陳群力 姚 申 吳 飛

（1.上海健康醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，上海 201318；2.上海三林社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心全科門(mén)診部，上海 200124；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥現(xiàn)代制劑技術(shù)教育部工程研究中心，上海 201203）

大黃靈脾顆粒劑是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院的院內(nèi)制劑，處方由大黃、丹參、淫羊藿等多味中藥組成，具有溫陽(yáng)活血、瀉濁解毒的作用，主要用于慢性腎功能衰竭的治療，長(zhǎng)期臨床應(yīng)用證實(shí)其效果顯著，能明顯延緩腎衰的發(fā)展［1-3］，但是現(xiàn)行的定性和定量質(zhì)量控制較為簡(jiǎn)單［4］。為了提高產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平，確保其臨床療效，本研究建立制劑中君藥淫羊藿的指標(biāo)性成分淫羊藿苷和臣藥丹參的指標(biāo)性成分丹酚酸B含量的高效液相色譜分析法（HPLC），為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和修訂提供依據(jù)［5］。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀，含四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器和Agilent ChemStation色譜工作站（美國(guó)安捷倫公司）；MS105DU 型分析天平（0.01 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；FA2104N 型分析天平（0.1 mg，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；SK5200H 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；TGL-18C 型高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Milli-Q型超純水制備儀［密理博（中國(guó)）有限公司］。

1.2 試藥 淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)：110737-200415，中國(guó)食品藥品檢定研究院），丹酚酸B 對(duì)照品（批號(hào)：11562-201110，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；大黃靈脾顆粒3 批（批號(hào)：120416、120522 和130829，均為上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院提供）；磷酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈［色譜純，默克化工技術(shù)（上海）有限公司］；水（自制超純水）。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 Apollo C18（4.6 mm×250.0 mm，5.0 μm）色譜柱；流動(dòng)相乙腈-水（28∶72），流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm。

2.1.2 對(duì)照品溶液配制 取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成0.3836 mg/mL 的對(duì)照品溶液母液。精密吸取對(duì)照品溶液母液適量，加入甲醇稀釋?zhuān)瞥蓾舛葹?8.36 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 取大黃靈脾顆粒約2.0 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中；精密加入50%的乙醇25.0 mL，超聲處理30 min；放冷，再次稱(chēng)定重量；用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 陰性樣品的制備 按照處方和工藝制備缺淫羊藿的陰性樣品［4］。精密移取2.0 g 陰性樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，即得。

2.1.5 HPLC測(cè)定結(jié)果

2.1.5.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 在上述處理方法和液相條件下，分別對(duì)淫羊藿苷對(duì)照品、大黃靈脾顆粒、大黃靈脾顆粒陰性樣品進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，淫羊藿苷出峰時(shí)間在15.8 min 左右，樣品中淫羊藿苷與雜質(zhì)分離良好，陰性樣品中相應(yīng)峰位處無(wú)雜質(zhì)干擾測(cè)定，表明本分析方法特異性好、靈敏度高。見(jiàn)圖1。

圖1 淫羊藿苷測(cè)定的高效液相色譜圖

2.1.5.2 線性關(guān)系考查 取濃度為38.36 μg/mL 的淫羊藿苷對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1.0、2.0、5.0、10.0 μL；取濃度為0.3836 mg/mL 的淫羊藿苷對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣2.0、5.0、10.0、20.0 μL，以峰面積對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量（μg）進(jìn)行線性回歸計(jì)算。

線性方程為：Y=1271X+31.68，r=0.9998。結(jié)果表明，進(jìn)樣質(zhì)量在0.038～7.672 μg 范圍內(nèi)，淫羊藿苷的峰面積與進(jìn)樣質(zhì)量呈良好的線性相關(guān)。

2.1.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為38.36 μg/mL 的淫羊藿苷對(duì)照品溶液10.0 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD 值（RSD=0.5%）。結(jié)果表明，儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取大黃靈脾顆粒，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法平行處理6 份，進(jìn)樣分析并記錄結(jié)果，計(jì)算峰面積得RSD 值（RSD=0.7%）。結(jié)果顯示，樣品測(cè)定重復(fù)性良好，顆粒中淫羊藿苷的平均含量為0.4810 mg/g。

2.1.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大黃靈脾顆粒，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理，分別于0、2、4、6、8、10 和12 h 進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積的RSD 值（RSD=0.8%）。結(jié)果顯示，在12 h內(nèi)供試品穩(wěn)定性良好。

2.1.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已測(cè)定淫羊藿苷含量的大黃靈脾顆粒供試品1.0 g（淫羊藿苷含量為0.4810 mg/g）9份，置錐形瓶中，按低、中、高3個(gè)濃度組分別精密加入淫羊藿苷對(duì)照品溶液（38.36 μg/mL）0.90、1.20 和1.50 mL，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法處理并分析測(cè)定。結(jié)果表明，此測(cè)定方法中淫羊藿苷的平均回收率為98.5%，符合要求。見(jiàn)表1。

表1 淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5.7 樣品測(cè)定 取3 個(gè)批次的大黃靈脾顆粒（批號(hào)：120416、120522 和130829），按照“2.1.3”項(xiàng)的方法處理并分析測(cè)定。結(jié)果表明，3 個(gè)批次的樣品中，淫羊藿苷含量分別為0.4493、0.6104和0.4821 mg/g。

