孔晶晶，田珺劼，任玉鵬*，陳弟詩(shī)，包 昕

（1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

豬流行性腹瀉（PED）由冠狀病毒科Alpha 冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起，PEDV 對(duì)各日齡豬都具有易感性，對(duì)2 周齡內(nèi)仔豬的致死率可達(dá)100%［1］。PEDV 為單股正鏈RNA 病毒，全基因組序列大小約為28 kb，包含5′端帽子結(jié)構(gòu)，3′端poly（A）尾及7 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），共編碼纖突蛋白（S蛋白）、包膜蛋白（E蛋白）、膜蛋白（M蛋白）和核衣殼蛋白（N蛋白）等四種結(jié)構(gòu)蛋白，以及ORF1ab 復(fù)制酶多聚蛋白和ORF3蛋白等非結(jié)構(gòu)蛋白［2］。S蛋白是PEDV重要的毒力蛋白，它所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可將PEDV劃分為G1和G2兩個(gè)型，其中G2型包含G2a、G2b和G2c 亞型［3］，我國(guó)目前流行的毒株主要是G2a、G2b 亞型。監(jiān)測(cè)S 基因的遺傳變異對(duì)PED 的防控施策具有重要意義［4］。此外，PEDV的ORF3蛋白是唯一的非結(jié)構(gòu)輔助蛋白。在PEDV連續(xù)傳代弱化毒株中，ORF3 基因存在17 個(gè)連續(xù)氨基酸的穩(wěn)定缺失，可能與其毒力弱化有關(guān)［5］。E 蛋白主要調(diào)控病毒組裝、胞內(nèi)運(yùn)輸和病毒釋放等過(guò)程，還能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)產(chǎn)生應(yīng)激，并促使宿主細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-8（IL-8）、B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（Bcl-2），造成細(xì)胞損傷和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。M 蛋白位于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)與S 蛋白和N 蛋白相互作用在病毒核衣殼的組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)細(xì)胞增殖和病毒復(fù)制具有重要影響。N蛋白是一種高度保守的磷蛋白［7］，是PEDV核衣殼的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，在病毒復(fù)制、組裝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本研究對(duì)四川省雅安地區(qū)流行的一株P(guān)EDV SCYA2204的S基因、ORF3基因、E基因、M基因和N基因進(jìn)行基因克隆及測(cè)序，分析病毒基因核苷酸序列，并推導(dǎo)氨基酸序列的變異性及遺傳進(jìn)化特征，以期為PEDV 的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒。

1.2 臨床樣本來(lái)源與處理 臨床樣本于2022年4 月采自四川省雅安市某規(guī)?；i場(chǎng)，用無(wú)菌棉簽采集疑似PEDV 感染豬的肛門棉拭子，低溫保存于DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。將樣本用適量PBS 稀釋后反復(fù)凍融3 次，在高速冷凍離心機(jī)上以10 000 r/min 離心15 min，取上清液。樣本由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，確定為PEDV陽(yáng)性樣本，并凍存于-80 ℃冰箱。

1.3 引物設(shè)計(jì) PEDV S 基因、ORF3 基因和M 基因的引物均參照文獻(xiàn)［8-9］合成，其中對(duì)S基因采用分段重疊法，分4 段（S1、S2、S3、S4）進(jìn)行測(cè)序。E 基因、N 基因的引物以GenBank 中CV777、AJ1102毒株的基因組序列為參考，運(yùn)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)。所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

