在LG1、LG22和LG29等4個連鎖群上,在連鎖群LG1、LG22上均有4個QTL共分離或緊密連鎖的現(xiàn)象。其中,共分離或緊密連鎖的QTL數(shù)目最多的是LG22,均定位于標記位點NBJ157-145附近,說明控制同一性狀的QTL位點分布在相同連鎖群的不同或相鄰位置。上述結果表明,可能存在與株高、地徑和分枝數(shù)等性狀相關的關鍵基因。