劉芬菊

蘇州大學蘇州醫(yī)學院放射醫(yī)學與防護學院，放射醫(yī)學與輻射防護國家重點實驗室，蘇州 215123

氚標記化合物在醫(yī)學領域中被廣泛應用，如3H 標記的胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine,3H-TdR）在淋巴細胞輻射效應中生物大分子損傷的早期研究[1]、H3標記的生物大分子用于研究物質(zhì)在體內(nèi)的代謝、擴散、交換等。此外，氚還被用于標記放射性化合物，追蹤某些生物分子的行蹤和代謝，以及新藥的藥物代謝與藥物動力學的研究[2]。通過上述方法能獲取藥物在生物體內(nèi)的代謝動力學參數(shù)，測量生物吸收利用度、器官與組織分布，計算排泄的速度與途徑等數(shù)據(jù)資料，因此氚在新藥研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用。應用氚標記方法還可以檢測機體免疫功能，觀察輻射后的生物效應和藥物治療后的療效等[3-4]。

1 氚標記化合物的合成方法

1.1 氚標記化合物的化學合成法

氚標記化合物的化學合成法包括直接化學合成法和生物化學合成法。直接化學合成法是以氚氣、氚水或金屬氚化物為原料，通過催化還原、氚-鹵取代等反應來制備氚標記化合物。其優(yōu)點是可以制取定位的和近于無載體的氚標記化合物，反應副產(chǎn)物少，產(chǎn)品易于純化；其缺點是有時化學合成步驟多，產(chǎn)品的化學和放射化學回收率低，難以制備多種復雜的天然產(chǎn)物和生物聚合物的氚標記化合物，在分子重排和同質(zhì)異構(gòu)現(xiàn)象中容易出現(xiàn)氚標記的轉(zhuǎn)移。而生物化學合成法是以氚標記有機化合物或含氚無機化合物為作用物，利用特異酶反應和非特異反應來制備所需的氚標記化合物[5]。由于其他氚標記方法如非合成法能比較容易地獲得所需的氚標記化合物，所以生物化學合成法對于制備氚標記化合物來說，不如制備其他標記化合物的應用廣泛。

1.2 氚標記分子化合物

氚標記分子合成法是生物活性化合物結(jié)合和代謝特性的重要工具，特別是在藥物研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用[6]。用T2氣體直接氚化惰性C-H 鍵是一種理想的氚標記方法，但在標記新藥化合物時，對具有不同官能團的結(jié)構(gòu)復雜分子的直接氚化仍有很大的差距。特別是鈀（Ⅱ）C-H 活化化學在T2氣體氚化反應中的應用。與現(xiàn)有的氚化方法相比，這種氚化反應實際的轉(zhuǎn)化顯示出新的底物范圍和更大的官能團耐受性，并且已被應用于直接氚化多種復雜藥物和未受保護的二肽。因此分離的氚標記產(chǎn)物的比活性大，超過了應用于分子相互作用和代謝研究的特殊要求。氚標記的化合物合成包括以下5 類：芳烴、雜環(huán)、類固醇、手性化合物、多肽/蛋白質(zhì)。上述化合物均可以通過氚標記氨基酸來實現(xiàn)，也可通過寡核苷酸、抗體藥物共軛物及其連接物的合成等，或者通過共價鍵結(jié)合的方法，用氚標記生物大分子。同時，Pony 等[2]報道了一種鐵催化的藥物分子氚標記方法，通過該方法研發(fā)出全新的藥物分子修飾技術，該修飾技術已經(jīng)用于抗癌藥物的研發(fā)和評估。

2 氚標記化合物的應用

2.1 氚的DNA 合成代謝作用

2.1.1 氚摻入的DNA 分子生物效應

（1） DNA 合成的原理

DNA 合成是細胞分裂的物質(zhì)基礎，正常DNA 的合成有2 條途徑：一是主要途徑，即由糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成；二是輔助途徑，即在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的存在下，經(jīng)次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。在電離輻射作用下，DNA 合成途徑受到影響。在體外實驗研究中，將3H-Urd 注入到細胞培養(yǎng)液中，經(jīng)過24 h 測量3H-TdR 摻入DNA 分子的量，從而了解其代謝產(chǎn)物的改變。氚標記化合物廣泛應用于新藥的藥物代謝與藥物動力學研究，其能提供藥物在生物體內(nèi)的物料平衡、生物吸收利用度、器官與組織分布、排泄的速度與途徑等數(shù)據(jù)資料，在新藥研發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。