表1 PEDV擴(kuò)增引物信息

1.4 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄 使用Trizol 法提取上述樣品的總RNA。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，所得cDNA 于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因的PCR 擴(kuò)增 25 μL PCR 擴(kuò)增加樣體系：ddH2O 10.5μL，2×PCR MasterMix 12.5μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s，退火30 s（退火溫度參照表1設(shè)置），72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 基因的克隆及測(cè)序 根據(jù)Omega 生物技術(shù)公司膠回收試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行回收純化。參照pMDTM19-T Vector Cloning Kit說(shuō)明書進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐青霉素的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（100 μg/mL Amp LB）瓊脂上篩選陽(yáng)性克隆，送樣至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.7 基因序列的生物信息學(xué)分析 選取62株國(guó)內(nèi)外PEDV毒株，其中28株國(guó)外毒株，包括2株常用疫苗毒株AJ1102、CV777（GenBank登錄號(hào)分別為JX188454、AF353511）；34株國(guó)內(nèi)毒株，包括14株往年四川地區(qū)流行的毒株。用SeqMan 軟件對(duì)基因片段進(jìn)行拼接，將各基因序列在NCBI 中比對(duì)，在MegAlign軟件中用Clustal W法計(jì)算各基因的核苷酸同源性；用MEGA 11 軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；使用Alignment Report分析各基因的變異性及S基因推導(dǎo)的氨基酸的變異性；利用RDP4軟件中的7種不同程序方法對(duì)S基因序列的重組信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 PEDV 基因的克隆測(cè)序 對(duì)PEDV S 基因、ORF3基因、E基因、M基因和N基因進(jìn)行擴(kuò)增，獲得與預(yù)期大小相符的條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序，對(duì)S 基因重疊的區(qū)域進(jìn)行拼接，得到PEDV S 基因的總長(zhǎng)度為4 161 bp，ORF3 基因、E基因、M 基因和N 基因序列的長(zhǎng)度分別為675、231、681、1 326 bp。將此毒株命名為SCYA2204。

圖1 PEDV基因各片段的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.2 PEDV 基因的同源性分析 與參考毒株相比，SCYA2204 S基因的核苷酸同源性為92.5%～99.2%，其中與四川毒株CH/SCXH/2018的核苷酸同源性最高，為99.2%；與經(jīng)典疫苗株CV777 S基因的核苷酸同源性為93.2%，與AJ1102 S基因的核苷酸同源性為96.8%，而與四川近年流行毒株（SCDY/05/2020、SCDZ-1/2020、SCXH/2018、SCYB/2018、SC/CY/2022、SC2021 等）的同源性高達(dá)98.1%～99.2%。另外，ORF3 基因、E 基因、M基因和N 基因的核苷酸同源性分別為96.0%～100%、97.0%～100%、97.4%～99.7%、95.2%～99.9%。其中，SCYA2204 與美國(guó)地區(qū)IA1、NPLPEDV/2013和中國(guó)地區(qū)LYG等毒株ORF3基因的核苷酸同源性最高；與中國(guó)地區(qū)SC2021、CH/JXJA/2017 和國(guó)外地區(qū)IA1、ON-018 等毒株E 基因的核苷酸同源性最高，均為100%；與SC2021、HK2021 M基因的核苷酸同源性最高，為99.7%；與HN2021、SD2020、NH-TA2020 N 基因的核苷酸同源性最高達(dá)99.9%（表2）。

表2 PEDV SCYA2204株各基因同源性分析

2.2 PEDV基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析 由S基因構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖2）將所有PEDV分為G1、G2a和G2b 三個(gè)亞型，SCYA2204 與28 株P(guān)EDV 國(guó)內(nèi)外流行毒株同屬于G2b亞型。其中SCYA2204與四川往年流行毒株CH/SCYB-1/2018、CH/SCNJ-1/2020、CH/SCXH/2018、SWUN-C6-CH-SCYA-2019、SWUN-Y1-CH-SCCQ-2019 聚成一支，親緣關(guān)系密切，與SC2021的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。此外，常用疫苗株AJ1102 屬于G2b 亞型，CV777 和DR3 屬于G1a 亞型，與SCYA2204 的親緣關(guān)系都比較遠(yuǎn)。

圖2 S基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

由ORF3 基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3A）可見(jiàn)，SCYA2204 與CH/SXWS/2018、PEDV-LYG 的親緣關(guān)系較近，與四川往年流行毒株SC2021、CH/SCAZ10/2017 的親緣關(guān)系均相對(duì)較遠(yuǎn)。此外，由于CV777、AJ1102 和DR13 為弱毒疫苗株，其ORF3 基因均存在50 bp 堿基缺失，因此，三個(gè)毒株的ORF3基因序列與其他毒株的均不在同一分支。由E基因遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖3B）可見(jiàn)，河南毒株HN2021、山東毒株SDTA13-2020、四川毒株SC2021 等都與SCYA2204 的親緣關(guān)系極其密切。在M基因遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖3C）中，四川往年流行毒株SC2021、國(guó)內(nèi)流行毒株HK2021、江西流行毒株JX2020 與SCYA2204 聚成一支，親緣關(guān)系極其密切。在N基因遺傳進(jìn)化樹(shù)（圖3D）中，河南毒株HN2021、國(guó)內(nèi)毒株TRS2021與SCYA2204的親緣關(guān)系密切，三株山東毒株NH-TA2020、SD2020、SDTA13-2020 與SCYA2204 的親緣關(guān)系也較為密切，而四川往年流行毒株SC2021 與SCYA2204的親緣關(guān)系則相對(duì)較遠(yuǎn)。E基因、M基因和N 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均提示經(jīng)典疫苗株CV777、AJ1102與SCYA2204的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 ORF3、E、M、N基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析