2.2 丹酚酸B含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相乙腈-1.7%磷酸溶液（23∶77），流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm，進(jìn)樣量10.0 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取丹酚酸B 對(duì)照品適量，加75%甲醇溶液，制得濃度為1.374 mg/mL 丹酚酸B的對(duì)照品溶液母液；以75%甲醇稀釋?zhuān)频脻舛葹?3.74 μg/mL丹酚酸B的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)；精密稱(chēng)定約2.0 g，置具塞錐形瓶中；精密加入25.0 mL 稀乙醇，稱(chēng)重，密封，超聲處理30 min；冷卻后補(bǔ)足失重，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品的制備 按照工藝［4］實(shí)驗(yàn)室制備缺丹參的陰性樣品。取陰性樣品適量，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，制得大黃靈脾顆粒陰性樣品。

2.2.5 HPLC測(cè)定結(jié)果

2.2.5.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別精密移取大黃靈脾顆粒供試品、大黃靈脾顆粒陰性樣品和丹酚酸B 對(duì)照品10.0 μL，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，丹酚酸B 出峰時(shí)間在18.0 min 左右，樣品中丹酚酸B 與雜質(zhì)分離良好，陰性樣品中相應(yīng)峰位處無(wú)雜質(zhì)干擾測(cè)定，表明本分析方法特異性好、靈敏度高。見(jiàn)圖2。

圖2 丹酚酸B含量測(cè)定的高效液相色譜圖

2.2.5.2 線性關(guān)系的考查 精密稱(chēng)取丹酚酸B 對(duì)照品適量，制成濃度為0.1374 mg/mL 對(duì)照品溶液a 和濃度0.2108 mg/mL 對(duì)照品溶液b；精密吸取對(duì)照品溶液a 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL 和對(duì)照品溶液b 10.0、15.0、20.0 μL，分別注入色譜儀，記錄峰面積；以峰面積對(duì)進(jìn)樣質(zhì)量（μg）進(jìn)行線性回歸計(jì)算。

線性方程：Y=605.17X+3.9361，r=0.9999。結(jié)果表明，丹酚酸B 進(jìn)樣質(zhì)量在0.275～4.216 μg 范圍內(nèi)，峰面積與丹酚酸B進(jìn)樣質(zhì)量呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為13.74 μg/mL 的丹酚酸B 對(duì)照品溶液10.0 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD 值。結(jié)果表明，丹酚酸B 峰面積RSD為0.4%，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取大黃靈脾顆粒（批號(hào)130829），按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，重復(fù)測(cè)定6 份；計(jì)算樣品中平均濃度為0.8917 mg/g，RSD 為1.9%。結(jié)果表明樣品測(cè)定重復(fù)性良好。

2.2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大黃靈脾顆粒（批號(hào)130829），按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，于0、2、4、6、8 和12 h 進(jìn)樣測(cè)定，RSD 為1.3%。結(jié)果表明，在12 h 內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已測(cè)定丹酚酸B 含量的供試品約1.0 g（批號(hào)130829，丹酚酸B 含量0.8918 mg/g）9 份，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入丹酚酸B 對(duì)照品溶液（1.758 mg/mL）適量（低濃度0.4 mL、中濃度0.5 mL和高濃度0.6 mL），按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定。結(jié)果表明，此方法丹酚酸B 的平均回收率為97.7%，符合要求。見(jiàn)表2。

表2 丹酚酸B加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.5.7 樣品測(cè)定 取大黃靈脾顆粒3 批（批號(hào)：120416，120522 和130829），按照“2.2.1”項(xiàng)下方法處理并分析測(cè)定丹酚酸B 的含量。結(jié)果表明，3 個(gè)批次的樣品中，丹酚酸B 的含量分別為0.8611、0.8883 和0.8918 mg/g。

3 討論

以前，院內(nèi)制劑的良好療效主要依靠?jī)?yōu)質(zhì)的藥材飲片；近年來(lái)，隨著醫(yī)藥市場(chǎng)需求劇增、藥材種植規(guī)模不斷擴(kuò)大，大部分藥材質(zhì)量下降較快［6］，而院內(nèi)制劑對(duì)藥材檢查的質(zhì)控環(huán)節(jié)比較薄弱。所以，為保證院內(nèi)制劑的臨床療效，提升其質(zhì)量控制勢(shì)在必行。本研究首次針對(duì)院內(nèi)制劑大黃靈脾顆粒建立淫羊藿苷和丹酚酸B 的含量測(cè)定方法，從而保證制劑的臨床療效。

淫羊藿為方中君藥，選擇淫羊藿苷作為大黃靈脾顆粒的質(zhì)量控制指標(biāo)是合理的。淫羊藿在中藥復(fù)方制劑中被廣泛使用，并建立了相應(yīng)的含量測(cè)定方法［7-12］。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考查了淫羊藿苷的檢測(cè)方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，本方法的線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率均能滿足定量測(cè)定的要求。有研究［13］表明，不同植物來(lái)源、不同產(chǎn)地的丹參中，丹酚酸B 含量有較大差異。中藥制劑中，丹酚酸B 的含量測(cè)定方法也已有較多報(bào)道［14-21］；但是由于大黃靈脾顆粒的處方組成藥味較多、化學(xué)組分復(fù)雜，故雜質(zhì)易干擾目標(biāo)成分的準(zhǔn)確定量測(cè)定。采用乙腈-1.7%磷酸溶液（23∶77）為流動(dòng)相，可以取得較好效果。在該色譜條件下，色譜分離度好，峰對(duì)稱(chēng)性好，陰性無(wú)干擾。與《中華人民共和國(guó)藥典》收載的甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59）三元混合流動(dòng)相相比，本方法對(duì)儀器的要求較低，具有一定的實(shí)用價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的淫羊藿苷和丹酚酸B 的含量測(cè)定方法，可用于大黃靈脾顆粒的質(zhì)量控制，對(duì)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)制劑的臨床再評(píng)價(jià)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高具有重要意義。