除此之外，使用3H-TdR、3H-尿氨酸（3H-Urd）、3H-亮氨酸（3H-Leu）作為培養(yǎng)動物細胞生物合成的前體物質(zhì)，不同劑量照射后經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，檢測其摻入到生物大分子的每分鐘放射性計數(shù)，從而得出生物大分子合成的百分率，該實驗的結(jié)果表明生物大分子合成隨照射劑量的增加而逐漸降低[9]。進一步DNA 摻入實驗結(jié)果表明，電離輻射及異三尖杉酯堿對生物大分子的合成具有明顯地抑制作用[5]。

（2） DNA 損傷與修復

電離輻射可以導致細胞DNA 分子損傷，其損傷包括DNA 鏈的斷裂、堿基的損傷、氫鍵的斷裂等。損傷后的DNA 在一定條件下會得到修復。蘇燎原研究團隊應用3HTdR 摻入方法，將外周血淋巴細胞輻照后置于 37 ℃培養(yǎng)箱中保溫 30 min，測量發(fā)現(xiàn)DNA 雙鏈斷裂比例上升，說明經(jīng)過保溫后可重接 DNA 單鏈斷裂，在保溫 30 min 時 DNA 修復達到高峰[1,3-4,8-10]。這一研究結(jié)果表明，細胞受照后在一定條件下DNA 單鏈斷裂可得到大部分修復。DNA 損傷修復包括光復合修復、酶的修復等。其修復程度取決于細胞輻射效應的大小，反映出不同細胞的敏感性的差異，因此不同細胞修復能力的差異會增加對輻射的耐受性。在DNA 損傷修復的實驗中研究者還發(fā)現(xiàn)，在淋巴細胞受照射后40 min DNA 單鏈斷裂大部分已經(jīng)重接[10]。

2.1.2 氚標記化合物用于DNA 合成的測定

DNA 合成是一個生命體進化和繁殖的重要過程，是細胞分裂、遺傳的物質(zhì)基礎。RNA 是在DNA 的模板基礎上合成的，其又決定了蛋白質(zhì)的合成，因此細胞內(nèi)3 種大分子的合成代謝相互聯(lián)系、相互制約[11]。在新藥研發(fā)、職業(yè)因素、電離輻射等環(huán)境因素的作用下，均會對細胞的生長分裂產(chǎn)生影響。首先影響的是細胞DNA 的合成能力下降，嚴重者甚至導致細胞死亡。所謂DNA 合成抑制，是在DNA合成過程中受到阻滯，造成DNA 合成能力的下降。所以，一旦DNA 無法合成新的鏈，只能停留在G1 期，當原來的G2 期細胞分裂完成后，也不能及時合成新的DNA 分子。因此，通過氚標記化合物的檢測方法可判斷各種因素作用下引起的DNA 合成能力的改變。早在20 世紀60 年代初，原蘇州醫(yī)學院放射生物學科研人員就應用同位素標記生物大分子的實驗技術研究了各種因素對細胞DNA 合成的抑制作用，如電離輻射對淋巴細胞各亞群DNA 合成的抑制，不同劑量照射后可降低細胞DNA 的合成能力等[9]。

2.2 氚標記化合物在蛋白質(zhì)標記中的作用

在生命科學及生物學研究領域中，氚標記化合物是必不可少的研究工具。其不僅可以應用于酶的功能、作用機制和分析等，還可用于細胞學、分子生物學、受體結(jié)合及氚標記甘氨酸等的研究中，也可在不同時期檢測放射性核素的位置及蛋白質(zhì)合成的過程。通過氚標記化合物，可觀察到蛋白質(zhì)合成在細胞質(zhì)中的完成情況，早期的研究測量氚標記的亮氨酸（3H-Leu），可以追蹤蛋白分子的分布、反應和代謝過程，亦可分析得到其在核糖體中形成多肽鏈的量[12]，從而解釋生物系統(tǒng)中亮氨酸的行為和功能。

氚標記化合物是用放射性核素氚取代化合物中穩(wěn)定同位素氫，在蛋白質(zhì)標記中，用N-琥珀酰亞胺[2-3]、3H 丙酸酯標記 IgG、過氧化氫酶和乙酰膽堿酯酶獲得[13]。該方法簡單、方便、易于操作，反應條件溫和，可廣泛用于標記蛋白質(zhì)、多肽及其他含有游離氨基分子的研究中。除此之外，氚標記甘氨酸還用于蠶體蛋白質(zhì)摻入實驗的研究，結(jié)果顯示蠶體蛋白質(zhì)的氨基酸組成中甘氨酸含量較高，約占15%，這表明應用放射性同位素氚標記甘氨酸摻入法對揭示家蠶蠶體蛋白質(zhì)的生理生化機制具有重要的作用。