2.3 PEDV S 蛋白的變異性分析 將SCYA2204毒株S 基因推導(dǎo)的氨基酸序列與常用疫苗毒株CV777、AJ1102 及四川往年流行毒株SC2021、SCDZ-1/2020、SCCY2022、CH/SCDY/05/2020作比較，共有10 處氨基酸（AA）突變，其中存在3 處連續(xù)AA 突變，分別為PC700/701LW、QA706/707HY、DDIV712/713/714/715HNTP。與CV777 相比，共有83處AA 突變，其中17 處為連續(xù)AA 突變：TP2/3KS、GSTI27/28/29/30SANT、SMNS55/56/57/58IGEN、GTGIE68/69/70/71/72AGQHP、DS86/87RG、DN130/131SI、VN148/149AD、LQD157/158/159HMS、KNI161/162/163EHS、KRS200/201/202SGG、EP229/230QL、DS246/247EP、PC700/701LW、QA706/707HY、DDIV712/713/714/715HNTP、GD1177/1178DE、TY1197/1198NH；在59～63 位存在4 個(gè)氨基酸插入（QGVN），在134位存在一個(gè)氨基酸插入（N），160位存在一個(gè)氨基酸的缺失（G）。與AJ1102 株比較，共有34 處AA 突變，其中3 處為連續(xù)突變：PC696/697LW、QA702/703HY、DDIV708/709/710/711HNTP，30處為點(diǎn)突變，1處在1 198位插入（H）。

S 基因編碼的S 蛋白能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。研究顯示［10］，S 蛋白含有的抗原中和表位包括COE（499～638 AA）、SS2（748～755 AA）、SS6（764～771 AA）、2C10（1 368～1 374 AA）。與CV777 比較（圖4），SCYA2204 的中和表位共有7處AA 突變：A521S、F540L、T553S、G598S、Q637E、L768S、D770S，其中COE 區(qū)有5處突變：A521S、F540L、T553S、G598S、Q637E，SS6區(qū)有2 處突變：L768S、D770S。與AJ1102比較，SCYA2204 的中和表位共有3 處AA 突變：T500I、A521S、F540L，其中COE區(qū)A521S、F540L兩處突變?yōu)镾CYA2204 與AJ1102、CV777 共有的AA 突變。SCYA2204的SS 區(qū) 與CV777 和AJ1102 比 較，均無(wú)突變。

圖4 S蛋白中和表位的比對(duì)分析

2.4 PEDV S 基因的重組分析 運(yùn)用RDP4軟件中的7個(gè)不同程序方法（RDP、MaxChi、GENECONV、BootScan、Chimaera、SiScan 和3Seq）對(duì)S 基因序列的重組信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SCYA2204與41株參考毒株的S基因之間存在1個(gè)潛在重組事件，7種重組檢測(cè)方法中有6種皆呈陽(yáng)性，發(fā)生概率較高。主要親本為G2b亞型的CH/SCXH/2018，次要親本基于G1 亞型的LZC株推導(dǎo)，重組區(qū)域在S基因的2108～2237 bp。