2.3 氚標記化合物在放射生物學基礎研究中的應用

氚標記化合物在放射生物學領域中應用廣泛。其主要原因是由于氚標記化合物合成的成本相對較低，且更容易獲得[14]，因此其可以為反應性代謝物的形成提供早期評估的重要工具，而反應性代謝物的形成被認為與特殊的藥物不良反應有關，在放射生物學領域的研究中具有重要的實際應用價值。在細胞學、分子生物學、放射免疫學、藥物代謝動力學、新藥的篩選及腫瘤的診斷和治療學的研究中，氚標記化合物是不可缺少的應用工具[15-16]。除此之外，3H-雌二醇-17β-葡萄糖醛酸還可用于有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白OATP1B1 介導的轉(zhuǎn)運[17]。另外，生活在相同環(huán)境中的群體，其各種疾病的發(fā)病率差異很大，說明一個人的遺傳背景及對癌的易感性各異，而易感性本身又與DNA 修復有著密切的關系，DNA 及其序列的完整性在生命全過程中起著十分重要的作用，任何損傷DNA 的物質(zhì)都具有潛在致癌和致基因突變的危險，無論何種原因引起的DNA 損傷，都可以通過酶系統(tǒng)的作用進行非順序合成。氚標記化合物的方法可以評價DNA 和RNA 合成能力等。由此可見，DNA 修復能力高低可有效地反映個體的免疫功能，以及是否處于疾病易感狀態(tài)。

Loh 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，一種光氧自由基介導的氫原子轉(zhuǎn)移方法，可以有效選擇性利用同位素標記的水作為氫同位素的來源，將氘和氚采用一步法摻入至α-氨基sp3 碳氫鍵上。多種藥物分子中氘和氚的高摻入，可滿足配體結(jié)合分析、吸收、分布、代謝和排泄研究的要求，有益于藥物的篩選。

由于氚發(fā)射的β 粒子在水介質(zhì)中傳播距離＜8 μm，是有限距離傳播，只有結(jié)合的放射性配體足夠靠近才會激活閃爍劑，而引起光發(fā)射，因此無需分離即可直接進行測量。單光子吸收法（SPA）是高通量抑制劑的篩選重要工具，并且已成功用于不同轉(zhuǎn)運蛋白的功能表征的分析，如對于L-[3H]精氨酸或D-[3H]葡萄糖與固定在氟微球（包含閃爍劑）上的受體蛋白結(jié)合進行測定[19]等。

除此之外，在氚標記化合物的研究中，還可通過氫同位素交換氚標記藥物的鐵催化方法。將鐵催化劑的位置選擇性地與目前使用的銥催化劑相互交換，并且允許對藥物分子中的互補位置進行同位素標記，為藥物研發(fā)提供了一種新的評價工具[2]。氚標記的分子也可用于闡明生物活性化合物結(jié)合和代謝的特性，在新藥的研發(fā)過程中可以發(fā)揮重要作用[20]。

3 小結(jié)與展望

早在20 世紀60 年代初，氚標記化合物的方法就用于淋巴細胞輻射生物效應及藥效學的研究領域，放射性核素標記TdR 的方法常用于研究細胞及動物整體照射后細胞周期和DNA 合成能力改變的實驗研究，氚標記在體外細胞、分子及蛋白質(zhì)水平的研究中發(fā)揮著重要作用。臨床腫瘤患者放療前后免疫功能的恢復驗證也應用氚標記技術[3-4]。隨著生命科學技術的進步和生物工程的發(fā)展，氚標記核酸的制備有助于研究其在動物體內(nèi)的吸收、分布、代謝以及排泄的機制，為新藥的研制提供藥理及藥代動力學參數(shù)[21-22]。

目前，氚標記化合物3H-TdR 摻入實驗已廣泛用于多種生物DNA 合成能力的測定，判斷生物體損傷程度及細胞的增殖能力、自然殺傷細胞（NK）活性和轉(zhuǎn)化程度的變化[23-24]。根據(jù)細胞的放射性活度測出標記化合物的摻入率，該摻入方法對于研究活細胞內(nèi)DNA、RNA 和蛋白質(zhì)代謝的動態(tài)過程具有簡便、迅速、直觀、準確等優(yōu)點，可以免除對DNA、RNA、蛋白質(zhì)分離提純及定量測定等復雜過程。未來氚標記化合物在醫(yī)學及放射生物學領域的應用會更加廣泛，亦為氚的醫(yī)學防護提供重要的理論基礎及實驗依據(jù)。