3 討論

目前PEDV 仍廣泛流行于全國(guó)各地。Zhang Hao 等［11］對(duì)2011～2021 年華中、華南和華東地區(qū)共計(jì)149 869 例腹瀉豬組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明PEDV 仍然是過(guò)去11 年引起國(guó)內(nèi)豬腹瀉病的最主要病原，流行率為61.8%。雖然當(dāng)前幾種商品化的弱毒疫苗和滅活疫苗已被廣泛用于PED 的防控，但由于PEDV 基因組的高度變異性導(dǎo)致其基因亞型不斷增加，基因重組事件頻發(fā)，造成毒株間的交叉保護(hù)效果差，如：研究已證實(shí)基于G1 型毒株研制的疫苗（CV777）已無(wú)法對(duì)G2a和G2b 亞型的PEDV提供良好的保護(hù)［12］；且不同G2 亞型毒株間的交叉保護(hù)效果也有差異［13］。據(jù)調(diào)查顯示，PEDV 在國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型有較大差異［14］；同時(shí)，當(dāng)前四川地區(qū)流行的PEDV 毒株的變異性和基因多樣性在不斷增加。本次四川雅安地區(qū)流行的SCYA2204株屬于G2b 亞型，其S 基因發(fā)生了較大的變異。與CV777 比較，SCYA2204 有17 處連續(xù)AA 突變，且SCYA2204 株S 蛋白存在3 處獨(dú)特的連續(xù)AA 突變，與國(guó)內(nèi)近幾年流行毒株（SC2021、SCDZ-1/2020、SCCY2022、CH/SCDY/05/2020 等）的S 蛋白氨基酸序列有明顯差異。研究表明，PEDV S 基因包括多個(gè)病毒主要的中和表位和受體結(jié)合域，它們與病毒的抗原性和吸附入侵密切相關(guān)［10］，在病毒—宿主細(xì)胞膜融合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用［15］，其融合活性也決定了病毒的組織嗜性和細(xì)胞感染能力。本研究中，將SCYA2204 株與CV777株的4個(gè)當(dāng)前已鑒定的S蛋白中和表位比較，SCYA2204 株中和表位共有7 處AA 突變；與AJ1102 比較，SCYA2204 株的中和表位有3 處AA突變。其中，COE區(qū)的A521S、F540L兩處突變?yōu)镾CYA2204 與AJ1102、CV777 共有的AA 突變。SCYA2204 株的氨基酸變化，尤其是中和表位區(qū)內(nèi)的變異，可能導(dǎo)致其抗原性發(fā)生改變，影響傳統(tǒng)疫苗株的保護(hù)效力。

本研究分析了SCYA2204 S、ORF3、E、M、N基因的核苷酸同源性和遺傳進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)SCYA2204株與四川往年流行毒株（如CH/SCYB-1/2018、CH/SCNJ-1/2020、CH/SCXH/2018、SCDY/05/2020、SC2021）的親緣關(guān)系密切，而與常用疫苗株AJ1102 和經(jīng)典毒株CV777 的親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)；E基因、M基因和N基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均提示經(jīng)典疫苗株CV777、AJ1102 與SCYA2204 的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。進(jìn)一步說(shuō)明基于傳統(tǒng)毒株的疫苗對(duì)于現(xiàn)在四川流行毒株的保護(hù)效力可能會(huì)有所下降。已有研究發(fā)現(xiàn)PEDV S 基因易發(fā)生重組事件，重組可能使高毒力PEDV 毒株在豬群中持續(xù)存在和傳播［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)PEDV SCYA2204與25株參考毒株的S基因之間存在1個(gè)潛在重組事件，6 種重組檢測(cè)方法皆呈陽(yáng)性，說(shuō)明PEDV 各毒株間發(fā)生重組現(xiàn)象的概率較高。

據(jù)調(diào)查，本次PED 發(fā)病豬場(chǎng)已免疫G2b亞型疫苗，但未能較好地交叉保護(hù)引發(fā)本次疫情的SCYA2204 毒株（G2b 亞型）。提示未來(lái)還需進(jìn)一步篩選新型有效的PEDV 候選疫苗毒株，這對(duì)有效防控PED疫情具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究獲得了PEDV SCYA2204 株的S、ORF3、E、M 基因和N 基因的核苷酸序列，并進(jìn)行了變異分析和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果得出：SCYA2204的S 基因與經(jīng)典株CV777 的核苷酸同源性為93.2%，與AJ1102毒株的核苷酸同源性為96.8%，而與四川近年流行毒株的同源性高達(dá)98.1%～99.2%。這與本研究所檢測(cè)的PEDV 毒株S 基因的核苷酸同源性與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致。與SCYA2204 株ORF3、E、M、N 基因的核苷酸同源性最高的毒株大部分來(lái)自不同地區(qū)，僅有少數(shù)來(lái)自四川地區(qū)。PEDV 毒株分為G1和G2兩個(gè)型，G1 又可以進(jìn)一步分為2 個(gè)亞型，即G1a、G1b，本試驗(yàn)毒株SCYA2204經(jīng)基因序列比對(duì)與進(jìn)化樹(shù)分析,被劃分為G2b 亞型。和常用疫苗毒株AJ1102 相比，SCYA2204 株的S 基因具有34 個(gè)氨基酸位點(diǎn)變化，且發(fā)生了重組事件。